Physiologische und molekulare Charakterisierung 
der Beziehung zwischen Piriformospora indica 
und rop-Mutanten von Arabidopsis thaliana 



D i s s e r t a t i o n 
zur Erlangung des akademischen Grades 


doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) 

vorgelegt dem Rat der Biologisch-Pharmazeutischen Fakultät 
der Friedrich-Schiller-Universität Jena 


von Dipl.-Biol. Yvonne Venus 
geboren am 20. Mai 1974 in Weimar 


Jena 
Juni 2010 



Gutachter: 

1. Prof. Dr. Ralf Oelmüller (FSU Jena) 
2. Prof. Dr. Erika Kothe (FSU Jena) 
3. Prof. Dr. Jutta Ludwig-Müller (TU Dresden) 
Tag der öffentlichen Disputation: 27.09.2010 


Inhaltsverzeichnis 

Inhaltsverzeichnis 

Abkürzungsverzeichnis VII 

1 Einleitung 1 

1. 1 Guaninnukleotid-bindende Proteine 1 

1. 1. 1 Heterotrimere G-Proteine 1 

1. 1. 2 Kleine G-Proteine 1 

1. 2 Klassifizierung der kleinen G-Proteine von Arabidopsis thaliana 3 

1. 3 Die kleinen G-Proteine der ROP-Familie 3 

1. 4 ROP-regulierte Signalwege 3 

1. 5 ROP-interagierende Proteine 6 

1. 5. 1 ROP-GEFs: Guaninnukleotid-Austauschfaktoren 6 

1. 5. 2 ROP-GAPs: GTPase-aktivierende Proteine 7 

1. 5. 3 ROP-GDIs: Guaninnukleotid-Dissoziationsinhibitoren 8 

1. 5. 4 RIC-Proteine (Rop-interactive CRIB motif-containing proteins) 8 

1. 6 Differentielle Expression der rop-mRNAs 10 

1. 7 Die Funktionen von ROP1 und ROP6 10 

1. 8 Das Aktinzytoskelett und die Regulation der Aktin-Dynamik 12 

1. 8. 1 Aktin-bindende Proteine 12 

1. 8. 2 Aktin-bündelnde Proteine 13 

1. 8. 3 Funktion und Regulation des ARP2/3-Komplexes 16 

1. 9 Die Symbiose als Lebensgemeinschaft 17 

1. 9. 1 Piriformospora indica 20 

1. 9. 2 Molekulare Mechanismen der Interaktion von Arabidopsis mit P. indica 21 

1. 10 Zielsetzung 22 

2 Material und Methoden 24 

2. 1 Materialien 24 

2. 1. 1 Geräte 24 

2. 1. 2 Chemikalien 25 

2 .1. 3 Enzyme 25 

2. 1. 4 Kits und Fertigreagenzien 25 

2. 1. 5 Molekulare Marker 26 

2. 1. 6 Nukleotide und Oligonukleotide 26 

2. 1. 7 Bakterienstämme, Vektoren und Klone 28 

2. 1. 8 Standardmedien und Lösungen 28 


Inhaltsverzeichnis 

2. 1. 9 Pflanzenmaterial 
29 

2. 2 Methoden 
30 

2. 2. 1. Kultivierung und Transformation von Bakterien 
30 

2. 2. 1. 1 Kultivierung und Transformation von E. coli 
30 

2. 2. 1. 2 Kultivierung von Agrobacterium tumefaciens 
30 

2. 2. 1. 3 Herstellung kompetenter A. tumefaciens GV3101/pMP90-Zellen 
30 

2. 2. 1. 4 Transformation kompetenter A. tumefaciens GV3101/pMP90-Zellen 31 

2. 2. 2 Kultivierung von Arabidopsis 
31 

2. 2. 3 Kultivierung von P. indica 
31 

2. 2. 4 Interaktionsexperimente von Arabidopsis mit P. indica 
32 

2. 2. 5 Isolation von Nukleinsäuren 
32 

2. 2. 5. 1 Isolation von DNA aus Arabidopsis 
32 

2. 2. 5. 2 Isolation von Plasmid-DNA aus E. coli 
33 

2. 2. 5. 3 Isolation von Plasmid-DNA aus A. tumefaciens 
33 

2. 2. 5. 4 Isolation von RNA aus Pflanzen 
33 

2. 2. 5. 5 Synthese von cDNA für RT-PCR und real-time PCR 
34 

2. 2. 5. 6 RT-PCR 
34 

2. 2. 5. 7 Amplifikation von DNA mit PCR 
34 

2. 2. 5. 8 Trennung und Dokumentation von DNA-Fragmenten auf dem Agarosegel 34 

2. 2. 5. 9 real-time PCR 
35 

2. 2. 6 Analyse der T-DNA-Insertionsmutanten 
36 

2. 2. 7 DNA-Sequenzierung nach Sanger et al. (1977) 
36 

2. 2. 8 Herstellung der Doppelmutante rop1rop6 
37 

2. 2. 8. 1 Herstellung der Arabidopsis-GFP-FABD2 rop1-, rop6-und rop1rop6-Linien 37 

2. 2. 8. 2 Herstellung der Arabidopsis-pMAQ2 rop1-, rop6- und rop1rop6-Linien 37 

2. 2. 9 Isolation des Zellwandextraktes aus P. indica 
37 

2. 2. 10 Ca2+-Messungen 
37 

2. 2. 11 
Herstellung der Arabidopsis Überexprimierer OX-rop1 und OX-rop6 38 

2. 2. 11. 1 
Herstellung der Überexpressionsplasmide pOX-rop1 und pOX-rop6 38 

2. 2. 11. 2 
Transformation von Arabidopsis mit den Überexpressionsplasmiden 
pOX-rop1 und pOX-rop6 39 

2. 2. 12 
Analyse der Keimung von Arabidopsis und den Mutanten rop1, rop6, 
rop1rop6, ric4, pOX-rop1 und pOX-rop6 40 

2. 2. 13 
Untersuchung des Aktinzytoskeletts von Arabidopsis-GFP–FABD2 
und den Arabidopsis-GFP–FABD2 rop1-, rop6-, rop1rop6-Mutanten 40 

2. 2. 14 
Färbemethoden für die Lichtmikroskopie zum Nachweis von P. indica-
Sporen und ROS im Arabidopsis-Wildtyp, rop1-, rop6-, rop1rop6-, 
OX-rop1-, OX-rop6- und ric4-Mutanten 41 


Inhaltsverzeichnis 

2. 2. 15 
Untersuchungen zur Wurzel- bzw. Wurzelhaarmorphologie von Arabidopsis 
und den Mutanten rop1, rop6, rop1rop6, OX-rop1 und OX-rop6 42 

2. 2. 16 
GeneChip. Expressionsanalyse 42 

2. 2. 17 
Phylogenetische Analyse der kleinen G-Proteine 44 

3 
Ergebnisse 45 

3. 1 
Identifizierung von rop1-, rop6- und ric4-Mutanten 45 

3. 1. 1 
Genotypische Analyse der T-DNA-Insertionen 45 

3. 1. 2 
Analyse der genspezifischen mRNAs in den Mutanten rop1, rop6, 
rop1rop6 und ric4/3 47 

3. 1. 3 
Quantifizierung der T-DNA durch quantitative PCR 49 

3. 2 
Die Überexpressionsmutanten OX-rop1 und OX-rop6 49 

3. 3 
Phänotypische Charakterisierung der Mutanten 51 

3. 3. 1 
Analyse der Keimung 51 

3. 3. 2 
Wurzel- bzw. Wurzelhaarmorphologie im Wildtyp und in den Mutanten 
rop1, rop6, rop1rop6, OX-rop1 und OX-rop6 52 

3. 4 
Interaktionsexperimente von Arabidopsis und den Mutanten rop1, rop6, 
rop1rop6, OX-rop1, OX-rop6, ric4 mit P. indica 56 

3. 4. 1 
Ergebnisse der auf PNM-Medium durchgeführten Interaktionsexperimente 56 

3. 4. 2 
Ergebnisse der auf Erde durchgeführten Interaktionsexperimente 59 

3. 4. 3 
Nachweis der P. indica-Sporen in Arabidopsis und den Mutanten rop1, 
rop6, rop1rop6, OX-rop1, OX-rop6 und ric4 62 

3. 5 
Veränderung der Struktur des Aktinzytoskeletts in den Wurzeln der 
Mutanten rop1, rop6 und rop1rop6 64 

3. 6 
Auswertung der microarray-Experimente 69 

3. 7 
Ergebnisse der real-time PCR-Experimente 70 

3. 8 
Ergebnisse der Ca2+-Messungen in den Arabidopsis-Apoaequorin- 
Transformanten 76 

3. 9 
Klassifizierung und phylogenetische Analyse der kleinen G-Proteine in 
Arabidopsis 78 

4 
Diskussion 80 

4. 1 
Die kleinen G-Proteine ROP1 und ROP6 sowie das ROP-Effektor Protein 
RIC4 beeinflussen den Zeitpunkt der Keimung von Arabidopsis 80 

4. 2 
Der Einfluss von ROP1 und ROP6 auf die Wurzel von Arabidopsis 83 

4. 3 
ROP1 und ROP6 beeinflussen die Ausbildung von Wurzelhaaren 84 

4. 5 
P. indica beeinflusst die Transkription verschiedener Gene im Arabidopsis-
Wildtyp und in den Mutanten differentiell 91 


Inhaltsverzeichnis 

4. 6 
P. indica verursacht eine verstärkte Bildung von Aktinbündeln im 
Arabidopsis-Wildtyp jedoch nicht in den rop1-, rop6-und rop1rop6-knockout-
Mutanten 95 

4. 7 
ROP1 und ROP6 sind nicht in den Ca2+-Einstrom in das Zytoplasma 
involviert, der durch den Zellwandextrakt von P. indica ausgelöst wird 98 

4. 8 
Modell für die Rolle von ROP1 und ROP6 in der Interaktion von Arabidopsis 
mit P. indica 100 

5 
Zusammenfassung 103 

6 
Summary 105 

7 
Literaturverzeichnis 107 

Danksagung 123 
Publikationen 124 
Tagungsbeiträge 125 
Lebenslauf 126 
Ehrenwörtliche Erklärung 127 


Abkürzungsverzeichnis 

Abkürzungsverzeichnis 


A Adenin 
ABA abscisic acid (Abscisinsäure) 
Abb. Abbildung 
ABD actin binding domain 

A. dest. aqua destillata 
ADF actin depolymerizing factors 
ARF ADP ribosylation factor 
Bp Basenpaare 
bzw. beziehungsweise 
ca. circa 
CA konstitutiv aktive Mutante 
C Cytosin 
Cdc42 cell division cycle42 
cDNA copy (komplementäre DNA) 
°C Grad Celcius 
CP crossing point 
DAB 3, 3’-Diaminobenzidin 
DEPC Diethylpyrocarbonat 
d. h. das heißt 
DN dominant negative Mutante 
DNA Desoxyribonukleinsäure 
DNase Desoxyribonuklease 
dNTP Desoxynukleotidtriphosphat (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 
DRMs detergent-resistent membrane domains 
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure 
et al. et alii (Lateinisch: und andere) 
evtl. eventuell 
g gravity (Erdbeschleunigung) 
G Guanin 
GFP green fluorescent protein 
GTP Guanosintriphosphat 
kb Kilobase 
kDa Kilodalton 
LB-Medium Luria-Bertani-Medium (Nährmedium für Bakterien) 
LBa1 left border-Primer 
LP left primer 
LRR leucine-rich repeat 

Abkürzungsverzeichnis 

MAP-Kinase 
mitogen-activated protein kinase 

MATH 
meprin and TRAF [tumor necrosis factor receptor associated factor] 
homology 

mRNA 
messenger RNA 

MS-Medium 
Medium nach Murashige und Skoog 

NASC 
Nottingham Arabidopsis Stock Center 

NBT 
Nitroblautetrazolium 

NCBI 
National Center for Biotechnology Information 

OD 
optische Dichte 

Oligo-dT 
Oligodesoxythymidin 

OX 
Überexpressions-

p. a. pro analysi (für die Analyse) 
PCR polymerase chain reaction 
P. i. Piriformospora indica 
PINs Auxin-Efflux-carrier 
PRONE plant-specific ROP nucleotide exchanger-Domäne 
® registered 
RAB Ras-like proteins from rat brain 
RAC Ras related C3 botulinum toxin substrate 
RAN ras-related nuclear protein 
RAS Rat sarcoma 
RHO Ras homologous 
RIC ROP-interactive CRIB motif-containing protein 
RLS Rhizobium-legume symbiosis 
RNA Ribonukleinsäure 
RNase Ribonuklease 
ROP Rho-like GTPases of plants 
ROP-GAP GTPase-activating protein 
ROP-GDI Guanine nucleotide dissociation inhibitors 
ROP-GEF Guanine nucleotide exchange factor 
ROS reactive oxygen species (reaktive Sauerstoffspezies) 
RP right primer 
RLU relative light units (relative Lichteinheiten) 
RT Reverse Transkription/Transkriptase 
s Sekunde 
s. siehe 
SE standard error (Standardfehler) 
STABW Standardabweichung vom Mittelwert 
T Thymin 

Abkürzungsverzeichnis 

Tab. Tabelle 
TBE Tris-gepuffertes EDTA 
T-DNA Transfer-DNA 
Upm Umdrehungen pro min 
PAMP pathogen-associated molecular patterns 
VAM vesikulär-arbuskuläre Mykorrhiza 
WT Wildtyp 

z. B. zum Beispiel 
ZWE Zellwandextrakt 

Einleitung 

1 Einleitung 

1. 1 Guaninnukleotid-bindende Proteine 
Pflanzen nehmen eine Vielzahl von Umweltreizen wahr, auf die sie entsprechend reagieren. 
Für eine Reaktion auf Umweltreize sind Mechanismen zur Wahrnehmung und Weiterleitung 
der Signale notwendig. Eine bedeutende Rolle in der pflanzlichen Signaltransduktion spielen 
GTP (Guanosintriphosphat)-bindende Proteine. Zu den GTP-bindenden Proteinen gehören die 
heterotrimeren G-Proteine, die kleinen G-Proteine und verschiedene GTP-bindende Proteine, 
die den zuvor genannten Gruppen nicht zugeordnet werden können (Assmann, 2002) und auf 
die in dieser Arbeit nicht eingegangen wird. 

1. 1. 1 Heterotrimere G-Proteine 
Die heterotrimeren G-Proteine bestehen aus den 3 Untereinheiten a, ß und .. Diese 
G-Proteine sind häufig mit Plasmamembranrezeptoren assoziiert. Die Aktivierung eines 
Rezeptors führt zu einer Aktivierung des G-Proteins durch den Austausch von GDP zu GTP 
an der a-Untereinheit. Die a-Untereinheit kann das ß/.-Dimer nun verlassen und beide 
Komponenten können mit Effektoren interagieren. In Säugern wurden mehr als 20 
verschiedene a-Untereinheiten, 5 ß-Untereinheiten und 12 .-Untereinheiten identifiziert. Im 
Genom von Arabidopsis thaliana wurden dagegen lediglich eine a- und eine ß-Untereinheit 
sowie zwei verschiedene .-Untereinheiten gefunden. In Pflanzen sind heterotrimere 
G-Proteine in verschiedenen Signalwegen, wie der Weiterleitung von Licht-und 
Hormonsignalen oder der Antwort auf Pathogene involviert (Assmann, 2002). 

1. 1. 2 Kleine G-Proteine 
Aufgrund der geringen Anzahl von unterschiedlichen a-, ß- und .-Untereinheiten sind die 
Kombinationsmöglichkeiten für heterotrimere G-Proteine in Pflanzen verglichen mit denen in 
Säugern beschränkt, so dass den kleinen G-Proteinen in Pflanzen eine wichtige Rolle 
zuzukommen scheint (Yang, 2002). Kleine G-Proteine werden häufig als kleine GTPasen 
bezeichnet und sind in der Signaltransduktion der Eukaryoten von großer Bedeutung. Sie 
weisen ein Molekulargewicht von 21 bis 40 kD auf und bestehen aus einer Untereinheit, die 
Ähnlichkeit zu der a-Untereinheit der heterotrimeren G-Proteine aufweist. 
Alle kleinen G-Proteine gehören zu einer gemeinsamen übergeordneten Familie, der 
sogenannten RAS-Superfamilie. Entdeckt wurden die kleinen G-Proteine als Onkogene im 
Sarkoma-Virus 1978/79 (Takai et al., 2001). Die RAS-Superfamilie besteht aus 5 Familien: 
RAS (rat sarcoma), RAB (ras-like proteins from rat brain), ARF (ADP ribosylation factor), 
RHO (ras homologous) und RAN (ras-related nuclear protein) (Bischoff et al., 1999). RAS-
GTPasen sind u. a. an der Zellproliferation, der Zelldifferenzierung und am Zelltod von 


Einleitung 

Säugetierzellen beteiligt (Takai et al., 2001). RHO-GTPasen sind in die Regulation des 
Aktinzytoskeletts involviert. RAB- und ARF-GTPasen sind an unterschiedlichen Schritten 
des Vesikelverkehrs zwischen Membranen beteiligt. RAN-GTPasen regulieren den Transport 
von Proteinen und RNA durch die Poren der Kernmembran (Vernoud et al., 2003). Für RAS-
und RHO-GTPasen wurde die Weiterleitung extrazellulärer Signale nachgewiesen. Die 
Mitglieder dieser Familien besitzen strukturelle Gemeinsamkeiten, wie die 4 GTP-bindenden 
Domänen, die konservierte Aminosäuresequenzen aufweisen und die für die spezifische 
Interaktion mit GDP bzw. GTP sowie für die GTPase-Aktivität verantwortlich sind 
(Abb. 1. 1). Eine weitere strukturelle Gemeinsamkeit stellt die Effektor-bindende Domäne 
dar, die die Interaktion mit spezifischen Effektoren ermöglicht (Zheng und Yang, 2000; Takai 
et al., 2001). RAS-, RAB- und RHO-GTPasen besitzen an ihrem C-Terminus ein Motiv für 
Prenylierung, ARF-GTPasen hingegen besitzen am N-Terminus ein Myristoylierungs-Motiv. 
Diese Lipidmodifikationen sind für die Interaktion und Lokalisation der GTPasen mit 
Membranen und Proteinen essentiell. In RAN-GTPasen wurden bisher keine Sequenzen für 
solche posttranslationalen Modifikationen gefunden (Takai et al., 2001; Yang, 2002). 

I E II III IV P 

XXXGK FXXXYXX DXXG VGNKX EXSA CXX(X) 


RHO-
Insertion 

Abb. 1. 1: Konservierte Strukturen kleiner G-Proteine. Alle kleinen G-Proteine besitzen 
4 konservierte Domänen zur Interaktion mit GDP/GTP und für die GTPase Aktivität (I-IV), sowie 
eine Effektor-bindende Domäne (E). Die RHO-Insertion wurde nur in RHO-GTPasen gefunden und 
umfaßt 10-12 Aminosäuren. RAB-, RAS- und RHO-GTPasen weisen am C-Terminus ein Motiv zur 
Prenylierung auf. ARF-GTPasen besitzen am N-Terminus ein Myristoylierungs-Motiv. In RAN-
GTPasen wurden keine Modifikationen gefunden (nach Yang, 2002). 

Kleine G-Proteine funktionieren als molekulare Schalter, d. h. sie liegen im aktiven GTP-
gebundenen Zustand oder im inaktiven GDP-gebundenen Zustand vor. An der Regulation 
dieser zwei Zustände sind weitere Proteine beteiligt, dazu gehören Guaninnukleotid-
Austauschfaktoren (guanine nucleotide exchange factor, GEFs), die den Austausch von GDP 
durch GTP vermitteln. Aktivierte kleine G-Proteine besitzen eine geringe intrinsische GTPase 
Aktivität. Für eine effiziente Inaktivierung sind GTPase-aktivierende Proteine (GAPs) 
notwendig, sie unterstützen die Hydrolisierung von GTP zu GDP+ Pi. Für eine Aktivierung der 
kleinen G-Proteine durch GEFs ist die Assoziation mit der Plasmamembran erforderlich. 


Einleitung 

Guaninnukleotid-Dissoziationsinhibitoren (GDIs) unterbinden die Aktivierung kleiner 
G-Proteine durch drei Mechanismen: 

1. 
Verhinderung der Dissoziation von GDP, 
2. 
Bindung an GDP-gebundene kleine G-Proteine und 
3. 
Entfernung von der Membran (Takai et al., 2001; Yang, 2002; Vernoud et al., 
2003). 
1. 2 Klassifizierung der kleinen G-Proteine von Arabidopsis thaliana 
In Arabidopsis wurden 93 kleine G-Proteine identifiziert, die in die 4 Familien RAB 
(57 GTPasen), ARF (21 GTPasen), ROP (11 GTPasen) und RAN (4 GTPasen) eingeteilt 
werden. In Pflanzen konnten keine RAS-GTPasen identifiziert werden. Die RHO-GTPase 
Familie der Säuger wird in die Unterfamilien RHO, RAC (ras related C3 botulinum toxin 
substrate) und Cdc42 (cell division cycle42) gegliedert. Anstelle der aus Säugern bekannten 
RHO-GTPase Familie besitzen Pflanzen eine eigene Unterfamilie: die ROP-GTPasen (rholike 
GTPases of plants). Die ROP-GTPasen scheinen einen gemeinsamen Vorläufer mit den 
RHO-, Cdc42- und RAC-Unterfamilien von Säugern und Saccharomyces cerevisiae zu 
besitzen (Yang, 2002; Vernoud et al., 2003). 

1. 3 Die kleinen G-Proteine der ROP-Familie 
Im Genom von Arabidopsis konnten 11 ROP-GTPase-Gene (rops) identifiziert werden. Die 
Nomenklatur dieser Gruppe ist in der Literatur nicht einheitlich. Obwohl die ROPs eindeutig 
einer eigenen Unterfamilie zugeordnet werden können (Yang, 2002; Vernoud et al., 2003; 
Berken, 2006), wurde auf Grund einer geringen Ähnlichkeit zu den menschlichen RAC-
Proteinen von einigen Gruppen die Bezeichnung RAC-GTPasen eingeführt (Winge et al., 
1997; 2000; Kost et al., 1999; Lemichez et al., 2001). In dieser Arbeit wird die Bezeichnung 
ROP-GTPasen bzw. ROPs verwendet (Yang, 2002; Berken, 2006). 

1. 4 ROP-regulierte Signalwege 
ROP-GTPasen (ROPs) kontrollieren eine Vielzahl von lebenswichtigen Signalwegen im 
Lebenszyklus einer Pflanze. Sie sind an der Ausbildung der Zellpolarität, an 
Wachstumsprozessen, an der Morphogenese, der Zellteilung, der Weiterleitung von 
Hormonsignalen sowie an pathogenen und nicht-pathogenen Interaktionen beteiligt 
Weiterhin sind sie für endo-und exozytotische Prozesse, Membranverkehr und 
Membranregenerierung, für abiotische Stressantworten, Meristemerhaltung und 
Differenzierung des Xylems von Bedeutung (Reviews: Gu et al., 2004; Molendijk et al., 2004; 


Einleitung 

Samaj et al., 2006; Berken, 2006; Nibau et al., 2006; Yang und Fu, 2007; Lee und Yang, 
2008; Berken und Wittinghofer, 2008; Yalovsky et al., 2008). Einen Überblick über die von 
ROPs regulierten Signalwege gibt die Abb. 1. 2. ROP-GTPasen sind durch die Interaktion mit 
verschiedenen Proteinen an der Regulation des Aktinzytoskeletts beteiligt, wie im linken Teil 
der Abb. 1. 2 zu sehen ist. Durch die ROP-induzierte Aktivierung von RIC4, die Aktivierung 
des SCAR/WAVE- und ARP2/3-Komplexes (verändert nach Hussey et al., 2006; Berken und 
Hülskamp, 2006) und die Hemmung von ADF (actin depolymerizing factor) wird die 
Dynamik des Aktinzytoskeletts beeinflusst. 

SCAR/
WAVE-KomplexCallosesynthesisCellplateformationARP2/3SCAR/ 
WAVE-Komplex Callose synthesis 
Cell plate 
formation 
ARP2/3 
Abb. 1. 2: Schematische Darstellung der von ROPs regulierten Signalwege verändert von Nibau 
et al. (2006). ROP-GTPasen sind an der Regulation des Aktinzytoskeletts beteiligt. Sie haben Einfluss 
auf die Genexpression, ROS-vermittelte Signaltransduktionswege, Stress-und Entwicklungsprozesse 
sowie Hormonsignalwege. 


Einleitung 

ROP-Proteine regulieren auch die Mikrotubuli-Dynamik, so führt die ROP-induzierte 
Entfernung von RIC1 von den Mikrotubuli zur Inaktivierung von RIC1. Es gibt zahlreiche 
Hinweise, dass ROP-Proteine den zytosolischen Ca2+-Spiegel beeinflussen, der u. a. essentiell 
für die Dynamik des Aktinzytoskeletts ist. Ein möglicher ROP-Effektor könnte die PtdInsP-
Kinase (Phosphatidylinosit-Monophosphat-Kinase) sein, durch deren Produkt PIP2 
(Phosphatidylinosit (4, 5)-bisphosphat) Veränderungen des Ca2+-Spiegels induziert werden. 
Die Regulation der Aktin- und Mikrotubuli-Dynamik und des Ca2+-Spiegels ist essentiell für 
die Morphologie diffus und polar wachsender Zellen. 
Ein weiterer ROP-Effektor ist die UDP-Glukose-Transferase (UGT1). UGT1 führt den 
Transfer von UDP-Glukose auf die katalytische Untereinheit der Callose-Synthase während 
der Bildung der Zellplatte bei der Zellteilung durch (verändert nach Berken, 2006). Auf der 
rechten Seite der Abb. 1. 2 ist die Regulation der Produktion von ROS (reactive oxygen 
species) zu sehen. Diese geschieht vor allem durch die Aktivierung der Membran-gebundenen 
NADPH-Oxidase. Eine MAP-Kinase-Kaskade (mitogen-activated protein kinase) könnte die 
Aktivierung der NADPH-Oxidase vermitteln. ROS sind für die Ausbildung der 
Sekundärwand und für die Krankheitsresistenz von Bedeutung. ROS regulieren auch die 
Alkoholdehydrogenase und die Reaktionen bei Sauerstoffmangel. ROS stimulieren die 
Expression von GAPs, dies führt zur ROP-Inaktivierung, vermutlich um toxische ROS-
Konzentrationen zu verhindern. In der Mitte des Bildes ist die Regulation von Auxin- und 
ABA-Signalwegen zu sehen. Auxin führt zur Aktivierung von ROPs und vermittelt die 
Auxin-induzierte Genexpression durch den Abbau der Aux/IAA-Transkriptions-
Repressorproteine. Aux/IAA-Proteine werden durch den Ubiquitin/Proteasomen-abhängigen 
Proteolyse-Weg inaktiviert. Der freie Auxin Response Faktor (ARF) kann dimerisieren und 
die Auxin-induzierte Genexpression stimulieren. Im Gegensatz dazu werden ROPs durch 
ABA (abscisic acid) inaktiviert, wodurch verschiedene durch ABA regulierte Antworten 
ausgelöst werden, z. B. die Genexpression. Die zwischengeschalteten Signalkomponenten der 
von ROPs regulierten Signalwege sind weitestgehend unbekannt (Nibau et al., 2006). 


Einleitung 

1. 5 ROP-interagierende Proteine 
Zu den interagierenden Proteinen der ROPs gehören die Guaninnukleotid-Austauschfaktoren 
(guanine nucleotide exchange factor, ROP-GEFs), GTPase-aktivierende Proteine (GTPaseactivating 
protein, ROP-GAPs), Guaninnukleotid-Dissoziations-Inhibitoren (guanine 
nucleotide dissociation inhibitors, ROP-GDIs) und RICs (ROP-interactive CRIB motifcontaining 
proteins) (Wu et al., 2001; Yang, 2002; Vernoud et al., 2003). 


Si
SiSig
ggn
nna
aal 
ll 

AktivierungvonRLKs?
DPPDRMs 
Aktivierung von 
RLKs 
? 
PM 
GEF 
GDI 
GDP GAP G 
DP 
GEF 
P 
? 
GDP 
ROP ROP ROP ROP 
ROP 
GDP GDPGTP 
Effe
EffeEffek
kkt
tto
oor
rren 
enen 

Abb. 1. 3: Aktivierung und Deaktivierung von ROPs verändert von Nibau et al. (2006). ROP-
GTPasen wechseln zwischen einem inaktiven, GDP-gebundenen und einem aktiven GTP-gebundenen 
Zustand. GEFs stimulieren nach ihrer Aktivierung den Austausch von GDP durch GTP und aktivieren 
die an der Plasmamembran (PM) befindlichen ROPs. In ihrem aktivierten Zustand sind einige ROPs 
vermutlich Bestandteil von Membran-Mikrodomänen (DRMs: detergent-resistent membrane 
domains). GAPs stimulieren die intrinsische GTPase-Aktivität der ROPs, und führen zur Rückkehr in 
den GDP-gebundenen Zustand. GDIs sind negative Regulatoren der ROPs, sie entfernen die ROPs 
von der Zellmembran und verhindern so ihre Aktivierung durch Membran-gebundene GEFs. Über die 
Prozesse, die zur Aktivierug der GEFs führen, ist noch wenig bekannt. Rezeptor-ähnliche Kinasen 
sind potentielle Rezeptoren, die ROP-vermittelte Signaltransduktionwege auslösen können. 
?: unbekannte Rezeptorkomponenten, P: potentielle GEF-Phosphorylierung durch Rezeptorkinasen 

1. 5. 1 ROP-GEFs: Guaninnukleotid-Austauschfaktoren 
RHO-GEFs fördern den Austausch von GDP mit GTP und aktivieren dadurch RHO-GTPasen 

(Abb. 1. 3). RHO-GEFs wurden schon vor einiger Zeit in Tieren und Pilzen entdeckt, sie 

besitzen zwei spezifische Domänen, eine sogenannte Dbl- bzw. DH-Domäne (diffuse B-cell 

lymphoma homology) und eine Pleckstrin-homologe Domäne (Cerione und Zheng, 1996). 

Weder im Genom von Arabidopsis noch von Reis konnten ähnliche Proteine mit einer 

DH-Domäne gefunden werden. In Säugern wurden DOCK180- und ELMO-Proteine als 

RAC-GEFs identifiziert. ELMO und DOCK180 sind gemeinsam für eine Beladung von RAC 

mit GTP erforderlich (Brugnera et al., 2002). In Arabidopsis wurde ein Protein mit 

DOCK180-Homologie entdeckt, SPIKE1 (Qui et al., 2002). Eine ROP-GEF-Aktivität und 


Einleitung 

eine Beteiligung an der Regulation der Aktinpolymerisation konnte inzwischen nachgewiesen 
werden (Basu et al., 2008). Im Jahr 2005 wurde eine neue, nur in Pflanzen vorkommende 
Familie von ROP-GEFs in Arabidopsis identifiziert (Berken et al., 2005). Die 14 in 
Arabidopsis identifizierten ROP-GEFs weisen variable Aminosäuresequenzen am N- und 
C-Terminus auf, besitzen aber eine zentrale, konservierte sowie katalytisch aktive und ROP-
bindende Domäne, die sogenannte PRONE-Domäne (plant-specific ROP nucleotide 
exchanger) (Berken et al., 2005; Berken, 2006). Die Untersuchung von ROP-GEF1 in 
Arabidopsis-Pollen zeigte, das ROP1 durch ROP-GEF1 aktiviert wird und am polaren 
Wachstum des Pollenschlauches beteiligt ist (Gu et al., 2006). In Pollen von Tomate und 
Arabidopsis konnte eine Interaktion von ROP-GEFs mit der zytoplasmatischen Domäne der 
Rezeptorkinasen LePRK2 und AtPRK2a nachgewiesen werden. Diese Beobachtungen führten 
zu der Annahme, dass die Interaktion von ROP-GEFs mit aktivierten Rezeptorkinasen eine 
Aktivierung der ROPs auslösen, welche anschließend eine Weiterleitung des Signals durch 
die Interaktion mit Effektoren bewirken (Kaothien et al., 2005; Zhang und McCormick, 
2007). 

1. 5. 2 ROP-GAPs: GTPase-aktivierende Proteine 
RHO-GAPs fördern die intrinsische GTPase Aktivität von RHO-Proteinen und führen 
dadurch zu einer Inaktivierung des RHO-Proteins (Abb. 1. 3). Die katalytisch aktive RHOGAP-
Domäne umfaßt ca. 150 Aminosäuren und bildet ein Arginin-Finger Motiv, das in die 
GTPase-aktive Seite der RHO-GTPase ragt. In Arabidopsis wurden 3 Familien gefunden, die 
eine konservierte ROP-GAP-Domäne aufweisen. Die am besten charakterisierte Familie 
besteht aus 6 Mitgliedern und weist neben der GAP-Domäne ein CRIB-Motiv auf. Das CRIB-
Motiv wurde in tierischen RAC- und Cdc42-Effektoren entdeckt. In vitro Versuche in 
Arabidopsis zeigten eine verstärkte GTPase-Aktivität von ROP1 durch ROP-GAP1. Das 
CRIB-Motiv ist dabei für die Bindung von ROP1 und die GTPase-Aktivität notwendig 
(Brembu et al., 2006; Berken und Wittinghofer, 2008). In Arabidopsis wird unter 
Sauerstoffmangel verstärkt H2O2 durch die Aktivierung der NADPH-Oxidase gebildet, die 
von einem unbekannten ROP-Protein ausgelöst wird. Die verstärkte Bildung von H2O2 führt 
zur Expression der Alkoholdehydrogenase, einem Enzym der alkoholischen Gärung. Eine 
negative Rückkopplung dieses Prozesses kommt durch die H2O2-ausgelöste Expression von 
ROP-GAP4 zustande, was zur Beendigung der Aktivität der ROP-GTPase führt und dadurch 
eine Schädigung durch reaktive Sauerstoff-Spezies verhindert (Baxter-Burell et al., 2002). 
Eine zweite ROP-GAP-Familie, bestehend aus 3 Mitgliedern, weist neben der GAP-Domäne 
eine N-terminale PH-Domäne (pleckstrin homology) auf. PH-Domänen besitzen die Fähigkeit 
Phosphoinositide zu binden. Phosphoinositide wie Diazylglyzerin oder Inositoltriphosphat 
können indirekt als Enzymsubstrate oder direkt als second messenger dienen. Möglicherweise 
sind für die Aktivität und/oder die Lokalisation der ROP-GAPs Phosphoinositide von 


Einleitung 

Bedeutung (Brembu et al., 2006). Die dritte ROP-GAP-Familie besteht aus nur einem 
Mitglied. Dieses Protein besitzt neben der GAP-Domäne keine weiteren bekannten Motive 
und wurde bisher nicht hinsichtlich der Aktivität seiner GAP-Domäne untersucht (Brembu et 
al., 2006; Berken und Wittinghofer, 2008). 

1. 5. 3 ROP-GDIs: Guaninnukleotid-Dissoziationsinhibitoren 
RHO-GDIs regulieren die Aktivität der RHO-GTPasen durch Hemmung der GDP-
Dissoziation, Hemmung der GTP-Hydrolyse und Interaktion mit GAPs, GEFs und Effektoren 
sowie durch die Entfernung der RHO-GTPasen von der Plasmamembran und Transport in das 
Zytoplasma (Abb. 1. 3). Im Genom von Arabidopsis wurden drei ROP-GDIs identifiziert, die 
eine große Ähnlichkeit zu den RHO-GDIs von Säugern zeigen, mit Ausnahme von 50 
Aminosäuren am N-Terminus. Die Aminosäurereste Asp45 und Asp185 sind für die 
Hemmung der GDP-Dissoziation von Cdc42 essentiell und finden sich auch in den drei ROP-
GDIs von Arabidopsis (Takai et al., 2001; Brembu et al., 2006). ROP-GDIs sind für die 
Lokalisation und Aktivität von ROPs während des Pollenschlauchwachstums und der 
Wurzelhaarmorphogenese von Bedeutung. Die Überexpression von ROP-GDI1 in 
Pollenschläuchen von Tabak unterdrückt die Wachstumsstörung, die durch die 
Überexpression von ROP1 verursacht wird (Fu et al., 2001). In der Arabidopsis-Mutante 
ROP-GDI1 (scn1) verursacht das Fehlen von SCN1 eine Akkumulation von ROP2 an der 
Zellmembran der Rhizodermiszelle. Durch die ektopische Lokalisation von ROP2 kommt es 
zur Ausbildung von zahlreichen Wurzelhaaranlagen anstelle von nur einer Wurzelhaaranlage 
je Trichoblast. Auch während der Elongation des Wurzelhaares verbleibt ROP2 in scn1Mutanten 
an der Zellmembran, im Wildtyp befindet sich ROP2 während dieses Stadiums im 
Zytoplasma in der Nähe der wachsenden Spitze (Carol et al., 2005). In yeast two-hybrid 
Analysen und protein pull down-assays konnte eine Interaktion von ROP-GDI1 mit ROP4 
und ROP6 von Arabidopsis gezeigt werden (Bischoff et al., 2000). 

1. 5. 4 RIC-Proteine (Rop-interactive CRIB motif-containing proteins) 
Das CRIB-Motiv wurde in Cdc42- und RAC-Effektoren von Saccharomyces cerevisiae und 
von tierischen Zellen gefunden. Zu diesen Effektoren, die Cdc42- und RAC-Proteine GTP-
abhängig binden, gehören die Pak-Kinasen (p21-aktivierte Kinasen). Die Pak-Kinasen 
gehören zu den Serin-Threonin-Kinasen und phosphorylieren nach ihrer Aktivierung eine 
Vielzahl von Proteinen. Pak-Kinasen sind an der Regulation der durch MAP-Kinasen 
ausgelösten Genexpression ebenso beteiligt, wie an der Organisation des Mikrotubuli- und 
Aktinzytoskeletts (Takai et al., 2001). In Pflanzen wurde bisher keine Pak-Homologe 
identifiziert. Stattdessen wurden zwei Pflanzen-spezifische Familien entdeckt, die das CRIB-
Motiv besitzen, dazu gehören die bereits erwähnten ROP-GAPs und die RICs (Brembu et al., 


Einleitung 

2006). RICs sind kleine Proteine mit einer Sequenz von 116 bis 224 Aminosäuren, die 
abgesehen vom CRIB-Motiv, keine Ähnlichkeiten zu anderen Proteinen zeigen. Durch pull 
down-assays konnte gezeigt werden, dass RIC1 nur mit aktiviertem, d. h. GTP-gebundenen 
ROP1 interagiert und dass das CRIB-Motiv für die Interaktion beider Proteine essentiell ist 
(Wu et al., 2001). 11 RICs wurden durch Datenbank-Recherchen gefunden, jedoch konnten 
ric8 und ric11 nicht in Arabidopsis nachgewiesen werden, so dass es sich möglicherweise um 
Pseudogene oder nur in bestimmten Entwicklungsstadien exprimierte Gene handelt. Die 
meisten rics werden konstitutiv in verschiedenen Geweben von Arabidopsis exprimiert, nur 
ric3, ric5 und ric6 sind Blüten-spezifisch (Wu et al., 2001). Für RIC3 und RIC4 konnte die 
Interaktion mit aktivem ROP1 in vivo nachgewiesen werden. Die Interaktion von ROP1 mit 
RIC4 begünstigt die Zusammenlagerung des F-Aktins an der Spitze des Pollenschlauches von 
Tabakpollen. Im Gegensatz dazu fördert die ROP1-abhängige Aktivierung des RIC3Signalweges 
in einem Ca2+-abhängigen Prozess den Abbau der Aktinstrukturen (Gu et al., 
2005). Die ROP1-abhängige Dynamik des F-Aktins ist für das Spitzenwachstum von 
Pollenschläuchen essentiell (Fu et al., 2001). Neuere Untersuchungen zeigen eine Beteiligung 
an der gerichteten Exozytose durch die ROP1-abhängige Regulation der Aktin-Dynamik. Die 
RIC4-vermittelte F-Aktin Zusammenlagerung an der Pollenschlauchspitze geht mit einer 
Vesikel-Akkumulation einher, der RIC3-vermittelte F-Aktin-Abbau hingegen induziert die 
Exozytose an der Spitze (Lee et al., 2008). 
Neben dem polar gerichteten Wachstum der Pollenschläuche wurde auch das unpolare 
Wachstum von Blattepidermiszellen in Arabidopsis untersucht. Diese Blattepidermiszellen 
ähneln Puzzelteilen, die verzahnend ineinandergreifen. Das Auswachsen eines bestimmten 
Zellbereiches kommt durch die lokale Aktivierung von ROP2 zustande. ROP2 aktiviert RIC4, 
wodurch die Zusammenlagerung von F-Aktin gefördert wird. Durch die Zusammenlagerung 
des F-Aktins kommt es zu einem lokalen Auswachsen dieses Zellbereiches. Gleichzeitig wird 
RIC1 durch ROP2 inaktiviert. RIC1 gehört zu den Mikrotubuli-assoziierten Proteinen. Es 
fördert einerseits eine geregelte Mikrotubuli-Organisation und hemmt die laterale Expansion 
an den Verengungen bzw. Einbuchtungen der Blattepidermiszellen und unterdrückt 
andererseits die Aktivierung von ROP2 (Fu et al., 2005). Über die Aktivierung von ROP2 ist 
bisher nichts bekannt, aktuelle Untersuchungen zeigen jedoch, dass ROP6 an RIC1 bindet und 
vermutlich an der Aktivierung von RIC1 beteiligt ist (Fu et al., 2009). 


Einleitung 

1. 6 Differentielle Expression der rop-mRNAs 
Die differentielle Expression der rop-Gene wurde mit RT-PCR in den unterschiedlichen 
Geweben von Arabidopsis untersucht. Die mRNAs von rop2, rop3, rop4 und rop10 werden in 
allen getesteten Geweben (Blüten, Schoten, Blätter, Wurzeln und Sproß) exprimiert. Das 
Transkript von rop5 ist in Wurzeln nur in geringem Maße nachweisbar. Das rop6-Gen wird 
nicht in Schoten exprimiert. Das Vorhandensein der rop1-mRNA ist blütenspezifisch (Li et 
al., 1998; Zheng et al., 2002). Die mRNA von rop7 wurde nur im Sproß und in der Wurzel 
nachgewiesen. Keine Informationen gibt es zur gewebespezifischen Expression von rop8, 
rop9 und rop11 (Vernoud et al., 2003). 

1. 7 Die Funktionen von ROP1 und ROP6 
Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Bedeutung der kleinen G-Proteine ROP1 und ROP6 von 
Arabidopsis für die Interaktion mit dem endophytisch lebenden Pilz Piriformospora indica 
untersucht. Dieses Kapitel fasst die bekannten Funktionen von ROP1 und ROP6 zusammen. 
Rop1 wird als das einzige Blüten-spezifische rop-Gen in Arabidopsis beschrieben. Es handelt 
sich um ein spätes Pollengen, welches die größten Sequenzübereinstimmungen zu rop3 und 
rop5 zeigt. Die mRNAs von rop3 und rop5 werden ebenfalls in reifen Pollen exprimiert, 
allerdings in geringerem Maße als rop1. Für ROP1, ROP3 und ROP5 wird eine redundante 
Funktion während des Pollenschlauchwachstums angenommen (Li et al., 1998). Es konnte 
nachgewiesen werden, dass die Aktivität von ROP1 durch verschiedene ROP-interagierende 
Proteine reguliert wird. So wird ROP1 durch ROP-GEF1 (s. 1. 5. 1) aktiviert und durch ROPGAP1 
(s. 1. 5. 2) inaktiviert, wobei das CRIB-Motiv von ROP-GAP1 für die Bindung von 
ROP1 und die GTPase-Aktivität notwendig ist (Gu et al., 2006, Brembu et al., 2006; Berken 
und Wittinghofer, 2008). Die Überexpression von ROP-GDI1 in Pollenschläuchen 
unterdrückt die Wachstumsstörung, die durch die Überexpression von ROP1 verursacht wird 
(Fu et al., 2001). Die Wirkungsweise von ROP-GDIs wurde unter 1. 5. 3 beschrieben. 
Bekannte Effektoren von ROPs sind RIC-Proteine. So konnte mit pull down-assays gezeigt 
werden, dass RIC1 nur mit aktiviertem, d. h. GTP-gebundenen ROP1 interagiert, und dass das 
CRIB-Motiv für die Interaktion beider Proteine essentiell ist (Wu et al., 2001). Für RIC3 und 
RIC4 konnte die Interaktion mit aktivem ROP1 in vivo nachgewiesen werden. Die Interaktion 
von ROP1 mit RIC4 begünstigt die Zusammenlagerung des F-Aktins an der Spitze des 
Pollenschlauches. Im Gegensatz dazu fördert die ROP1-abhängige Aktivierung des RIC3Signalweges 
in einem Ca2+-abhängigen Prozess den Abbau der Aktinstrukturen (Gu et al., 
2005). Fu et al. (2001) konnte zeigen, dass die ROP1-abhängige Dynamik des F-Aktins für 
das Spitzenwachstum von Pollenschläuchen essentiell ist. Neuere Untersuchungen zeigen eine 
Beteiligung an der gerichteten Exozytose durch die ROP1-abhängige Regulation der Aktin-
Dynamik. Dabei kommt es durch die RIC4-vermittelte F-Aktin Zusammenlagerung an der 
Spitze des Pollenschlauches zu einer Vesikel-Akkumulation, RIC3 hingegen vermittelt den 


Einleitung 

F-Aktin-Abbau und induziert die Exozytose an der Spitze (Lee et al., 2008). ROP1 reguliert 
wahrscheinlich die Lokalisation von CNGC18 (cyclic nucleotide-gated channel18). CNGCs 
sind für Ca2+-durchlässige, nicht selektive Kationenkanäle. Durch die Aktivität von ROP1 ist 
das pollenspezifische Protein CNGC18 hauptsächlich an der Spitze des Pollenschlauches in 
der Plasmamembran nachweisbar und dort vermutlich für die Ca2+-Leitfähigkeit 
verantwortlich (Chang et al., 2007). Die Untersuchung von ROP1 einschließlich der mit 
ROP1 interagierenden bzw. regulierten Proteine von Arabidopsis erfolgte in Tabak-
Pollenschläuchen. 
Die mRNA von rop6 konnte in allen getesteten Geweben von Arabidopsis mit Ausnahme von 
Schoten und geschlossenen Blüten nachgewiesen werden (Li et al., 1998). ROP6 wurde in 
seiner aktiven, d. h. GTP-gebundenen Form in lipid rafts nachgewiesen werden. Lipid rafts 
sind Triton X-100-unlösliche Fraktionen und enthalten azylierte Proteine. ROP6 weist in lipid 
rafts neben einem Prenylierungsmotiv eine Acylierung auf. Möglicherweise werden ROPs 
nur in lipid rafts aktiviert und stabilisieren sich selbst durch Acylierung (Sorek et al., 2007). 
Verschiedene ROPs werden als positive Regulatoren von Auxin-Signalwegen vermutet. Die 
Informationen über die Regulation dieser Signalwege sind gering. ROP6 und ROP1 gehören 
jedoch zu den ROPs, die Auxin-abhängig und Auxin-unabhängig die Expression des Auxininduzierbaren 
Promotors DR5 in Tabak-Protoplasten stimulieren (Tao et al., 2002). 
ROP6 ist auch in die Schließung der Stomata involviert. Normalerweise wird das Schließen 
der Stomata durch ABA induziert. ABA führt zur Inaktivierung von ROP6 in Abhängigkeit 
von der verwendeten ABA-Konzentration. Dominant negative (DN) rop6-Mutanten imitieren 
jedoch den ABA-induzierten Schluß der Stomata. Sie weisen die typischen aufgelösten 
Aktinstrukturen auf. In konstitutiv aktiven (CA) rop6-Mutanten kann der Stomata-Schluß 
auch durch die Zugabe von ABA nicht herbeigeführt werden. In den Schließzellen werden die 
Aktinkabel nicht aufgelöst (Lemichez et al., 2001). ROP6 ist vermutlich an der Aktivierung 
von RIC1 in Blattepidermiszellen beteiligt (Fu et al., 2009). Blattepidermiszellen weisen eine 
besondere Regulation des Wachstums auf (s. 1. 5. 4), die durch ROPs und RICs gesteuert 
wird. Ob ähnliche Regulationsmechanismen in Wurzeln existieren, wurde bisher nicht 
untersucht. Für die Morphologie der Wurzelhaare scheint ROP6 jedoch von Bedeutung zu 
sein, wie Molendijk et al. (2001) zeigte. Die Expression von CA-AtROP6 in Arabidopsis-
Wurzeln führt zu einer Delokalisation des Ca2+-Gradienten an der Spitze des Wurzelhaares 
und zum Anschwellen des Wurzelhaares. 


Einleitung 

1. 8 Das Aktinzytoskelett und die Regulation der Aktin-Dynamik 
Für Wachstumsprozesse, Zellteilung, Morphogenese, endo- und exozytotische Prozesse, aber 
auch für die Lokalisation von Auxintransportern und des Zellkerns in der Zelle ist die 
Dynamik des Aktinzytoskeletts eine wichtige Voraussetzung (Geldner et al., 2001; Ketelaar 
et al., 2002; Hussey et al., 2006). Aktin liegt in der Zelle entweder als monomeres G-Aktin 
vor oder als Filament, aufgebaut aus G-Aktin-Monomeren. Das filamentöse (F)-Aktin besteht 
aus zwei Ketten polymerisierter und polar angeordneter G-Aktin-Monomere, die sich 
helixartig umeinanderwinden. Aktinfilamente sind keine stabilen Strukturen, sie unterliegen 
einem ständigen Auf- und Abbau. Polymerisation und Depolymerisation von Aktin-
Monomeren tritt an beiden Enden auf, jedoch erfolgt der Aufbau vor allem am schnell 
wachsenden plus-Ende, während das minus-Ende nur langsam oder gar nicht wächst. Aktin-
Monomere liegen in der Zelle in ATP oder ADP-gebundener Form vor, wobei ATP-
gebundene Monomere leichter polymerisieren (Ruijter und Emons, 1999). Aktinfilamente 
können auch zu höheren Strukturen angeordnet sein. Diese Aktinbündel bestehen aus parallel 
oder antiparallel dicht aneinander liegenden Aktinfilamenten. 

1. 8. 1 Aktin-bindende Proteine 
Für die Aktindynamik sind zahlreiche Aktin-bindende Proteine nötig. Zu diesen Aktinbindenden 
Proteinen gehört Profilin, das an monomeres G-Aktin bindet und einen 
unkontrollierten Aufbau von Filamenten z. B. bei hohen Aktinkonzentrationen in der Zelle 
verhindert. Zu den Aktin-bindenden Proteinen gehören weiterhin der ARP2/3-Komplex (actin 
related protein 2/3), Formine, Gelsolin, das heterodimeric capping protein, ADF/Cofilin 
(ADF: actin depolymerizing factor), AIP1 (actin interacting protein1) und CAP (cyclase 
associated protein). Formine stimulieren die de novo Aktin-Polymerisation und können am 
plus-Ende binden (Thomas et al., 2009). Sie interagieren mit Profilin und können vermutlich 
die Aktinpolymerisation an bestimmten Stellen der Zellmembran initiieren (Hussey et al., 
2006; Thomas et al., 2009). Gelsolin hingegen fördert die Aktinpolymerisation am minus-
Ende, kann aber auch die Profilin-vermittelte Aktin-Depolymerisation verstärken. Das 
heterodimeric capping protein bindet fest an die plus-Enden von Aktinfilamenten, dadurch 
wird die Polymerisation am minus-Ende gefördert. Da das capping protein das plus-Ende 
besetzt und an Profilin gebundenes Aktin nur am plus-Ende binden kann, wird die 
Elongationsrate des Aktinfilaments stark verringert. ADF/Cofilin- Proteine binden 
monomeres G- und filamentöses (F)-Aktin pH-abhängig, sie verstärken die Aktindynamik 
durch Auflösen von Aktinfilamenten und fördern die Depolymerisation am plus-Ende. Durch 
Phosphorylierung nimmt die Aktivität der ADFs ab (Hussey et al., 2006). Die Aktivität der 
ADFs wird durch zahlreiche Faktoren wie ROP-GTPasen beeinflusst (Chen et al., 2003). 
Über die Funktionen von AIP1 ist bisher wenig bekannt, jedoch konnte nachgewiesen 
werden, das AIP1 die Aktivität von ADF1 in Lilien-Pollen extrem stimuliert (Allwood et al., 


Einleitung 

2002). Das Protein AtCAP1 bindet an ADP- und ATP-gebundenes monomeres G-Aktin. 
AtCAP1 hemmt durch die Bindung an ATP-assoziiertes G-Aktin die Polymerisation zu 
Aktinfilamenten. AtCAP1 ist auch für den Nukleotid-Austausch von ADP mit ATP an den G-
Aktin Monomeren verantwortlich, eine Funktion, die in tierischen Zellen von Profilinen 
übernommen wird und den Vorrat an polymerisierbaren G-Aktin wieder auffüllt (Chaudhry et 
al., 2007). 

1. 8. 2 Aktin-bündelnde Proteine 
Pflanzen besitzen verschiedene Klassen Aktin-bündelnder Proteine: Villine/Gelsoline, 
Fimbrine, Formine, LIM-Proteine (Abb. 1. 4) (Thomas et al., 2009) und den 
Elongationsfaktor-1a (Hussey et al., 2006). Diese Proteine sind für die Bildung höherer 
Strukturen wie Aktinkabel bzw. -bündel oder die Ausbildung von netzartigen Strukturen 
erforderlich. 
Villine bündeln Aktinfilamente unipolar (Abb. 1. 5) und wirken einer Depolymerisation durch 
ADF/Cofilin entgegen (Hussey et al., 2006). Die Aktivität verschiedener Villin-Isoformen 
kann vom Ca2+-Spiegel, Calmodulin-abhängig (Yokota et al., 2000; 2003) oder -unabhängig 
sein (Huang et al., 2005). 
Fimbrine arbeiten unabhängig von der Ca2+-Konzentration und schützen Aktinfilamente vor 
der Profilin-induzierten Depolymerisation (Hussey et al., 2006; Thomas et al., 2009). 
Fimbrine besitzen zwei Aktin-bindende Domänen (Abb. 1. 4). Die zweite Aktin-bindende 
(ABD2)-Domäne wird, fusioniert an GFP, zur Visualisierung des Aktinzytoskeletts genutzt. 
Ein Modell von Galkin et al. (2008) schlägt vor, dass die Aktivierung der ersten Aktinbindenden 
Domäne (ABD1) zur Bindung eines zweiten Aktinfilaments durch die Bindung 
von ABD2 an ein Aktinfilament ausgelöst wird (Abb. 1. 5). In Arabidopsis wurde bisher nur 
die Funktion von AtFIM1 näher charakterisiert. Die atfim1-mRNA wird in allen 
Pflanzenteilen exprimiert (McCurdy und Kim, 1998). Die Verknüpfung von Aktinfilamenten 
durch AtFIM1 ist unabhängig von der Ca2+-Konzentration (Kovar et al., 2000). Trotz 
zahlreicher Untersuchungen von AtFIM1 in verschiedenen Pflanzengeweben kann nicht 
belegt werden, dass eine Überexpression von AtFIM1 eine verstärkte Bildung von 
Aktinbündeln bewirkt (Thomas et al., 2009). 
Die multifunktionellen Formine wurden bereits bei den Aktin-bindenden Proteinen erwähnt. 
In Arabidopsis wurden mehr als 20 Formin-Isoformen gefunden, die den Klassen I und II 
zugeordnet werden. Formine der Klasse I besitzen vermutlich ein N-terminales Membran-
Insertionssignal und eine transmembranale Region, die für eine Assoziation dieser Proteine 
mit der Membran sprechen (Abb. 1. 4). AtFH1 gehört zur Klasse I der Formine. AtFH1 kann 
am plus-Ende eines Aktinfilaments binden, Aktin-Polymerisationskeime bilden und 
Filamente zu längsgerichteten Strukturen verknüpfen (Abb. 1. 5) (Hussey et al., 2006). Die 
Überexpression von AtFH1 führt zur übermäßigen Aktinkabel-Bildung an der Zellmembran 


Einleitung 

von Pollenschläuchen (Cheung und Wu, 2004). AtFH1 und andere Formine der Klasse I 
spielen möglicherweise eine Rolle bei der Bildung von Aktinbündeln an der Plasmamembran. 
Eine ähnliche Rolle könnte AtFH6 spielen. Die atfh6-mRNA wird durch Nematodenbefall 
verstärkt exprimiert. Die befallenen Zellen besitzen außergewöhnlich dicke, an der 
Plasmamembran lokalisierte Aktinbündel mit längsgerichteter und transversaler Orientierung, 
nicht infizierte Wurzelzellen zeigen vor allem längsgerichtete Aktinfilamente. AtFH6 ist 
vermutlich für die Bildung dieser Aktinbündel mit verantwortlich, die den für 
Plasmamembran- und Zellwandsynthese erforderlichen Vesikelverkehr koordinieren (Favery 
et al., 2004). Die Überexpression von AtFH8 verursacht eine Zunahme des filamentösen 
Aktins in Wurzelhaaren und die vorzeitige Ausbildung von Aktinbündeln an der Spitze des 
Wurzelhaares. Die Überexpression von AtFH1 in Pollenschläuchen und AtFH8 in 
Wurzelhaaren führt zu ähnlichen morphologischen Defekten wie Anschwellen, Störung der 
Polarität und Wachstumsstillstand der Zellen (Hussey et al., 2006; Staiger und Blanchoin, 
2006; Thomas et al., 2009). 


Abb. 1. 4: Organisation der Domänen von Aktin-bündelnden Proteinen in Pflanzen. AtFH1 
besitzt 2 Formin-homologe Domänen (FH1 und FH2), ein Signalpeptid (SP) und eine 
transmembranale Domäne (TM). Lily ABP-135 weist die 6 Gelsolin-ähnlichen Domänen (G1-G6) und 
ein C-terminales headpiece (HP) auf, der Stern gibt den Ort einer potentiellen Dimerisierungsseite an. 
ABD1a steht für die Variante, das nur eine Aktin-bindende Domäne zwischen G1 und G2 existiert, 
alternativ dazu können 2 Aktin-bindende Domänen in G1 (ABD1b) und G2 (ABD1c) vorhanden sein. 
AtFIM1 besitzt 2 hintereinanderliegende Sequenzwiederholungen Calponin-homologer Domänen 
(CH1 und CH2 bzw. CH3 und CH4), sowie eine potentielle N-terminale Calcium-Bindestelle (EFhand). 
NtWLIM1 besitzt 2 LIM-Domänen, die LIM-Domäne besteht aus hintereinanderliegenden 
Zinkfinger-Motiven. ABD: Aktinbindende Domäne, nach Thomas et al. (2009). 

LIM-Proteine sind in tierischen Zellen an der Regulation verschiedener Prozesse wie der 

Genexpression oder der Organisation des Aktinzytoskeletts beteiligt. In Tabak konnte 

WLIM1, ein Protein, das zwei LIM-Domänen aufweist, identifiziert werden. WLIM1 kann 

Aktinfilamente binden, stabilisieren und bündeln (Abb. 1. 4). Die beiden LIM-Domänen von 

WLIM1 können unabhängig voneinander an Aktinfilamente binden und diese bündeln 


Einleitung 

(Abb. 1. 5). Die Überexpression von WLIM1 führt zu einer gesteigerten Bildung von 
Aktinbündeln in Blattepidermiszellen von Tabak und BY2-Zellen (Thomas et al., 2008, 
2009). Ähnliche Effekte wurden bei der transienten Überexpression von LILIM1 in Lilien-
Pollen gefunden. Die Überexpression von LILIM1 führt zu morphologischen Defekten, wie 
der Ausbildung mehrerer Pollenschläuche aus einem Pollenkorn. LILIM1 zeigt bei niedrigen 
pH-Werten und Ca2+-Konzentrationen eine höhere Affinität für Aktinfilamente (Wang et al., 
2008). 


Abb. 1. 5: Modelle für die Bildung von Aktinbündeln für die verschiedenen Proteinfamilien mit 
Darstellung der Polarität der Aktinfilamente. Villine: A) Bildung von Aktinfilament-Bündeln 
durch die Domänen ABD1a (Villin core) und ABD2 (Villin headpiece). B) Bündelung von 
Aktinfilamenten durch ABD1b und ABD1c, durch ABD2 hält Villin am ersten Aktinfilament fest. C) 
Aktinfilament-Bündelung durch ABD2 und anschließende Villin-Dimerbildung. Fimbrine: feste 
Verknüpfung von Aktinfilamenten durch die beiden proximal gelegenen ABDs, Fimbrin-
Dimerisierung ist nicht erforderlich. Formine: dieses Modell gilt für AtFH1. Nach der Bildung eines 
Polymerisationskerns wandert AtFH1 vom Ende des Aktinfilaments zur Seite und bildet ein neues 
Aktinfilament, dadurch kommt es zur Ausbildung antiparalleler Bündel. Nah gelegene, verlängerte 
Filamente zeigen die Tendenz miteinander zu interagieren und sich zu parallelen Bündeln 
zusammenzulagern, die durch weitere Aktin-bündelnde Proteine stabilisiert werden. LIM-Proteine: A) 
Beide LIM-Domänen verknüpfen ein Aktinfilamentpaar. A’) Das gleiche Model nach der 
Dimerbildung von LIM-Proteinen. B) Beide LIM-Domänen verknüpfen verschiedene 
Aktinfilamentpaare. B´) Das gleiche Model nach der Dimerisierung zweier LIM-Proteine (nach 
Thomas et al., 2009). 


Einleitung 

Hussey et al. (2006) ordnen den Elongationsfaktor-1a den Aktinfilament-bündelnden 
Proteinen zu. Der Elongationsfaktor-1a hat neben der Bindung von Aminoacyl-tRNAs an die 
Ribosomen auch die Fähigkeit in Eukaryoten an Mikrotubuli und Aktinfilamente zu binden 
und diese zu bündeln. Bei niedrigen pH-Werten (6,5) bindet ZmEF-1a aus Mais an 
Aktinfilamente und verhindert den Einbau von Aktin-Monomeren an beiden Enden. ZmEF-1a 
bindet auch bei höheren pH-Werten an Aktin und bündelt es, was darauf schließen lässt, dass 
eine pH-Wert-unabhängige Domäne vorhanden ist. Die Aktivität von ZmEF-1a wird durch 
ZmADF3 verstärkt beeinflusst und lässt auf eine Zusammenarbeit beider Proteine bei der 
Aktinzytoskelettregulation bei pH-Wert-Schwankungen schließen (Gungabissoon et al., 
2001). 

1. 8. 3 Funktion und Regulation des ARP2/3-Komplexes 
Der ARP2/3-Komplex stimuliert die Bildung neuer Aktinfilamente, indem er an vorhandene 
Filamente bindet und deren Verzweigung induziert. In tierischen Zellen führen zwei 
Signaltransduktionswege zur Aktivierung des ARP2/3-Komplexes durch RHO-GTPasen. Ein 
Weg führt über das Effektorprotein WASP (Wiskott-Aldrich-Syndrom-Protein), der andere 
über den pentameren WAVE-Komplex (WASP- und Verprolin-homologe-Proteine). In 
Pflanzen wurde bisher kein WASP-Protein gefunden. Die Komponenten des WAVE-
Komplexes konnten jedoch identifiziert werden, drei dieser Proteine (PIR121, NAP1 und 
BRICK1/HSPC300) zeigen deutliche Sequenzübereinstimmungen zu den tierischen 
Proteinen, die Sequenzübereinstimmung für SCAR/WAVE (1 bis 4) und ABI (1 bis 4) liegt 
allerdings nur bei 10 % (Berken und Hülskamp, 2006; Hussey et al., 2006). Der ArabidopsisWAVE-
Komplex wird vermutlich ebenso wie im tierischen System durch RHO-GTPasen 
(ROPs) aktiviert. Die Proteine PIR121 und das menschliche Homolog SRA-1 binden 
austauschbar und hochspezifisch an die aktiven Formen von tierischem RAC1 und ROP2 von 
Arabidopsis (Basu et al., 2004). Das Arabidopsis-SCAR2-Protein ist ein Aktivator des 
ARP2/3-Komplexes von Vertebraten und mit hoher Wahrscheinlichkeit ein Mitglied des 
WAVE-Komplexes (Basu et al., 2005). Die phänotypische Charakterisierung der 
Arabidopsis-Mutanten spk1 (SPIKE = ROP-GEF, s. 1. 5. 1), wave und arp2/3 sprechen für 
die Existenz eines SPK1-WAVE-ARP2/3 Signalweges. Die Charakterisierung der 
Doppelmutante spk1sra1 (SRA1 = PIR121) und die Mutante spk1 zeigen dieselben 
morphologischen Defekte, was darauf schließen lässt, dass sie im gleichen Signalweg 
auftreten und dieser Weg durch aktive ROP-GTPasen ausgelöst wird (Basu et al., 2008). 
Der ARP2/3-Komplex von Arabidopsis besteht aus 7 Untereinheiten, die Homologien zu den 
ARP2/3-Untereinheiten anderer Eukaryoten aufweisen. In Arabidopsis wurden sogenannte 
„distorted mutants“ gefunden, diese besitzen in den einzelnen Untereinheiten des ARP2/3Komplexes 
Mutationen, was bspw. zu deformierten Trichomen führt (Deeks et al., 2004). 
Aber auch die Morphologie der Wurzelhaare und Blattepidermiszellen wird durch Mutationen 


Einleitung 

im ARP2/3-Komplex beeinflusst (Hussey et al., 2006). Ein funktionsfähiger ARP2/3Komplex 
scheint für Pflanzen jedoch nicht so essentiell zu sein, wie für Saccharomyces 
cervisiae, Drosophila oder Säuger. Null-Mutanten in 5 Untereinheiten des ARP2/3Komplexes 
führen zu verschiedenen Zellformdefekten, die Pflanzen sind dennoch lebens- und 
vermehrungsfähig (Hussey et al., 2006; Berken und Hülskamp, 2006). Sogar der vollständige 
Verlust des F-Aktins hat weniger dramatische Auswirkungen als in tierischen Zellen oder 
Hefe. Auch ohne F-Aktin sind Pflanzenzellen zur Zellteilung, postembryonalen Entwicklung 
und Morphogenese fähig. Die Zellelongation ist jedoch stark F-Aktin-abhängig, so dass der 
Verlust des F-Aktins zu Zwergwuchs in Arabidopsis führt (Baluška et al., 2001). 

1. 9 Die Symbiose als Lebensgemeinschaft 
Pflanzen sind in der Regel an einen festen Standort gebunden, dennoch können sie mit den 
verschiedensten Organismen interagieren. Eine besonders alte Beziehung stellt die 
Mykorrhiza dar. Bei der Mykorrhiza handelt es sich um eine mutualistische Symbiose 
zwischen Pflanzenwurzeln und Pilzen zu beiderseitigem Nutzen. Die Besiedelung des Landes 
vor ca. 460 Millionen Jahren durch Pflanzen wurde vermutlich erst durch die Ausbildung der 
Mykorrhiza ermöglicht, wodurch die Wahrscheinlichkeit bei Trockenheit und 
Nährstoffmangel zu überleben, deutlich stieg (Pirozynski und Malloch, 1975; Harrison, 
2005). Mykorrhizapilze steigern die Aufnahmefähigkeit der Pflanze für Wasser und 
essentielle Elemente wie Phosphor und Stickstoff. Sie bieten außerdem Schutz vor 
pathogenen Pilzen und Nematoden. Im Gegenzug erhält der Pilz von der Pflanze 
Kohlenstoffverbindungen. Man unterscheidet zwei Mykorrhiza-Formen, die Ektomykorrhiza, 
bei der der Pilz die Wurzelzellen umhüllt und die Endomykorrhiza, bei welcher der Pilz in die 
Wurzelzellen eindringt. Die meisten Ektomykorrhizen werden mit Basidiomyzeten, seltener 
auch mit Ascomyzeten gebildet. Die Ektomykorrhiza ist oft hochspezifisch, d. h. eine 
bestimmte Baumart kann nur mit einer spezifischen Pilzart eine Mykorrhiza bilden. 
Die Endomykorrhiza ist am weitesten verbreitet, sie tritt bei 80 % aller Gefäßpflanzenarten 
auf und ist meist unspezifisch. Die wichtigste Form der Endomykorrhiza ist die vesikulärarbuskuläre 
(VA)-Mykorrhiza. VA-Pilze sind obligat biotroph und können ihren 
Lebenszyklus ohne einen Pflanzenpartner nicht vollenden. Alle VA-Pilze sind Mitglieder der 
Abteilung Glomeromycota (Harrison, 2005). Sonderformen der Endomykorrhiza stellen die 
Mykorrhizen der Orchidaceae und der Ericaceae dar. 
Pflanzen können auch mit Bakterien in einer mutualistischen Beziehung vergesellschaftet 
sein, z. B. bilden Leguminosen mit Stickstoff-fixierenden Bakterien (zusammengefaßt zu 
Rhizobien) oder Alnus sp. mit der Stickstoff-fixierenden Gattung Frankia (Actinomyzeten) 
Wurzelknöllchen aus. Für VA-Mykorrhizen und Wurzelknöllchen-bildende Bakterien scheint 
es ein gemeinsames Symbiose-Programm zu geben, das durch eine Anzahl von Genen, die für 
eine Interaktion der Organismen erforderlich sind, definiert wird. Zu diesen gemeinsamen 


Einleitung 

Symbiose-Genen gehören z. B. Rezeptorkinasen (SYMRK, DMI2, NORK), Kationenkanal-
Proteine (CASTOR, POLLUX, DMI1) und eine Ca2+/Calmodulin-abhängige Kinase 
(CCaMK, DMI3). Die Abb. 1. 6. gibt einen Überblick über die konservierten genetischen 
Programme, die bei der Wurzelknöllchen-Symbiose mit Stickstoff-fixierenden Bakterien der 
Gruppe Rhizobia und der Gattung Frankia auftreten. Nur für die Rhizobium-legume symbiosis 
(RLS) sind bisher Gene bekannt, die für die Erkennung zwischen Pflanze und Pilz notwendig 
sind. Die rhizobiellen Nod-Faktoren werden durch LysM-Kinasen (NFRs) der Pflanzen 
erkannt. Pflanzen, die eine VA-Mykorrhiza oder eine Mykorrhiza mit Actinomyzeten 
ausbilden, besitzen vermutlich andere Gene für die Erkennung bakterieller und pilzlicher 
Signale. Bisher sind mindestens 7 Gene bekannt, die für die Endosymbiose von Pilzen und 
Bakterien mit Leguminosen (Lotus japonicus) nötig sind und möglicherweise auch in der VA-
Mykorrhiza von Angiospermen konserviert auftreten. Die Rezeptorkinase SYMRK steht 
vermutlich am Beginn dieses Programms und ist auch für die Actinorhiza erforderlich. In der 
RLS und in der VA-Mykorrhiza treten spezifische Änderungen des Ca2+-Spiegels durch die 
intrazelluläre Infektion auf, dadurch werden vermutlich nachgeschaltete Signalwege aktiviert. 
Während der RLS führt die Aktivierung des Symbiose-Programms wahrscheinlich zur 
Aktivierung der Cytokinin-Synthese in der Pflanze. Der Cytokinin-Rezeptor LHK1 (CRE in 

M. truncatula) spielt eine zentrale Rolle in der Aktivierung der Wurzelknöllchen-Ausbildung. 
In der Leguminose L. japonicus, ist die kontinuierliche Signalgebung durch die 
fortschreitende intrazelluläre Infektion (evtl. durch Cytokinin) für den Erhalt und die 
vollständige Ausbildung der Wurzelknöllchen notwendig. Cytokinin spielt auch bei der 
Induktion der Seitenwurzeln eine Rolle (LR: lateral root). Die Ausbildung von Seitenwurzeln 
weist strukturelle Ähnlichkeit mit Actinorhiza-Knöllchen auf. So führt ein relativer Anstieg 
des kortikalen Cytokinins zu unterschiedlichen Reaktionsmustern: die Knöllchenbildung wird 
induziert, die Ausbildung von Seitenwurzeln hingegen wird unterdrückt. 
In der Nicht-Symbiose Pflanze Arabidopsis wurden die drei Histidin-Kinasen AtLHK1, 
AtLHK2 und AtLHK3 als mögliche orthologe Kinasen zu LjLHK1 untersucht. AtLHK1, 
AtLHK2 und AtLHK3 sind in die Ausbildung von Seitenwurzeln involviert (Abb. 1. 6) 
(Markmann und Parniske, 2009). 
Die Beziehung zwischen Pflanze und Symbiont kann ihren mutualistischen Charakter 
verlieren, wenn der Symbiont sich beispielsweise übermäßig ausbreitet oder die Pflanze in 
eine Mangelsituation gerät. Dann kommt es zur Aktivierung von Abwehrmaßnahmen gegen 
den Symbionten, was zum Auftreten von Krankheitssymptomen an der Pflanze und zum 
Ausschluß des ehemaligen Partners führen kann (Kogel et al., 2006; Zhao und Qi, 2008; 
Oelmüller et al., 2009). Es ist bekannt, dass Pflanzen bei der Erkennung von Pathogenen und 
Symbionten teilweise ähnliche Gene/Gengruppen aktivieren. Dies ist ein Hinweis auf eine 
gemeinsame Entwicklung während der Evolution. Pflanzen erkennen pathogene und 
symbiotische Mikroorganismen durch die Wahrnehmung von sogenannten Pathogen-
Assoziierten Molekularen Mustern (pathogen-associated molecular patterns: PAMPs) durch 

Einleitung 

extrazelluläre Rezeptor-ähnliche Kinasen (RLKs). Die Erkennung von Flagellin durch den 
Rezeptor AtFLS2 in Arabidopsis löst in der Zelle eine Reaktion aus, die als PAMP-triggered 
immunity (PTI) bezeichnet wird (Jones und Dangl, 2006). Dieser Prozess findet über die 
Aktivierung der MAPK-Signalkaskade statt und löst die Aktivierung von 
Transkriptionsfaktoren aus, die zur PAMP-triggered immunity-Reaktion der Pflanze führen. 
Entscheidend für eine erfolgreiche Besiedelung und Ausbreitung von Symbiont oder 
Pathogen ist die Abgabe von spezifischen Effektoren, die ein Überwinden der Immunität der 
Pflanze ermöglichen (Zhao und Qi, 2008). 


Abb. 1. 6: Die Ausbildung einer Wurzelknöllchen-Symbiose mit Stickstoff-fixierenden Bakterien 
der Gruppe Rhizobia und der Gattung Frankia weist konservierte genetische Programme auf. 

Die für eine intrazelluläre Infektion erforderlichen Gene a) einer arbuskulären Mykorrhiza (AM), b) 
einer Rhizobium-Leguminosen Symbiose (RLS) und c) einer Symbiose mit Frankia (AR: 
Aktinorhiza). d) Die Ausbildung von Wurzelknöllchen zeigt Ähnlichkeit mit der Ausbildung von 
Seitenwurzeln (LR: lateral root). (nach Markmann und Parniske, 2009) 


Einleitung 

1. 9. 1 Piriformospora indica 
P. indica wird auf Grund phylogenetischer Analysen auf rDNA (ribosomale DNA)-Basis der 
Ordnung Sebacinales zugeordnet (Selosse et al., 2007; Weiss et al., 2004). Die Sebacinales 
gehören zu den basalen Hymenomyzeten (Basidiomyzeten). Sie sind weltweit verbreitet und 
weisen zahlreiche bekannte mykorrhizabildende Pilze auf, die z. B. Orchidaceae, 
Lebermoose, Pinaceae und Ericaceae besiedeln (Weiss et al., 2004). 
P. indica ist ein endophytisch lebender Pilz, der in der indischen Thar-Wüste entdeckt wurde 
und die verschiedensten Pflanzenarten besiedeln kann, dazu gehören z. B. Arabidopsis, 
(Peskan-Berghöfer et al., 2004), Gerste und Weizen (Waller et al., 2005, Baltruschat et al., 
2008), Tabak, Mais, Petersilie (Varma et al., 1999), Bäume wie die Pappel (Kaldorf et al., 
2005) und Orchideen (Varma et al., 1999). Die Interaktion von P. indica mit Arten aus 
zahlreichen Pflanzenfamilien legt die Vermutung nahe, dass es sich um eine sehr 
ursprüngliche Form der Interaktion handelt. P. indica lebt, wie viele Mykorrhiza-Pilze, mit 
Bakterien in einer Gemeinschaft zusammen (Frey-Klett et al., 2007). Es handelt sich dabei 
um das a-Proteobakterium Rhizobium radiobacter (Sharma et al., 2008). 
Im Gegensatz zu VA-Pilzen kann P. indica leicht in sterilen Kulturen ohne eine Wirtspflanze 
kultiviert werden. Er bildet asexuelle Chlamydosporen mit 8-25 Kernen in den Wurzelzellen 
und auf der Wurzeloberfläche, sexuelle Stadien wurden bisher nicht nachgewiesen (Verma et 
al., 1998; Varma et al., 1999). P. indica besiedelt ausschließlich Pflanzenwurzeln und wächst 
dort inter- und intrazellulär im Bereich der Wurzelrinde (Varma et al., 1999). 
Die Besiedelung der Pflanze durch P. indica führt zu einer Zunahme der Biomasse, des 
Saatguts (Peskan-Berghöfer et al., 2004; Shahollari et al., 2005). Der Pilz kann z. B. in Gerste 
(Hordeum vulgare) die Resistenz gegen das Wurzelpathogen Fusarium culmorum stimulieren 
oder die systemische Resistenz von Gerste gegen Blumeria graminis und gegen 
Golovinomyces orontii in Arabidopsis induzieren (Waller et al., 2005; Deshmukh et al., 2006; 
Stein et al., 2008). P. indica kann die Pflanze auch vor abiotischem Stress, wie hohen 
Salzkonzentrationen oder Trockenheit schützen (Waller et al., 2005; Sherameti et al., 2008a; 
Baltruschat et al., 2008; Vadassery et al., 2009b). Eine Inokulation von P. indica führt in 
Stecklingen von Pelargonium x hortorum und Euphorbia pulcherrima zu einer größeren 
Anzahl und Länge von Adventivwurzeln noch bevor der Pilz physischen Kontakt zu den 
Pflanzen aufgenommen hat (Druege et al., 2007). 
Die Interaktion mit P. indica führt zu einer Abnahme der Verfügbarkeit von Kohlenstoff- und 
Stickstoff-Assimilaten in den Wurzeln der Gerste (Schäfer et al., 2009). Die Kultivierung mit 
dem Pilz wirkt sich positiv auf die Aufnahme von Phosphat (Shahollari et al., 2005) in 
Arabidopsis und auf die Aufnahme von Nitrat in Tabak und Arabidopsis aus (Sherameti et al., 
2005). Wird P. indica mit den Wurzeln der Gerste kultiviert, wirkt sich dies auf die 
Regulation der Genexpression aus. Die größte Gruppe der durch P. indica regulierten Gene 
bilden Stress-assoziierte Gene. Zahlreiche Gene der Signaltransduktion, des Sekundär-
Metabolismus und der Proteinbiosynthese werden ebenfalls reguliert. Der Pilz greift auch in 

Einleitung 

den Phytohormonhaushalt der Pflanze ein. Das betrifft vor allem Auxin, ABA und Gibberellin 
(Schäfer et al., 2009). P. indica produziert geringe Mengen Auxin, dies führt in der 
Beziehung mit Arabidopsis jedoch nicht zu einer Veränderung der Auxin-Konzentration in 
der Pflanze. Ebenso wenig wird die Expression Auxin-regulierter Gene in kolonisierten 
Wurzeln verändert. Das Phytohormon Cytokinin produziert der Pilz in relativ großen 
Konzentrationen. Cytokinin-regulierte Gene werden in kolonisierten Arabidopsis-Wurzeln 
differentiell exprimiert. In kolonisierten Wurzeln sind erhöhte Cytokinin-Konzentrationen der 
auch im Pilz vorkommenden Isomere iP und cZ-Cytokinin, nachweisbar. Werden die 
Cytokinin-Rezeptoren CRE1 und AHK2 inaktiviert, bleibt der wachstumsfördernde Effekt 
aus, so dass anzunehmen ist, dass die Rezeptorkombination CRE1/AHK2 für die Interaktion 
eine Rolle spielt (Vadassery et al., 2008). 

1. 9. 2 Molekulare Mechanismen der Interaktion von Arabidopsis mit P. indica 
Die Modellpflanze Arabidopsis gehört zur Familie der Brassicaceae, einer der wenigen 
Familien, die normalerweise keine Mykorrhizen ausbildet. Dennoch kann Arabidopsis mit 

P. indica interagieren und ermöglicht dadurch die molekulare Analyse pflanzlicher Gene, die 
für diese Beziehung von Bedeutung sind und möglicherweise auch Auskunft über die 
Evolution von Symbiose-Genen geben können. 
Binden mikrobielle Effektoren an einen spezifischen Rezeptor, ist eine der ersten Reaktionen 
der Pflanzenzelle die Änderung des zytosolischen Ca2+-Spiegels, der durch den Einstrom von 
Ca2+ aus Speicherkompartimenten wie dem Endoplasmatischen Retikulum, der Vakuole oder 
dem extrazellulären Raum bedingt ist. Kalzium ist ein bedeutender second messenger in der 
pflanzlichen Signaltransduktion, der durch zahlreiche biotische und abiotische Signale 
aktiviert wird (Sanders et al., 2002). Eine spezifische Ca2+-Signatur tritt auch bei der VA-
Mykorrhiza und in der Rhizobien-Leguminosen-Interaktion auf (Markmann und Parniske, 
2009). Ein aus P. indica isolierter Zellwandextrakt führt u. a. zu einem schnellen Anstieg des 
intrazellulären Ca2+-Spiegels in Arabidopsis-Wurzeln, zu einer Veränderung der 
Genexpression und der Aktivierung von MAP-Kinasen (Vadassery et al., 2009a). 
Von Bedeutung für die Interaktion von P. indica mit Arabidopsis ist auch die ß-Glukosidase 
PYK10, die vermutlich eine übermäßige Besiedelung der Wurzeln durch den Pilz verhindert 
und dadurch eine Abwehrreaktion unterdrückt (Sherameti et al., 2008b). Die Kultivierung mit 
dem Pilz führt zu einer verstärkten Expression und Modifikation eines MATH-Domänen 
aufweisenden Proteins (meprin and TRAF [tumor necrosis factor receptor associated factor] 
homology) (Peskan-Berghöfer et al., 2004). Diese transiente Modifikation tritt auf, bevor der 
Pilz und die Pflanze physischen Kontakt zueinander haben (Oelmüller et al., 2005). Zwei 
weitere Proteine, die für die Interaktion eine Rolle spielen, sind LRR1 und LRR2. Beide 
Proteine weisen leucine-rich repeat-Motive auf und sind in lipid rafts und in 
Plasmamembran-Mikrodomänen von Arabidopsis-Wurzeln lokalisiert. Die mRNA von lrr1 

Einleitung 

wird im frühen Stadium der Interaktion durch P. indica hochreguliert. Die Inaktivierung von 
LRR2 führt dazu, das die verstärkte Expression von lrr1 und die Wachstumsförderung durch 
den Pilz ausbleiben (Shahollari et al., 2005; 2007). 

AA B 
Abb. 1. 7: Kultivierung des Arabidopsis-Wildtyps mit P. indica (A) und das Wachstum des Pilzes 
(B). A: Der Arabidopsis-Wildtyp wurde für 14 Tage gemeinsam mit P. indica auf PNM-Medium 
kultiviert. B: Ein 5 mm großes Stück von P. indica (in der Bildmitte) diente zur Anzucht des Pilzes auf 
Kaefers-Medium. Das Bild zeigt den Pilz nach einer Kultivierungszeit von 3 Wochen. 

1. 10 Zielsetzung 
Die Interaktion des endophytisch lebenden Pilzes Piriformospora indica mit der 
Modellpflanze Arabidopsis fördert das Pflanzenwachstum und ermöglicht die molekulare 
Analyse von Genen, die für die Ausbildung dieser symbiotischen Beziehung von Bedeutung 
sind. 
Der erfolgreichen Besiedelung von Arabidopsis durch P. indica geht eine Rezeptor-
vermittelte Erkennung pilzlicher Botenstoffe voraus. Über den möglichen Rezeptor und die 
anschließende Weiterleitung des Signals, die zur Aktivierung genetischer Programme führt 
und so über die Ausbildung einer symbiotischen Beziehung oder einer Abwehrreaktion 
entscheidet, ist bisher wenig bekannt. Den kleinen G-Proteinen kommt in der pflanzlichen 
Signaltransduktion eine bedeutende Rolle zu. Eine Familie der kleinen G-Proteine, die ROP-
Familie, kontrolliert eine Vielzahl von lebenswichtigen Signalwegen im Lebenszyklus einer 
Pflanze. ROP-Proteine stehen vermutlich mit Rezeptorkinasen in engem Kontakt und könnten 
daher an der Weiterleitung des eingehenden Pilz-Signals direkt beteiligt sein. Auf Grund der 
Vermutung, dass ROP1 und/oder ROP6 für die Ausbildung einer symbiotischen Beziehung 
zwischen Arabidopsis und P. indica eine Bedeutung haben, wurden die folgenden Ziele 
gesetzt: 


Einleitung 

1. Es sollte festgestellt werden, ob die knock-out-Mutation bzw. die Überexpression von rop1 
und rop6 zu einer veränderten Reaktion auf den Pilz führt. Daher sollten homozygote rop1und 
rop6-knock-out-Mutanten sowie rop1-und rop6-Überexpressionsmutanten hergestellt 
und in Interaktions-Experimenten mit P. indica getestet werden. 
2. Es sollte untersucht werden, ob ROP1 und ROP6 redundante Funktionen aufweisen, da dies 
für einige ROP-Proteine für das Wurzelhaar- und das Pollenschlauchwachstum vermutet 
wird. Dafür sollte eine rop1rop6-Doppelmutante erzeugt und ebenfalls in Interaktions-
Experimenten mit dem Pilz untersucht werden. 
3. RIC4 ist ein bekannter Effektor von ROP1. Es sollte festgestellt werden, ob RIC4 für die 
Beziehung von Arabidopsis zu P. indica von Bedeutung ist. Dafür sollte eine ric4-knock-out-
Mutante hergestellt und in Interaktions-Experimenten getestet werden. 
4. Die Erkennung eines Pilz-Signals führt in Pflanzen zur Veränderung der Genexpression. Es 
sollte untersucht werden, ob die P. indica induzierte Veränderung der Genexpression 
Unterschiede zwischen dem Wildtyp und den rop-knock-out-Mutanten aufweist. 
5. ROP-Proteine sind an der Regulation des Aktinzytoskeletts beteiligt. Da es beim Befall 
durch Pathogene in Pflanzenzellen zur Umstrukturierung des Aktinzytoskeletts kommt, sollte 
untersucht werden, ob P. indica in Arabidopsis ebenfalls eine Umstrukturierung des 
Aktinzytoskeletts auslöst und ob diese Reaktion in den rop-knock-out-Mutanten verändert ist. 
6. Der aus P. indica isolierte Zellwandextrakt führt in Arabidopsis-Wurzeln zu einer 
transienten Erhöhung des zytosolischen Ca2+-Spiegels. Da ROP-Proteine wahrscheinlich an 
der Regulation des Ca2+-Spiegels während des Pollenschlauch- und Wurzelhaarwachstums 
beteiligt sind, sollte untersucht werden, ob diese Reaktion auf P. indica auch in rop-knockout-
Mutanten vorhanden ist. 

Material und Methoden 

2 Material und Methoden 


2. 1 Materialien 
2. 1. 1 Geräte 
Autoklav: 
Brutwärmeschrank: 
Digitalkamera: 
Varioklav. (H+P Labortechnik, München) 
Tritec.t (Tritec., Hannover) 
Canon EOS 350D 

Elektrotransformationsgerät: Easyject EQUIBIO (PEQLAB Biotechnologie GmbH, 

Erlangen) 
Geldokumentation: DeVisionG (Decon Science Tec GmbH, Hohengandern) 
Gelelektrophorese: Biometra Power Pack P25 (Biometra, biomedizinische 

Analytik GmbH, Göttingen) 
Luminometer: Luminoscan Ascent (Thermo Electron corporation, 
Waltham, MA, USA) 

Mikroskope: 
Leitz BIOMED (Mikrovid GmbH, Arnsberg) 
LEICA MZ6 (Leica, Wetzlar) 
Axiovert 135 (Carl Zeiss, Jena) 
Axiovert 200M mit ApoTome (Carl Zeiss, Jena) 

PCR-Maschinen: 
Primus 96 plus (MWG-Biotech AG, Ebersberg) 

Eppendorf Mastercycler gradient (Eppendorf, Hamburg) 
Photometer: BioPhotometer (Eppendorf, Hamburg) 
real-time PCR-Gerät: MX3000P (Stratagene La Jolla, CA, USA) 
Schüttler: Inkubator Shaker (New Brunswick Scientific CO., NJ, USA) 

GFL 3015 (Burgwedel) 
Sequenziergerät: LI-COR 4200 (Biosciences GmbH, Bad Homburg) 
Thermomixer: Eppendorf Thermomixer 5437 (Eppendorf, Hamburg) 
Tisch-Thermostat: Eppendorf ThermoStat plus (Eppendorf, Hamburg) 
Vakuumkonzentrator: Savant SPD 111V (GMI, Ramsey, MN, USA) 
Waagen: BP 161P, BP 610 (Sartorius, Göttingen) 
Wasseranlage: Milli-Q RG (Firma Millipore, Schwalbach) 
Zentrifugen: HERMLE Z 300K (HERMLE, Wehingen) 

Eppendorf Centrifuge 5415C (Eppendorf, Hamburg) 


Material und Methoden 

2. 1. 2 Chemikalien 
Für molekularbiologische Untersuchungen wurden Materialien und Chemikalien von 
besonders hoher Reinheit verwendet. Coelenterazin wurde von der PJK-GmbH aus 
Kleinblittersdorf bezogen. Chemikalien in p. a. Qualität wurden von den folgenden Firmen 
verwendet. 

Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg 
Carl Roth GmbH, Karlsruhe 
Duchefa Biochemie B.V., Haarlem, Niederlande 

Merck Biosciences GmbH, Schwalbach 
SERVA Electrophoresis GmbH, Heidelberg 
Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen 
PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen 

2 .1. 3 Enzyme 
DNase 
Pfu-DNA-Polymerase 
Restriktionsendonukleasen 
RNase 
Taq-DNA-Polymerase 
T4-DNA Ligase 

2. 1. 4 Kits und Fertigreagentien 
Fermentas Life Sciences, St. Leon-Rot 
Fermentas Life Sciences, St. Leon-Rot 
Fermentas Life Sciences, St. Leon-Rot 
Fermentas Life Sciences, St. Leon-Rot 
Fermentas Life Sciences, St. Leon-Rot 
Fermentas Life Sciences, St. Leon-Rot 

CycleReaderTM Auto DNA Sequencing Kit Fermentas Life Sciences, St. Leon-Rot 

GeneJETTM Plasmid Miniprep Kit 
iQ SYBR Green Super Mix 
Omniscript. Reverse Transcription Kit 
pCR./GW/TOPO. TA Cloning. Kit 
pGEM.-T Vektor System 
Qiaex. II Gel Extraktionskit 
QIAprep. Spin Miniprep Kit 
RNeasy. Plant Mini Kit 
RNase-Free DNase Set 

Fermentas Life Sciences, St. Leon-Rot 
Bio-Rad Laboratories GmbH, München 
Qiagen GmbH, Hilden 
Invitrogen GmbH, Karlsruhe 
Promega GmbH, Mannheim 
Qiagen GmbH, Hilden 
Qiagen GmbH, Hilden 
Qiagen GmbH, Hilden 
Qiagen GmbH, Hilden 


Material und Methoden 

2. 1. 5 Molekulare Marker 
GeneRulerTM DNA Ladder Mix Fermentas Life Sciences, St. Leon-Rot 
. DNA/ EcoRI+HindIII (verdaut) Fermentas Life Sciences, St. Leon-Rot 
peqGOLD Leiter-Mix PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen 

2. 1. 6 Nukleotide und Oligonukleotide 
Nukleotide: 
dNTP-Set Fermentas Life Sciences, St. Leon-Rot 


Oligonukleotide: 
Oligonukleotide zur reversen Transkription der mRNA: 
Oligo(dT)18 Primer Fermentas Life Sciences, St. Leon-Rot 


Alle weiteren verwendeten Oligonukleotide wurden von der Firma MWG-Biotech AG 
(Ebersberg) bezogen. 


Oligonukleotide zur Analyse der T-DNA-Insertionslinien und für RT-PCR 
Bezeichnung Sequenz 
LBa1 5’-TGG TTC ACG TAG TGG GCC ATC G-3’ 
T-DNA fw. 5’-GAG ACG GGC AAC AGC TGA TTG CCC TTC-3’ 
T-DNA rev. 5’-TCT CCA CTG ACG TAA GGG ATG ACG CAC-3’ 
LP-ROP1 5’- ATG AGC GCT TCG AGG TTC GTA AAG-3’ 
RP-ROP1 5’-TCA TAG AAT GGA GCA TGC CTT CTG-3’ 
LP-ROP2 5’-ATG GCG TCA AGG TTT ATA AAG TGT G-3’ 
RP-ROP2 5’-TCA CAA GAA CGC GCA ACG GTT C-3’ 
LP-ROP3 5’-ATG AGC GCT TCG AGG TTC ATA AAG-3’ 
RP-ROP3 5’-TTA CAA AAT GGA GCA GGC TTT TTG-3’ 
LP-ROP4 5’-ATG AGT GCT TCG AGG TTT ATA-3’ 
RP-ROP4 5’-TCA CAA GAA CAC GCA GCG GT-3’ 
LP-ROP6 5’-ATG AGT GCT TCA AGG TTT ATC-3’ 
RP-ROP6 5’-TCA GAG TAT AGA ACA ACC TTT C-3’ 
LP-ROP10 5’-ATG GCT TCG AGT GCT TCA AAA T-3’ 
RP-ROP10 5’-TCA ATT CTT CCC ACA CAG AAT G-3’ 
LP-RIC3 5’-ATG GCG ACC GTG AAA GGC CTT C-3’ 
RP-RIC3 5’-TTA CTC TTT GTC ACT GAT ATT AT-3’ 
LP-RIC4 5’-TTA TAA AGT TGG ATG AAG ATG AGG G-3’ 
RP-RIC4 5’-ATG AGA GAT AGA ATG GAG AGA CTT G-3’ 



Material und Methoden 

Oligonukleotide zur Sequenzierung 

Bezeichnung Sequenz 
M13 IRD700 5’-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3’ 
M13 IRD800 5’-CAG GAA ACA GCT ATG ACC-3’ 
M13 uni (-21) 5’-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3’ 
M13 rev (-29) 5’-CAG GAA ACA GCT ATG ACC-3’ 
GW1 5’-GTT GCA ACA AAT TGA TGAGCA ATG C-3’ 

Oligonukleotide für den Vektor pB2GW7,0 
pB2GW7-fwd 5’-GCA CTA GTG ATA TCA CAA GTT TG-3’ 


Oligonukleotide für die real-time PCR 
Bezeichnung Sequenz 
ACT2 fw 5’-GCT GGA TTT GCA GGA GAT GAT GCT C- 3’ 
ACT2 rev 5’-CAC ACC ATC ACC AGA ATC CAG CAC- 3’ 
At1g02930-FP 5’-CCT TCT CTC AAC TGG CAA GG- 3’ 
At1g02930-RP 5’-GAG CAG AAG GCC TTG AAG TG- 3’ 
LP-Calmodulin-RT 5’-CAA GAT CCT GGA TTT GTC GTA AC- 3’ 
RP-Calmodulin-RT 5’-CGT TCT CAT CCT CCT CGT TAT TC- 3’ 
LP-Chitinase-RT 5’- ATG CGG CCT TGG CTG GTC CAT C- 3’ 
RP-Chitinase-RT 5’- ATA TGG CTA CTG TGG TAC GAC CG- 3’ 
LP-Germin RT 5’-GCT TCG GAC CCA AGC TCT CTT CAG- 3’ 
RP-Germin RT 5’-CAA GAC CTC GGA GGC ACG TGG GT- 3’ 
GapC-RP 5’-CAA GGC AGT TAG TGG TGC AGC TA- 3‘ 
GapC-RT-RP 5’- CTT CAA GTG AGC TGC AGC CTT GTC- 3’ 
GapC-LP 5’- CTA GAG TTG TTC TCC AGA GGG AC- 3’ 
LP-GST16b 5’-CTT CCA CCA GGA GAG TCC TCA T- 3’ 
RP-GST16 5’- GTA TTC CAA TGG ACA TGA TTG CAT- 3’ 
LP-Profilin 5’- CGC TAT CGT TGG TCA TGA CGG- 3’ 
RP-Profilin 5’- CCA TGT TGC ACT GTC CTG GTG- 3’ 
LP-Trypsin-RT 5’-ATG GCA AAG GCT ATC GTT TCC ATC- 3’ 
RP-Trypsin-RT 5’-CTG TGG AGT ATC GTC GCA GAA G- 3’ 
ROP1-RT-RP 5’-CCA GGC GCG TAA TGT TTC AAC TC- 3’ 
LP-ROP1 5’- ATG AGC GCT TCG AGG TTC GTA AAG- 3’ 
ROP2-LP-RT 5’-GGT GTT GCC ATT ATC CTT GTT G- 3’ 
RP-ROP2 5’-TCA CAA GAA CGC GCA ACG GTT C- 3’ 
LP-ROP3 5’-ATG AGC GCT TCG AGG TTC ATA AAG- 3’ 
ROP3-RP-RT 5’-GGA GAC ATT CTC ATA ACT AGC C- 3’ 
ROP6-RT-LP 5’-GTC TTC TCA TCT CCT ACA CTA GC- 3’ 



Material und Methoden 

ROP6-RT-RP 5’- GGA GCA TAA TGT CTC AGT TCA GG- 3’ 
ROP11-LP-RT 5’-GAG TTC CCC TTG TCC TTG TTG G- 3’ 
RP-ROP11 5’-TCA ATG CCG AGT CAC TAT CCT- 3’ 
RIC2-LP-RT 5’-CAA CGG TGC TAA TAT CTC AGA TGG T- 3’ 
RP-RIC2 5’-TCA GAC GAC GGT GCC GGT GAG- 3’ 
RIC4-LP-RT 5’-CGT TCG TTG GAA CTC CTA TCT C- 3’ 
RP-RIC4 5’-ATG AGA GAT AGA ATG GAG AGA CTT G- 3’ 


Oligonukleotide für den Nachweis von Apoaequorin (pMAQ2) in Arabidopsis 
Bezeichnung Sequenz 
AEQ-fwd 5’-ATG AAA TAT GGT GTG GAA ACT GAT T- 3’ 
AEQ-rev 5’-GTT GTC TTG TCA TCT CAT CAA CAT C- 3’ 


2. 1. 7 Bakterienstämme, Vektoren und Klone 
Agrobakterium tumefaciens GV3101/pMP90 

E. coli DH5. (Hanahan, 1983) Invitrogen GmbH, Karlsruhe 
E. coli XL1-Blue (Bullock et al., 1987) Stratagene, Amsterdam, Niederlande 
E. coli TOP10 
Invitrogen GmbH, Karlsruhe 
E. coli NovaBlue 
Novagen, Darmstadt 
Vektoren 
pENTRTM (Gateway. 
entry vector) Invitrogen GmbH, Karlsruhe 
pB2GW7,0 Plant Systems Biology, Ghent, Belgien 
pGEM. 
-T-Vektor Promega GmbH, Mannheim 

2. 1. 8 Standardmedien und Lösungen 
Hoagland-Medium: 
1,6 g/l Hoagland Salze, 10 g/l Saccharose, 0,5 g/l MES, 10 g/l Agar, 

pH 5,7 
LB: 10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 10 g/l NaCl, pH 7,0 
LB-Agar: 10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 10 g/l NaCl, pH 7,0, 1,5 % (w/v) 

Agar 

Kaefers-Medium: 
20 g/l Glukose, 2 g/l Pepton, 1 g/l Hefeextrakt, 1 g/l Caseinhydrolysat, 
50 ml Makroelementlösung, 10 ml Spurenelementlösung, 1 ml FeEDTA-
Lösung, 1 ml Vitaminlösung; für Festmedium 15 g/l Agar, 
pH 6,5 

Fe-EDTA-Lösung: 
0,556 g FeSO4 x 7 H2O in 50 ml H2O und 0,744 g EDTA in 50 ml H2O 
lösen, beide Lösungen auf 60 °C erwärmen, unter Rühren mischen 


Material und Methoden 

Makroelementlösung: 12 g/l NaNO3, 10,4 g/l KCl, 10,4 g/l MgSO4 x 7 H2O, 30,4 g/l KH2PO4 

Spurenelementlösung:2,2 g/l ZnSO4 x 7 H2O, 1,1 g/l Borsäure, 0,5 g/l MnSO4 x 7 H2O, 
0,16 g/l CuSO4 x 5 H2O, 0,16 g/l CoCL2 x 5 H2O, 0,11 g/l Ammonium- 
molybdat 

Vitaminlösung: 
0,1 g/l Thiamin, 0,04 g/l Glycin, 0,01 g/l Nikotinsäure, 0,01 g/l 
Pyridoxin 

PNM-Medium: 
5 mM KNO3, 2 mM MgSO4, 2 mM Ca(NO3)2, 0,01 µM FeSO4, 70 µM 
H3BO3, 14 µM MnCl2, 0,5 µM CuSO4, 1 µM ZnSO4, 0,2 µM 
Na2MoO4, 0,01 µM CoCl2, 10,5 g/l Agar, pH 5,6 

SOC-Medium: 20 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 0,5 g/l NaCl, 10 ml/l KCl (0,25 M), 
5 ml/l MgCl2 (2 M), 20 ml/l Glucose (1 M), pH 7,0 
YEB-Medium: 5 g/l Rinderextrakt, 5 g/l Pepton, 5 g/l Saccharose, 1 g/l Hefeextrakt, 


0,5 g/l MgSO4 x 7H2O (pH 7,2) 
DNA-Lyse-Puffer: 220,42 g/l Harnstoff, 17,54 g/l NaCl, 6,06 g/l Tris (pH 8,0), 10 g/l 

Laurylsarcosin, 7,44 g/l EDTA, pH 8,0 
Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1) 
Phenol: 250 g Phenol (Festsubstanz) im Wasserbad bei 65 °C lösen, 0,5 M Tris 

HCl (pH 8,0), 0,1 % Hydroxychinolin, 0,2 % Merkaptoethanol zugeben 
5 x TBE: 54 g/l Tris, 27,5 g/l Borsäure, 4,65 g/l EDTA (pH 8,0) 
TE-Puffer: 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA (pH 8,0) 
Tris-Puffer: 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) 

2. 1. 9 Pflanzenmaterial 
Für die Experimente wurde Arabidopsis thaliana, Ökotyp Columbia (Col-0) verwendet. Die 
mit dem GFP-FABD2-Konstrukt (Ketelaar et al., 2004) stabil transformierte Arabidopsis-
Linie wurde uns von Dr. F. Baluška (Bonn) zur Verfügung gestellt. Die verwendeten T-DNA-
Insertionslinien wurden vom Nottingham Arabidopsis Stock Center (NASC) bezogen (Alonso 
et al., 2003). Es wurden die Linien SALK_015799, SALK_091737 und SALK_075913 
untersucht. Die mit dem Expressionsvektor pMAQ2 transformierte Arabidopsis-Linie, welche 
eine einfache Insertion des Apoproteins Aequorin besitzt, erhielten wir von Dr. M. Knight 
(Knight et al., 1991). 


Material und Methoden 

2. 2 Methoden 
2. 2. 1. Kultivierung und Transformation von Bakterien 
2. 2. 1. 1 Kultivierung und Transformation von E. coli 
Die Kultivierung von E. coli erfolgte in LB-Flüssigmedium oder auf Agarplatten bei 37 °C 
über Nacht im Brutschrank. Es wurden Antibiotika als Selektionsmarker (Sambrook und 
Russell, 2001) verwendet. Chemisch kompetente E. coli-Zellen wurden nach Hanahan (1983) 
hergestellt. Die Transformation von Plasmiden in chemisch kompetente E. coli-Zellen 
erfolgte durch Hitzeschock (Hanahan, 1983). 

2. 2. 1. 2 Kultivierung von Agrobacterium tumefaciens 
Die Anzucht von Agrobacterium tumefaciens GV3101/pMP90 erfolgte zunächst als Vorkultur 
in 5 ml YEB-Medium für 24 h bei 28 °C und 200 Upm auf einem Schüttler. Für die 
Hauptkultur wurden 500 ml YEB-Medium mit der Vorkultur beimpft und unter den 
genannten Bedingungen inkubiert. A. tumefaciens GV3101/pMP90 besitzt eine Resistenz 
gegen die Antibiotika Rifampicin und Gentamicin. Es wurden 50 mg/l Rifampicin und 
25 mg/l Gentamicin zum YEB-Medium gegeben. Für die Anzucht der transformierten 

A. tumefaciens-Zellen wurden dem YEB-Medium 10 mg/l Spectinomycin zugegeben. 
2. 2. 1. 3 Herstellung kompetenter A. tumefaciens GV3101/pMP90-Zellen 
2 ml YEB-Medium zuzüglich der Antibiotika Gentamicin (50 µg/ml) und Rifampicin 
(10 µg/ml) wurden mit einer Einzelkolonie angeimpft und über Nacht bei 28 °C unter 
Schütteln (250 Upm) angezogen. Mit dieser Vorkultur wurde eine 200 ml Hauptkultur 
angesetzt und ebenfalls unter Schütteln (250 Upm) inkubiert bis eine optische Dichte von 0,3 
erreicht wurde. Die Zellen wurden durch Zentrifugation für 10 min bei 4 °C und 5000 Upm 
sedimentiert. Das Pellet wurde durch Zugabe von 20 ml eiskaltem 1 mM HEPES-Puffer 
(pH 7) gelöst. Nach anschließendem Zentrifugieren wurden die Zellen noch zweimal mit 
20 ml eiskaltem 1 mM HEPES-Puffer gewaschen und zentrifugiert. Das Pellet wurde in 2 ml 
sterilem, eiskaltem Glyzerin (10 %) aufgenommen, auf 40 µl Aliquots aufgeteilt und in 
flüssigen Stickstoff schockgefroren. Die Lagerung der kompetenten Zellen erfolgte bei 
-80 °C. 


Material und Methoden 

2. 2. 1. 4 Transformation kompetenter A. tumefaciens GV3101/pMP90-Zellen 
Die kompetenten Bakterienzellen, YEB-Medium und Plasmid-DNA wurden auf Eis gelagert. 
600 ng Plasmid-DNA (s. 2. 2. 11. 1) wurde zu den kompetenten Zellen pipettiert. Die DNA-
Zellsuspension wurde in eine vorgekühlte Küvette (2 mm) überführt. Die Elektroporation 
erfolgte bei 15 µ Farrad und 2500 V. Sofort nach der Transformation erfolgte die Zugabe von 
500 µl YEB-Medium in die Küvette. Die transformierten Zellen wurden in ein steriles 2 ml 
Reaktionsgefäß überführt und bei 28 °C für 2-4 h unter leichtem Schütteln inkubiert. 
Anschließend wurden je 200 µl der transformierten Zellen auf LB-Selektionsplatten mit 
50 mg/l Rifampicin, 25 mg/l Gentamicin und 10 mg/l Spectinomycin ausplattiert. Nach 
2-3 Tagen Inkubation bei 28 °C erschienen Kolonien transformierter Bakterien. 

2. 2. 2 Kultivierung von Arabidopsis 
Die Anzucht von Arabidopsis zur Analyse von T-DNA-Insertionsmutanten und zur 
Vorbereitung der Interaktionsexperimente mit P. indica erfolgte zunächst auf MS-Medium 
(Murashige und Skoog, 1962) zuzüglich 13,4 g/l Saccharose. Für die Selektion der 
transformierten Keimlinge der Überexprimierer OX-rop1 und OX-rop6 wurde dem Medium 
Phosphinothricin (10 mg/ml) zugegeben. Für die Sterilisation des Saatgutes wurde dieses 
zunächst in einer Lösung aus 1 ml A. dest., 500 µl Klorix und 65 µl Laurylsarcosin für 8 min 
unter Schütteln sterilisiert und anschließend 7 mal mit A. dest. gewaschen und auf den MS-
Platten ausplattiert. Nach einer Inkubation im Dunkeln für 48 h bei 4 °C wurde die 
Kultivierung unter Dauerweißlicht von 100 µmol m-2 s-1 bei 22 °C fortgesetzt. Zur Analyse 
der T-DNA-Insertionsmutanten wurden die Keimlinge nach ca. 18 Tagen auf Erde in 
Multiplatten mit Aracons umgesetzt und unter Langtagbedingungen bis zur Samenreife 
kultiviert. 

2. 2. 3 Kultivierung von P. indica 
Für die Kultivierung auf Platten mit Kaefers-Medium (KM) wurde ein d = 5 mm großes Stück 
des Pilzes auf eine neue Petrischale überimpft und bei 28 °C für 3-4 Wochen im Dunkeln 
inkubiert. Für Flüssigkulturen wurde ein gleichfalls 5 mm großes Stück des Pilzes in einem 
Erlenmeyerkolben mit 500 ml Medium für ca. 3 Wochen in einem Schüttel-Inkubator unter 
Lichtausschluss bei 25 °C und 100 Upm kultiviert. 


Material und Methoden 

2. 2. 4 Interaktionsexperimente von Arabidopsis mit P. indica 
Für Experimente in Petrischalen wurden die Samen zunächst wie beschrieben auf 
MS-Medium für 9 Tage kultiviert (2 Tage bei 4 °C im Dunkeln, 7 Tage Dauerweißlicht von 
100 µmol m-2 s-1 bei 22 °C). Die Keimlinge wurden anschließend auf Platten (d = 90 mm) mit 
PNM-Medium umgesetzt. Auf diese PNM-Platten wurde zuvor eine Nylonmembran gelegt 
(Maschengröße: 70 µm), um ein Einwachsen der Pflanzenwurzeln in das Medium zu 
verhindern. Im Abstand von 1 cm wurde ein 5 mm großes Stück des Pilzes neben die 
Pflanzenwurzel gelegt. Die Kultivierung erfolgte im Dauerlicht (80 µmol m-2 s-1) und 22 °C. 
Das Pflanzenmaterial wurde nach 2, 4, 6, 10 und 14 Tagen geerntet. Spross und Wurzel 
wurden getrennt gewogen und für weitere Experimente, wenn nötig, in flüssigem Stickstoff 
eingefroren und bei -80 °C aufbewahrt. 
Für Interaktionsexperimente auf Erde wurde Arabidopsis für 18 Tage auf MS-Medium 
vorkultiviert und anschließend in Töpfe (d = 8 cm) mit sterilisierter Erde umgesetzt. Es 
wurden Pflanzen mit und ohne den Zusatz von Pilzmyzel kultiviert. Das Pilzmyzel wurde wie 
beschrieben in Flüssigkultur angezogen und nach 3 Wochen geerntet. Durch anschließendes 
Waschen mit A. dest. wurden Reste des Mediums entfernt. In jeden Topf mit Erde wurden 5 g 
Pilzmyzel direkt unter die Erde gemischt. Die Kultivierung erfolgte für 2 Wochen im Kurztag 
und anschließend bis zur Samenreife unter Langtagbedingungen. Das Experiment wurde 
zweimal mit je 15 Kontrollpflanzen und 15 mit Pilz infizierten Pflanzen für jede Linie 
durchgeführt. 

2. 2. 5 Isolation von Nukleinsäuren 
2. 2. 5. 1 Isolation von DNA aus Arabidopsis 
Zwei frisch geerntete Blätter wurden mit 500 µl Lysis-Puffer versetzt und homogenisiert. 
Nach einer Inkubation für 5 min bei 37 °C, erfolgte die Zugabe von 500 µl PhenolChloroform-
Isoamylalkohol. Die Proben wurden nach kräftigem Schütteln für 5 min bei 
14000 Upm zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und mit dem gleichen Volumen 
Isopropanol versetzt, geschüttelt und 5 min bei Raumtemperatur gefällt. Nach der 
Zentrifugation für 5 min bei 14000 Upm wurde der Überstand verworfen und das entstandene 
Pellet zweimal mit 500 µl Ethanol (80 %) gewaschen. Das Pellet wurde nach kurzem 
Trocknen in der Speed Vac in 20 µl TE gelöst, 30 min auf Eis und anschließend 10 min bei 
50 °C inkubiert. Die Zugabe von 1 µl RNase diente dem Abbau von RNA-Kontaminationen. 


Material und Methoden 

2. 2. 5. 2 Isolation von Plasmid-DNA aus E. coli 
Die Isolation der Plasmid-DNA wurde entweder nach Birnboim und Doly (1979) oder nach 
dem Protokoll des GeneJETTM Plasmid Miniprep Kits durchgeführt. 

2. 2. 5. 3 Isolation von Plasmid-DNA aus A. tumefaciens 
Für die Isolation der Plasmid-DNA aus A. tumefaciens wurde der QIAprep. Spin Miniprep 
Kit mit einem veränderten Protokoll verwendet. Es wurden 10 ml YEB-Medium (zzgl. 
50 mg/l Rifampicin, 25 mg/l Gentamicin und 10 mg/l Spectinomycin) mit einer 
transformierten Kolonie angeimpft und für ca. 24 h bei 28 °C inkubiert. Nach Zentrifugation 
bei 3500 Upm für 45 min wurde das Pellet in 250 µl P1-Puffer vollständig gelöst. Nach 
Zugabe von 500 µl P2-Puffer wurde die Probe durch mehrmaliges Invertieren gemischt. Nach 
dem Zupipettieren von 700 µl P3-Puffer wurde die Probe durch 5-maliges Umschwenken 
sofort gemischt. Es folgten 10 min Zentrifugation bei 13000 Upm. Die Säule aus dem 
QIAprep. Spin Miniprep Kit wurde in ein 2 ml Sammelgefäß gesteckt. Auf diese Säule 
wurde anschließend der Überstand aus der Zentrifugation pipettiert und für 1 min bei 
13000 Upm zentrifugiert. Der Durchfluss wurde verworfen und auf die Säule wurden 500 µl 
PB-Puffer pipettiert. Die Zentrifugation wurde wiederholt und der Durchfluss verworfen. Es 
folgte die Zugabe von 750 µl PE-Puffer und ein weiterer Zentrifugationsschritt. Nach dem 
Verwerfen des Durchflusses wurde die Säule ein weiteres Mal zentrifugiert und anschließend 
in ein neues Sammelgefäß gestellt. Die Plasmid-DNA wurde nach Zugabe von 50 µl 
EB-Puffer und 1 min Inkubation bei Raumtemperatur aus der Säule durch Zentrifugation bei 
13000 Upm eluiert. 

2. 2. 5. 4 Isolation von RNA aus Pflanzen 
Für die Isolation von RNA aus T-DNA-Insertionslinien und den Überexpressionsmutanten 
von Arabidopsis wurde Trizol der Firma PEQLAB verwendet. Das bei -80 °C tiefgefrorene 
Pflanzenmaterial (100 mg Blatt- oder Wurzelmaterial) wurde gemörsert und anschließend mit 
1 ml Trizol-Reagenz versetzt. Nach 5 min Inkubation bei Raumtemperatur wurden 200 µl 
Chloroform zugegeben und die Probe für 15 s kräftig geschüttelt. Nach 10 min Inkubation bei 
Raumtemperatur folgten 5 min Zentrifugation bei 12000 g und 4 °C. Die in der oberen Phase 
befindliche RNA wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt und mit 500 µl Isopropanol 
versetzt. Es folgte eine Inkubation für 10 min bei Raumtemperatur und 10 min zentrifugieren 
bei 12000 g und 4 °C. Das Pellet wurde luftgetrocknet und anschließend in 20 µl H2ODEPC 
gelöst. Zur vollständigen Resuspendierung der RNA schließt sich eine Inkubation bei 55 °C 
für 10 min an. 


Material und Methoden 

Für die Isolation von RNA für real-time PCR, RT-PCR und microarray-Experimente wurde 
der RNeasy Plant Mini Kit verwendet. Die Durchführung der RNA-Isolation erfolgte nach 
den Anweisungen des Protokolls. Für die RNA-Isolation wurden jeweils 100 mg bei -80 °C 
eingefrorenes Wurzelmaterial verwendet. In den RNA-Isolationsprozess integrierte sich ein 
On-Column DNAse-Verdau mit dem RNase-Free DNase Set. Die Qualität der RNA wurde 
photometrisch (OD 260/280 nm) oder auf einem denaturierenden RNA-Gel bestimmt. 

2. 2. 5. 5 Synthese von cDNA für RT-PCR und real-time PCR 
Die Synthese von cDNA aus 1 µg RNA wurde mit dem Omniscript. Reverse Transcription 
Kit nach den Angaben des Herstellers ausgeführt. 

2. 2. 5. 6 RT-PCR 
Mit Hilfe der RT-PCR wurde die Transkriptmenge für die Gene rop1 (At3g51300), rop6 
(At4g35020) bzw. ric4 (At5g16490) in den T-DNA-Insertionslinien, den 
Überexpressionslinien, den GFP-FABD2-Linien, den pMAQ2-Linien und in der 
Doppelmutante rop1rop6 bestimmt. Als externe Standards wurden actin2 (At3g18780) und 
gapC (At3g04120) verwendet. Für einen 10 µl PCR-Ansatz wurde 1 µl cDNA eingesetzt. Die 
PCR wurde nach folgendem Programm ausgeführt: 1 x 2 min bei 95 °C, 20-35x (30 s bei 
95 °C, 40 s bei 55-60 °C, 40-50 s bei 72 °C), 1 x (10 min bei 72 °C). 

2. 2. 5. 7 Amplifikation von DNA mit PCR 
Aus den Arabidopsis T-DNA-Insertionslinien, Überexpressionslinien, den GFP-FABD2Linien, 
den pMAQ2-Linien und der Doppelmutante rop1rop6 isolierte DNA wurde auf das 
Vorhandensein der jeweiligen Gene rop1, rop6 bzw. ric4 mit PCR geprüft. Dafür wurde der 
T-DNA-spezifische Primer LBa1 und der entsprechende genspezifische Primer verwendet. 
Das PCR-Programm lautete wie folgt: 1 x 4 min 94 °C, 30-33 x (20 s bei 94 °C, 20 s bei 
53-60 °C, 60 s bei 72 °C), 1x 8 min bei 72 °C). 

2. 2. 5. 8 Trennung und Dokumentation von DNA-Fragmenten auf dem Agarosegel 
Für die Auftrennung der DNA wurde ein 1 %iges Agarosegel mit Ethidiumbromid 
(1,25 µg/ml Gellösung) verwendet. Die Fragmentgröße wurde mit einem Größenstandard 
bestimmt. Die Dokumentation erfolgte mit der DeVisionG-Software. 


Material und Methoden 

2. 2. 5. 9 real-time PCR 
Mit der real-time PCR wurde die Expression von Genen untersucht, die in den microarrays 
eine deutliche Regulation aufwiesen bzw. bekannte Interaktionspartner der kleinen G-Proteine 
sind. Neben dem Wildtyp und der Doppelmutante rop1rop6 wurden auch die Mutanten rop1 
und rop6 untersucht, um eine Aussage treffen zu können, ob rop1 oder rop6 einen größeren 
Einfluss auf die Expression der jeweiligen Gene hat. 
Die real-time PCR wurde mit dem MX3000P-Cycler von Stratagene durchgeführt. Die realtime 
PCR besteht wie eine PCR aus einem Denaturierungsschritt, bei dem sich die DNA-
Templatestränge trennen, einem Anlagerungsschritt, bei dem der Oligonukleotidprimer an die 
einzelsträngige DNA bindet und einem Elongationsschritt, bei dem die hitzestabile Taq-
Polymerase die Primer verlängert, bis wieder eine doppelsträngige DNA vorliegt (Saiki et al., 
1988). Die Vervielfältigung der DNA verläuft zumindest theoretisch zunächst exponentiell. 
Gegen Ende der PCR-Reaktion verringert sich die Vermehrungsrate durch störende Produkte 
wie Pyrophosphat oder rehybridisierte DNA. Für die real-time PCR wurde der 
fluoreszierende Farbstoffe SYBR. 
Green I verwendet. Dieser bindet unspezifisch an 
doppelsträngige DNA. Wird der an doppelsträngige DNA gebundene Fluoreszenzfarbstoff 
angeregt, kommt es zu einer verstärkten Fluoreszenzemission. Am Ende jedes PCR-Zyklus 
wird diese Fluoreszenzemission gemessen und ermöglicht so eine Aussage der gebildeten 
Produktmenge zu einem bestimmten Zeitpunkt. Als Maß für die Quantifizierung der DNA 
dient der CP (Crossing Point). Zu diesem Zeitpunkt hebt sich das Fluoreszenzsignal gerade 
vom Hintergrund ab und die Vermehrung der DNA ist bei diesen niedrigen Zyklenzahlen 
noch exponentiell. Da die DNA-Konzentrationen in den Proben verschieden sein können, z. 

B. durch unterschiedliche Effizienz der cDNA-Synthese, wurde ein Referenzgen, welches von 
den Zellen konstitutiv exprimiert wird, mit quantifiziert. Als housekeeping gene wurde gapC 
ausgewählt, da actin2 in den durchgeführten microarrays Hinweise auf eine Regulation 
zeigte. Durch die Verwendung von gapC als Kontrollgen ist eine Normalisierung der 
Expressionsergebnisse möglich. Die Berechnung der Expression der Testgene im Wildtyp 
und in den Mutanten erfolgte nach Pfaffl (2001) mit folgender Formel: 
2 (Ct Wildtyp Testgen- Ct Mutante Testgen) 

= Expressionsverhältnis 

2 (Ct Wildtyp Kontrollgen- Ct Mutante Kontrollgen) 

Die Zahl 2 steht für eine optimale real-time PCR Effizienz, d. h. eine Verdopplung der DNA 
in jedem Zyklus. Im optimalen Fall haben die Kontrollgene in Wildtyp und Mutante die 
gleichen CPs, wodurch der Nenner gleich eins würde und das berechnete Verhältnis wäre 
dann nur von den Expressionsunterschieden des Testgens abhängig. 


Material und Methoden 

Durchführung 
Die für die real-time PCR verwendeten cDNAs und Primer wurden zunächst mit einer RT- 
PCR auf ihre Qualität untersucht. Die verwendete cDNA stammte aus drei unabhängigen 
Wachstumskinetiken. 
Folgender Ansatz wurde für die real-time PCR verwendet: 
H2O 6,5 µl 
Reaktionsmix 12,5 µl 

Primer 1 1,0 µl 
Primer 2 1,0 µl 
cDNA 4,0 µl 

Die synthetisierte cDNA wurde nach der reversen Transkription so verdünnt, dass für die 
real-time PCR eine cDNA entsprechend 50 ng RNA zum Einsatz kam. 
Die real-time PCR wurde nach folgendem Programm ausgeführt: 1 x 2 min bei 95 °C, 40 x 
(30 s bei 94 °C, 60 s bei 58 °C, 40 s bei 72 °C), 1 x (10 min bei 72 °C). Daran schließt sich 
die Erstellung einer Schmelzkurve an. Diese gibt Auskunft über die Qualität des PCR-
Produkts, z. B. evtl. vorhandene Primerdimere. Test-und Kontrollgen wurden in 
Dreifachbestimmugen analysiert, außerdem wurde für jedes Primerpaar eine Negativkontrolle 
mitgeführt, d. h. im Reaktionsansatz befand sich H2O anstelle von cDNA. 

2. 2. 6 Analyse der T-DNA-Insertionsmutanten 
Um die exakte Insertion der T-DNA im Gen zu lokalisieren, wurde das mittels T-DNA- und 
genspezifischem Primern erhaltene PCR-Produkt auf einem Agarosegel aufgetrennt (1,5 %) 
und nach dem Ausschneiden der Bande aus dem Gel mit dem Qiaex. 
II Gel Extraktionskit 
eluiert. Das aufgereinigte PCR-Produkt wurde in den pGEM. 
-T Vektor lt. Protokoll kloniert 
und in kompetente E. coli-Zellen durch Hitzeschock transformiert (s. 2. 2. 1. 1). Für die 
Selektion der Transformanten wurden LB/Ampicillin/IPTG/X-Gal-Platten verwendet 

(s. pGEM.-T Vektor-Protokoll). Nach Inkubation über Nacht bei 37 °C wurden einige weiße 
Kolonien in je 3 ml LB für eine Plasmidisolation angezogen. Die Plasmidisolation wurde 
nach dem Protokoll von Birnboim und Doly (1979) ausgeführt. 
2. 2. 7 DNA-Sequenzierung nach Sanger et al. (1977) 
Die isolierten Plasmide aus 2. 2. 6 wurden unter Verwendung des CycleReaderTM Auto DNA 
Sequencing Kits mit dem LI-COR 4200 sequenziert. Für die Auswertung kam die LI-COR 
e-SeqTM Software zum Einsatz (Biosciences GmbH, Bad Homburg). 


Material und Methoden 

2. 2. 8 Herstellung der Doppelmutante rop1rop6 
Homozygote Mutanten für die Gene rop1 bzw. rop6 wurden für die Kreuzungen verwendet. 
Die rop6-Mutanten dienten als Pollenspender. Als Pollenempfänger dienten Blüten von rop1Mutanten, 
die noch geschlossen waren, deren Kronblätter aber unter den Kelchblättern 
sichtbar herausragten. Nach der vollständigen Entfernung der Staub- und Kronblätter am 
Pollenempfänger mittels Pinzette unter dem Mikroskop erfolgte die Bestäubung durch Pollen 
eines reifen Staubblattes von rop6-Mutanten. Die bestäubte Blüte wurde markiert und 
benachbarte Knospen entfernt. Das Ernten des Saatguts erfolgte kurz vor dem Öffnen der 
reifen Schote. Die Anzucht der Pflanzen aus der F1- und F2-Generation, DNA-Isolation und 
PCR zur Identifizierung der Mutanten erfolgte wie unter 2. 2. 2; 2. 2. 5. 1 und 2. 2. 5. 7 
beschrieben. Das Saatgut der homozygoten rop1rop6-Mutanten wurde für die weiteren 
Experimente verwendet. 

2. 2. 8. 1 Herstellung der Arabidopsis-GFP-FABD2 rop1-, rop6-und rop1rop6-Linien 
Für die Kreuzungen wurde die mit dem GFP-FABD2 Fusionsprotein (Voigt et al., 2005) 
stabil transformierte Arabidopsis-Linie und die Mutante rop1rop6 verwendet. Die 
Identifizierung der Mutanten erfolgte wie unter 2. 2. 7 beschrieben. Die GFP-Fluoreszenz 
wurde mit dem Axiovert 135 überprüft. 

2. 2. 8. 2 Herstellung der Arabidopsis-pMAQ2 rop1-, rop6- und rop1rop6-Linien 
Die mit dem Expressionsvektor pMAQ2 transformierte Arabidopsis-Linie wurde mit der 
Linie rop1rop6 gekreuzt. Das Vorhandensein der Apoaequorin-Plasmidsequenz wurde mit 
den Primern AEQ-fwd und AEQ-rev kontrolliert. 

2. 2. 9 Isolation des Zellwandextraktes aus P. indica 
Der Zellwandextrakt wurde nach dem Protokoll von Anderson-Prouty und Albersheim (1975) 
mit den genannten Änderungen (Vadassery et al., 2009a) isoliert. 

2. 2. 10 Ca2+-Messungen 
Die Kultivierung der transgenen Pflanzen rop1, rop6 und rop1rop6, die das Apoaequorin-
Gen enthalten, erfolgte auf Hoagland-Medium. Nach 48 h Inkubation bei 4 °C im Dunkeln 
wurden die Platten aufrecht im Dauerweißlicht (100 µmol m-2 s-1 bei 22 °C) für 14 Tage 
kultiviert. 


Material und Methoden 

Für die Vorbereitung der Ca2+-Messungen wurden die Wurzeln unter sterilen Bedingungen 
vom Spross getrennt. Die Wurzeln wurden über Nacht in 15 µM Coelenterazin in 5 ml H2O in 
einer Petrischale (d = 50 mm) im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert. Da für den Ablauf 
der Reaktion O2 benötigt wird, muss Luftzutritt gewährleistet sein. Je 4-6 Wurzeln werden in 
ein well einer 96-well-Platte überführt, in das 100 µl H2O/15 µM Coelenterazin-Lösung 
vorgelegt wurden. Für die Kontrollen wurde H2O verwendet. Nach 30 min Inkubationszeit 
wurde die Messung mit dem Luminoscan Ascent-Luminometer gestartet. Die Messung der 
Biolumineszenz erfolgte für 20 min in Intervallen von 5 s. Aufgezeichnet wurden die Daten 
als relative light units (RLUs). Die Messung der Grundlumineszenz betrug eine Minute. 
Anschließend wurden 50 µl Zellwandextrakt direkt in ein well gegeben und die 
Biolumineszenz für 20 min gemessen. Die Entladung des noch vorliegenden Aequorins wurde 
durch Zugabe von 0,1 M CaCL2 zzgl. 10 % Ethanol ausgelöst und für 10 min gemessen. Die 
Berechnung der Biolumineszenz wurde nach Rentel und Knight (2004) ausgeführt. Dabei 
wird die Konzentration des frei in der Zelle vorhandenen Ca2+ in Beziehung zu dem Ca2+ 
gesetzt, das am Ende der Messung durch die Entladung des Aequorins freigesetzt wird. Die 
Berechnung erfolgt nach der folgenden Formel: pCa = 0,332588 (-log k) + 5,5593. Die 
Konstante k ergibt sich aus dem Quotienten der Zahl der Lumineszenz pro Sekunde und der 
Zahl der noch vorhandenen Gesamt-Lumineszenz. 

2. 2. 11 Herstellung der Arabidopsis Überexprimierer OX-rop1 und OX-rop6 
2. 2. 11. 1 Herstellung der Überexpressionsplasmide pOX-rop1 und pOX-rop6 
Für die Herstellung der Überexprimierer OX-rop1 und OX-rop6 wurde der 
pCR./GW/TOPO. TA Cloning. Kit von Invitrogen verwendet, welcher auf der GatewayTM 
Technologie basiert. Grundlage der GatewayTM Technologie ist die Fähigkeit des 
Bakteriophagen . zur Seiten-spezifischen Rekombination (Landy, 1989). Zunächst wird das 
PCR-Produkt in einen entry-Vektor (pENTRTM) kloniert. Dieser Vektor liegt auf Grund der 
Aktivität der aus Vaccinia isolierten Topoisomerase I, welche eine spezifische DNA-Sequenz 
(CCCTT) der doppelsträngigen DNA erkennt und schneidet, linearisiert vor (Shuman, 1994). 
Der linearisierte Vektor besitzt einfache 3’-Deoxythymidin (T)-Überhange. Da der Vektor 
zwei gegenüberliegende Schnittstellen enthält, werden beide Schnittstellen durch die 
Topoisomerase I blockiert und eine Selbstligation verhindert. Die TOPO. Cloning Reaktion 
und die LR-Reaktion wurden nach dem Protokoll des pCR./GW/TOPO. TA Cloning. Kit 
ausgeführt. Im folgenden Text werden Abweichungen bzw. zusätzliche Informationen zur 
Durchführung beschrieben. Die PCR-Produkte der Gene rop1 und rop6 wurden mit einem 
Mix aus Taq- und Pfu-Polymerase hergestellt. Es wurde die völlständige cDNA-Sequenz 
beider Gene eingesetzt. Für die Klonierung in den entry-Vektor ist die Verwendung der Taq-
Polymerase notwendig, da diese durch ihre terminale Transferase-Aktivität einfache 
Deoxyadenosin (A)-Überhänge synthetisiert und so eine direkte Ligation in den Vektor 


Material und Methoden 

ermöglicht. Nach einer Ligation für 5 min wurde das Plasmid durch Hitzeschock in 
kompetente TOP10 E. coli-Zellen transformiert. Die Selektion der Transformanten erfolgte 
auf Spectinomycin (100 µg/ml)-haltigen LB-Platten. Nach der Kultivierung über Nacht bei 
37 °C im Brutschrank wurden 10 Kolonien in je 3 ml LB-Medium mit 100 µg/ml 
Spectinomycin angeimpft und über Nacht unter Schütteln angezogen. Für die 
Plasmidisolation wurde der GeneJETTM Plasmid Miniprep Kit verwendet. Die Insertion der 
DNA wurde durch Restriktion überprüft. Für die Sequenzierung wurde der GW1-Primer 
benutzt. Das DNA-Insert im pENTRTM-Vektor wird von den benachbarten 
Rekombinationseiten attL und attR eingeschlossen. Diese Rekombinationsseiten ermöglichen 
die Seiten-spezifische Rekombination vermittelt durch den Gateway. 
LR ClonaseTM II 
Enzym-Mix in einen Expressionsvektor mit den kompatiblen Rekombinationsseiten attB und 
attP. Als Expressionsvektor wurde pB2GW7,0 verwendet (Karimi et al., 2002). Für die LR-
Reaktion wurden die pENTRTM-Klone pERop1 und pERop6 zunächst mittels der 
Restriktionsendonuklease AvaII in der für die Spectinomycin-Resistenz kodierenden Region 
geschnitten und aus dem Gel mit dem Qiaex. 
II Gel Extraktionskit eluiert. 150 ng des 
linearisierten Plasmids wurden für die LR-Reaktion eingesetzt. 1 µl der LR-Reaktion wurde 
für die Transformation durch Hitzeschock in kompetente E. coli Nova Blue-Zellen verwendet. 
Nach Inkubation der Transformanten über Nacht bei 37 °C auf LB-Selektivmedium mit 
Spectinomycin (100 µg/ml) wurden 10 Kolonien in je 3 ml LB zzgl. 100 µg/ml 
Spectinomycin angeimpft und bei 37 °C unter Schütteln angezogen. Für die Plasmidisolation 
wurde der GeneJET TM Plasmid Miniprep Kit verwendet. Der Erfolg der Klonierung wurde in 
einer PCR mit dem pB2GW7-Fwd-Primer und den genspezifischen Primern RP-ROP1 bzw. 
RP-ROP6 überprüft und anschließend mit den genspezifischen Primern LP-ROP1 und RPROP1 
bzw. LP-ROP6 und RP-ROP6 sequenziert. 

2. 2. 11. 2 Transformation von Arabidopsis mit den Überexpressionsplasmiden pOX-rop1 
und pOX-rop6 
Die Anzucht der mit den Plasmiden pOX-rop1 und pOX-rop6 transformierten A. tumefaciens-
Zellen erfolgte wie unter 2. 2. 1. 2 beschrieben. Die Zellen wurden durch Abzentrifugieren für 
10 min bei 2000 g geerntet. Das Pellet wurde in 300 ml einer 5 %-igen Saccharoselösung 
vorsichtig resuspendiert. Die Konzentration der Bakterienzellen sollte eine OD600 von 0,8-1,0 
aufweisen. Direkt vor dem Eintauchen der ungeöffneten Blüten wurde der Infiltrationslösung 
das Detergenz SilwetL-77 zugesetzt (0,05 %). 
Die Transformation von Arabidopsis wurde nach der leicht veränderten floral dip-Methode 
von Clough und Bent (1998) durchgeführt. Die Pflanzen wurden ca. 4-6 Wochen kultiviert, 
bis sie reichlich Knospen angesetzt hatten. Bereits geöffnete Blüten oder vorhandene Schoten 
wurden 1-2 Tage vor der Transformation entfernt. Zwei Stunden vor der Transformation 
wurden die Pflanzen gründlich gewässert. Der Spross wurde in das Infiltrationsmedium 


Material und Methoden 

getaucht und für ca. 30 s hin und her bewegt. Nach der Transformation wurden die Pflanzen 
in Plastikschalen gelegt, die mit angefeuchtetem Papier ausgekleidet waren. Die Schalen 
wurden abgedeckt, um Lichtzutritt zu verhindern. Am Folgetag wurden die Pflanzen mit 
Wasser besprüht und aufrecht im Langtag weiter kultiviert. Nach dem Abblühen wurden die 
Pflanzen in Schalen gelegt, bis sie vollständig abgereift waren. Das Saatgut wurde geerntet 
und auf Erde in Platten ausgesät. Die Samen wurden zunächst 2 Tage im Dunkeln bei 4 °C 
vernalisiert und anschließend im Kurztag kultiviert. Die Keimlinge wurden im Alter von ca. 5 
Tagen mit einer 0,1 % Phosphinothricin-Lösung (Basta.) besprüht, nach weiteren 3 Tagen 
wurde dieser Vorgang wiederholt. Resistente Keimlinge sind nach einer Woche erkennbar. 
Das Saatgut der resistenten Pflanzen wurde auf MS-Medium mit 10 mg/ml Phosphinothricin 
ausplattiert und für weitere Experimente verwendet. 

2. 2. 12 Analyse der Keimung von Arabidopsis und den Mutanten rop1, rop6, rop1rop6, 
ric4, pOX-rop1 und pOX-rop6 
Die Samen vom Arabidopsis-Wildtyp und den Mutanten rop1, rop6, rop1rop6, ric4, pOXrop1 
und pOX-rop6 wurden wie in 2. 2. 2 beschrieben, auf MS-Medium kultiviert. Nach 24 h 
im Dauerweißlicht (100 µmol m-2 s-1 bei 22 °C) wurde die Anzahl der gekeimten Samen 
mit dem LEICA MZ6-Mikroskop festgestellt. Der sichtbare Austritt der Keimlingswurzel 
wurde als Keimung gewertet. Nach 3 Tagen wurde die Anzahl der insgesamt gekeimten 
Samen untersucht. 

2. 2. 13 Untersuchung des Aktinzytoskeletts von Arabidopsis-GFP–FABD2 und den 
Arabidopsis-GFP–FABD2 rop1-, rop6-, rop1rop6-Mutanten 
Grundlage für die Visualisierung des F-Aktins in Arabidopsis ist das GFP-FABD2-Konstrukt 
(Voigt et al., 2005). Dieses Konstrukt besteht aus einer N-terminalen Fusion von GFP an die 
C-terminale Sequenz von AtFim1. AtFim1 (Aminosäuren 325-687) besteht aus der zweiten 
Aktin-bindenden Domäne und dem C-terminalen Ende von Fimbrin1 aus Arabidopsis. 
Für die Untersuchung des Aktinzytoskeletts wurden die GFP-FABD2-rop1-, rop6-, rop1rop6-
Linien und der Arabidopsis-GFP-FABD2-Wildtyp mit und ohne P. indica wie in 2. 2. 4 
beschrieben kultiviert. Nach 2, 6 und 17 Tagen wurden die Wurzeln mikroskopiert. Dafür 
kam das Axiovert 200M mit ApoTome zum Einsatz. In der konventinellen 
Fluoreszenzmikroskopie besteht ein Bild aus Signalbeiträgen, die nicht nur aus der 
Objektebene selbst, sondern auch aus darüber bzw. darunter liegenden Strukturen des 
Präparates stammen. Dadurch kann es zur Aufhellung des Bilduntergrundes kommen, und der 
Kontrast der Abbildung wird reduziert. Das ApoTome ermöglicht überstrahlungsfreie 
optische Schnitte durch Streifenprojektion. Dabei wird im ApoTome Modus eine 


Material und Methoden 

Gitterstrukur in die Ebene der Leuchtfeldblende des Fluoreszenz-Strahlengangs gelegt. Die 
Position des Gitters wandert durch das Präparat und in jeder Gitterposition werden 3 
Rohbilder aufgenommen, die zu einem Ergebnisbild verrechnet werden. Die Aufnahme der 
Bilder erfolgte automatisch über die Digitalkamera AxioCam (Zeiss). Die AxioVision-
Software von Zeiss steuert die Aufnahme und Auswertung der Bilder nach den Anweisungen 
des Anwenders. Die AxioVision-Software ermittelt u. a. automatisch die Vergrößerung des 
Objekts und ermöglicht 3D-Rekonstruktionen. 

2. 2. 14 Färbemethoden für die Lichtmikroskopie zum Nachweis von P. indica-Sporen 
und ROS im Arabidopsis-Wildtyp, rop1-, rop6-, rop1rop6-, OX-rop1-, OX-rop6- und ric4Mutanten 
Zur Vorbereitung der Pflanzenwurzeln für die Färbung mit dem Pianese-Farbgemisch, 
Säurefuchsin und Pelikanblau-Essigsäure (5 %) wurden die Wurzeln nach Kultivierung auf 
PNM-Medium (s. 2. 2. 4) für 10 min in KOH (10 %) und nach Kultivierung in Erde für 30 bis 
60 min in KOH (10 %) bei 90 °C entfärbt und anschließend 3fach mit A. dest. gewaschen. 

Pianese-Färbung 

1 g Pianese-Farbgemisch (0,5 g Malachitgrün, 0,5 g Säurefuchsin, 0,01 g Martiusgelb) wurde 
in 150 ml A. dest. zzgl. 50 ml Ethanol (92 %, unvergällt) gelöst. 
Die entfärbten Wurzeln wurden für mindestens 45 min in der Färbelösung inkubiert. Danach 
wurden die Wurzeln für 1 min in Essig-Ethanol (99 ml Ethanol 92 %ig, 1 ml Eisessig) 
überführt und anschließend kurz in Ethanol (92 %) gespült. Zum Mikroskopieren wurde 
Ethanol (70 %) verwendet. Durch die Färbung sollten die Pflanzenzellen grün und die 
Pilzzellen rosa gefärbt sein. 

Säurefuchsin-Färbung (0,01 % Säurefuchsin in Milchsäure) 

Die entfärbten Wurzeln wurden für 10 min in der Färbelösung bei 90 °C inkubiert und 
anschließend mehrmals in A. dest. gewaschen und in Leitungswasser mikroskopiert. 

Tintenblau (5 %)-Essigsäure (5 %)-Färbung (nach Vierheilig et al., 1998) 

Die entfärbten Wurzeln wurden für 30 min in der Färbelösung bei 90 °C inkubiert, in 
Leitungswasser gewaschen und mikroskopiert. 

DAB-Färbung 
3, 3’-Diaminobenzidin wurde in A. dest. unter Zugabe von HCl bis zur Reduktion des pH-
Wertes auf 3,8 gelöst. Die verwendete Konzentration betrug 23 mM. Die Wurzeln ganzer 
Pflanzen, die mit und ohne P. indica kultiviert wurden, wurden mit der DAB-Lösung 
überschichtet. Die Wurzeln färbten sich nach wenigen Minuten braun. DAB dient zum 
Nachweis von H2O2. 


Material und Methoden 

NBT-Färbung 

Eine 6 mM NBT-Lösung (Nitroblautetrazolium) wurde zum Färben der Wurzeln von 
Keimlingen verwendet. Die Färbung erfolgte für 5-10 min. Die Reaktion wurde durch die 
Überführung in Leitungswasser beendet. Im Lichtmikroskop konnte durch die blau-violett-
Färbung der Wurzelzellen O2-(Superoxidanion) nachgewiesen werden. 

2. 2. 15 Untersuchungen zur Wurzel- bzw. Wurzelhaarmorphologie von Arabidopsis und 
den Mutanten rop1, rop6, rop1rop6, OX-rop1 und OX-rop6 
Das Saatgut wurde auf MS-Medium mit 0,5 % (w/v) Phytagel ausplattiert, 2 Tage bei 4 °C im 
Dunkeln vernalisiert und anschließend vertikal im Dauerweißlicht weiterkultiviert. Nach 
4 Tagen wurden die Wurzeln mit dem Leitz BIOMED-Mikroskop untersucht. 

2. 2. 16 GeneChip. Expressionsanalyse 
Aus den Interaktionsexperimenten (s. 2. 2. 4) vom Arabidopsis-Wildtyp und der 
Doppelmutante rop1rop6 stammendes Wurzelmaterial wurde nach 2 und 6 Tagen geerntet, in 
flüssigem Stickstoff tiefgefroren und bei -80 °C gelagert. Die RNA-Isolation wurde wie in 

2. 2. 5. 4 beschrieben, durchgeführt. Die isolierte Gesamt-RNA wurde auf Trockeneis an das 
Kompetenzzentrum für Fluoreszente Bioanalytik (KFB, Regensburg) versandt, welches die 
Durchführung der microarrays übernahm. Es wurde der GeneChip Arabidopsis ATH1 
Genome Array der Firma Affymetrix (Santa Clara, CA, USA) verwendet. 
Bei diesen DNA-Chips werden mittels photolithographischer Festphasensynthese 
Oligonukleotide direkt auf einem Glasträger synthetisiert. Zunächst werden photolabile 
Schutzgruppen auf den Glasträger aufgebracht, die die Startpunkte für die 
Oligonukleotidsynthese darstellen. Anschließend werden mit Hilfe photolithographischer 
Masken die Schutzgruppen an den Stellen entfernt, an denen eine Base, z. B. Adenin binden 
soll. Diese angekoppelten Nukleotide besitzen ebenfalls ein Schutzgruppe und der Vorgang 
der gerichteten Bestrahlung mit anschließender Ankopplung neuer Nukleotide an bestimmte 
Stellen erfolgt bis eine Oligonukleotidsequenz von 25 Basen erreicht wird. Dieses Verfahren 
ermöglicht eine extrem hohe cDNA-Probendichte (ca. 300 000 cDNAs auf 1,28 cm2, Lipshutz 
et al., 1999). Aufgrund der kurzen Oligonukleotidsequenzen kann es jedoch zu 
Fehlhybridisierungen kommen. Um diesen Nachteil auszugleichen, werden für jedes Gen 11 
Paare (probe sets) von 25-mer Oligonukleotiden eingesetzt, die zu verschiedenen Regionen 
der Zielsequenz komplementär sind. Jedes Oligonukleotid-Paar besteht aus einer perfekt 
passenden Sequenz (perfect match) und einer Sequenz, die eine Fehlbase enthält (missmatch). 
Die Differenz der Hybridisierungsergebnisse von perfect match und missmatch wird 
verwendet, um das endgültige Ergebnis zu erhalten (Lipshutz et al., 1999). Zur Detektion der 
biotinylierten cRNA-Moleküle wird das Streptavidin-Biotin-System verwendet, welches die 

Material und Methoden 

Bindungsaffinität von Streptavidin zu Biotin ausnutzt. Nach der Hybridisierung wird ein 
Konjugat aus Streptavidin und dem fluoreszierenden Farbstoff Phycoerythrin zugegeben und 
der Chip kann nach einem Waschvorgang gesichtet werden. Die vom Scanner erhaltenen 
Signale werden mit der GeneChip Operating Software (GCOS 1.4) von Affymetrix 
ausgewertet. Im Anschluss an das Scannen werden zunächst die Hybridisierungssignale der 
Oligonukleotide berechnet. Der Berechnung der Signalintensität für jedes probe set geht eine 
Hintergrund-Korrektur voraus. Zu dieser gehört z. B. die Verrechnung der missmatch-
Oligonukleotide. Die Signalintensität der probe sets ist ein Maß für die Häufigkeit des 
Transkripts. Die Berechnung des detection p-value hingegen gibt Auskunft über die 
Wahrscheinlichkeit bzw. das Maß der Signifikanz der Messung. Der detection call definiert 
ein bestimmtes Transkript als present (P), marginal (M) oder absent (A). Um zwei Versuche 
miteinander vergleichen zu können, müssen diese einer Normalisierung unterzogen werden. 
Dafür werden alle Werte mit dem zuvor berechneten scale faktor (SF) multipliziert. Die 
Expressionsunterschiede der probe sets zwischen Kontroll-Chip und Versuchs-Chip werden 
in Form eines zur Basis 2 logarithmierten Signal-Verhältnisses (signal log ratio) dargestellt. 
Ist dieses Verhältnis gleich 1, entspricht das einem fold change von 2 bzw. einer Verdopplung 
der Transkriptmenge. Parallel dazu wird der change p-value berechnet, der Auskunft über das 
Maß der Signifikanz der Expressionsunterschiede eines Transkripts zwischen Kontrolle und 
Experiment gibt. Liegt dieser Wert innerhalb bestimmter Grenzen, wird im change call der 
Expressionsunterschied als increase (I), marginal increase (MI), no change (NC), marginal 
decrease (MD) oder decrease (D) wiedergegeben. Die Ausgabe der Ergebnisse erfolgt als 
Excel-Tabelle. Der Gesamt-Genom Chip für Arabidopsis gibt Auskunft über die Expression 
von über 24000 Gensequenzen. Die einzelnen Schritte zur Bearbeitung der Gesamt-RNA bis 
zur Hybridisierung sind in Abb. 2. 1 dargestellt. 
Das für die microarrays verwendete Pflanzenmaterial stammte aus Interaktionsexperimenten 
von Arabidopsis und P. indica, das am 2. und 6. Tag der Kokultivierung geerntet wurde. Die 
Kultivierung wurde auf PNM-Medium durchgeführt. Es wurde je eine Chip-Analyse für den 
Arabidopsis-Wildtyp ohne P. indica (Kontrolle) und eine Chip-Analyse für den Wildtyp 
kultiviert mit P. indica (Behandlung) durchgeführt. Die Signale der beiden Chips wurden 
anschließend mit Hilfe der GCOS 1.4-Software ausgewertet und eine Vergleichsanalyse 
zwischen Kontrolle und Behandlung durchgeführt. Für die Doppelmutante rop1rop6 wurde 
ebenso verfahren. 
Da für jeden Zeitpunkt (2. und 6 Tag.) nur eine Vergleichsanalyse vorliegt, ist eine 
statistische Auswertung der regulierten Gene nicht möglich. 


Material und Methoden 

Reverse 

Pflanzenmaterial 

RNA-Isolierung 
RNAs 
AAA 
AAA 
Transkription 
Fragmentierte, 
biotinylierte 
B 
B Fragmentierung Hybridisierung 
cRNA 

Waschen, Färben, Quantifizieren 

cDNA 

In vitro 

Transkription 

B 

Biotin-markierte cRNA 

B 


Affymetrix GeneChip. 


Abb. 2. 1: Probenaufarbeitung und Hybridisierung für die GeneChip. Expressionsanalyse 

2. 2. 17 Phylogenetische Analyse der kleinen G-Proteine 
Für die phylogenetische Analyse der 93 Gene, welche in Arabidopsis für kleine G-Proteine 
kodieren (Vernoud et al., 2003), wurden zunächst die Proteinsequenzen dieser Gene 
zusammengestellt. Dafür wurde die Datenbank von NCBI (National Center for Biotechnology 
Information, Rockville Pike, MD, USA) verwendet. Für den Vergleich der Sequenzen wurde 
das Programm MultAlin (Corpet, 1988) von ExPASy (Swiss Institute of Bioinformatics) 
benutzt. Nach dem Sequenzvergleich erfolgte die manuelle Entfernung sogenannter gaps 
(Lücken, die durch den Sequenzvergleich entstanden sind), dies führte zu einer stärkeren 
Bewertung der konservierten Sequenzbereiche. Mit dem Programm TreeTop (Yushmanov 
und Chumakov, 1988; Brodsky et al., 1995) von GenBee (A. N. Belozersky Institute of 
Physico-Chemical Biology, Moscow State University, Russland) wurde ein phylogenetischer 
Baum mit 1000 Bootstrap-Wiederholungen berechnet und mit Phylip (Felsenstein, 1989) als 
unrooted neighbor-joining tree dargestellt. 


Ergebnisse 

3 Ergebnisse 

3. 1 Identifizierung von rop1-, rop6- und ric4-Mutanten 
Die Bedeutung der kleinen G-Proteine ROP1 und ROP6, sowie RIC4, einem bekannten 
Interaktionspartner von ROP1 (Wu et al., 2001), für die Interaktion von Arabidopsis mit 

P. indica wurde mit Hilfe von knock-out-Mutanten untersucht. Die verwendeten T-DNA-
Insertionslinien wurden vom Nottingham Arabidopsis Stock Center (NASC) bezogen (Alonso 
et al., 2003). Es wurden die Linien SALK_015799, SALK_075913 und SALK_091737 
verwendet. 
Tab 3. 1: T-DNA Insertionslinien 

SALK-Linie Genlokus Bezeichnung d. Proteins Bezeichnung d. Mutante 
SALK_015799 At5g16490 RIC4 ric4 
SALK_075913 At3g51300 ROP1 rop1 
SALK_091737 At4g35020 ROP6 rop6 

3. 1. 1 Genotypische Analyse der T-DNA-Insertionen 
Zur Selektion der Pflanzen nach Wildtyp, heterozygoten bzw. homozygoten Mutanten, wurde 
zunächst eine PCR auf DNA-Ebene mit den genspezifischen Primern RP und LP 
durchgeführt. Wird mit den genspezifischen Primern ein Produkt amplifiziert, handelt es sich 
um eine Wildtyp oder eine heterozygote Pflanze. Aufgrund der Größe der T-DNA (5000 Bp) 
ist eine Produktamplifikation des Gens bei homozygoten Mutanten nicht möglich. 
Anschließend erfolgte eine PCR mit einem genspezifischen Primer und dem T-DNA 
spezifischen Primer LBa1. Bei dieser PCR-Reaktion kommt es nur bei homo- bzw. 
heterozygoten Mutanten zu einer Produktamplifikation, da die T-DNA spezifischen Primer 
LBa1 bzw. LBb1 direkt an der T-DNA binden (Abb. 3. 1). Um die exakte Insertionstelle der 
T-DNA im Gen zu finden bzw. die Angaben vom NASC-Institut zu überprüfen, wurden die 
Produkte aus der zweiten PCR-Reaktion in den pGEM-Vektor kloniert und sequenziert 

(s. 2. 2. 6, 2. 2. 7). 
Die Angabe der Basen, zwischen denen die T-DNA inseriert ist, bezieht sich auf das 
Startcodon des entsprechenden Gens. Nur der T-DNA-Insertionsort der Mutante rop1 stimmt 
mit den Informationen des NASC-Institutes überein (Abb. 3. 3). Der Insertionsort der T-DNA 
in der Mutante ric4 liegt zwischen der 268. und 269. Base anstelle der 257. und 258. Base im 
2. Exon (Abb. 3. 2). Auch die Information des NASC-Institutes für die Mutante rop6, in 
welcher sich die T-DNA im 2. Exon zwischen der 415. und 416. Base befinden soll, konnte 
nicht bestätigt werden. Die T-DNA ist in dieser Mutante am Ende des 2. Introns zwischen der 
564. und 565. Base inseriert (Abb. 3. 4). 

Ergebnisse 

LP 
T-DNA LBa1/LBb1 
Abb. 3. 1: Strategie zur Unterscheidung 
zwischen Wildtyp und Mutanten. LP: 
linker genspezifischer Primer, RP: rechter 
genspezifischer Primer, LBa1 bzw. LBb1: 
T-DNA spezifischer Primer. 


RP 
Genomische DNA 

T-DNA-Insertion 

At5g16490 


E1 
E2 
E3 

Abb. 3. 2: T-DNA-Insertion in der Mutante ric4. Die T-DNA ist in der Mutante ric4 zwischen der 

268. und 269. Base im 2. Exon inseriert. 
T-DNA-Insertion 

At3g51300 


E1 
E2 
E3 E4 
E5 
E6 

Abb. 3. 3: T-DNA-Insertion in der Mutante rop1. Die T-DNA ist in der Mutante rop1 zwischen der 

846. und 845. Base im 5. Intron inseriert. 
T-DNA-Insertion 
At4g35020 


E1 
E2 E3 E4 
E5 
E 
E7 

Abb. 3. 4: T-DNA-Insertion in der Mutante rop6. In der Mutante rop6 ist die T-DNA zwischen der 

564. und 565. Base am Ende des zweiten Introns inseriert. 
Die Doppelmutante rop1rop6 wurde durch Kreuzung der T-DNA-Mutanten (Abb. 3. 3 und 
Abb. 3. 4) hergestellt. Die Linie rop6 diente als Pollenspender, da ein Fehlen von ROP1 
Einfluss auf das Pollenschlauchwachstum hat (Li et al., 1999; Fu et al., 2001; Gu et al., 
2005). Das Saatgut homozygoter Pflanzen aus der F2-Generation wurde für die Experimente 
verwendet. 


Ergebnisse 

3. 1. 2 Analyse der genspezifischen mRNAs in den Mutanten rop1, rop6, rop1rop6 und 
ric4/3 
Die Insertion der T-DNA in ein Gen, insbesondere in ein Exon, sollte die Synthese der 
mRNA ausschließen und somit zu einem Verlust der Genfunktion führen (Krysan et al., 1999; 
Alonso et al., 2003). Um dies zu überprüfen, wurde die mRNA-Menge des mutierten Gens 
mit genspezifischen Primern in einer RT-PCR untersucht. Da die Besiedelung von 
Arabidopsis durch P. indica über die Wurzel erfolgt, wurde Gesamt-RNA aus Wurzeln 
isoliert und für die cDNA-Synthese verwendet. Zur Kontrolle der cDNA-Synthese wurden die 
konstitutiv exprimierten mRNAs für actin2 (At3g18780) und gapC (At3g04120) amplifiziert. 
Um Kontaminationen des PCR-Reaktionsansatzes festzustellen, wurde jeweils ein PCR-
Ansatz mit H2O (Bezeichnung K in Abb. 3. 5 bis 3. 11) anstelle von DNA bzw. cDNA 
durchgeführt. Die Doppelmutante rop1rop6 wird in den Abbildungen mit d.ko abgekürzt. Wie 
in Abb. 3. 5 zu sehen ist, wird rop1 nicht ausschließlich in Infloreszenzen exprimiert (Li et 
al., 1998; Vernoud et al., 2003), sondern auch in Wurzeln. Die Insertion der T-DNA in ein 
Intron von rop1 bzw. rop6 (Abb. 3. 3 und 3. 4) verhinderte die Expression des Gens. Es 
handelte sich demzufolge um eine knock-out-Mutante. Die fehlende Expression von rop1 oder 
rop6 in den knock-out-Linien führte nicht zu einer verstärkten Expression des jeweils anderen 
rop-Gens. Die etwas stärkere Bande von rop6 in der rop1-Linie bedeutet keine verstärkte 
Genexpression, da auch die Bande für das housekeeping-Gen actin2 stärker ist, was z. B. 
durch eine effizientere cDNA-Synthese verursacht sein kann. 
In der Mutante ric4/3 der Linie SALK_015799, deren T-DNA-Insertion sich im 2. Exon 
befindet (Abb. 3. 2), konnte in den Wurzeln von Arabidopsis kein Transkript für ric4, 
nachgewiesen werden. Somit handelte es sich um eine homozygote knock-out-Mutante 
(Abb. 3. 6). In den heterozygoten Mutanten ric4/2 und ric4/4 war eine verringerte ric4Transkriptmenge 
im Vergleich zum Wildtyp nachweisbar. Die mRNA von ric4 wird in allen 
Gewebetypen von Arabidopsis exprimiert (Wu et al., 2001). Als Kontrolle wurde cDNA und 
DNA vom Wildtyp mit den für ric4-spezifischen Primern untersucht (Abb. 3. 6) und das 
housekeeping-Gen gapC mit der Primerkombination GapC-LP und GapC-RT-RP amplifiziert 
(Abb. 3. 7). 


Ergebnisse 

A 
AA

ro
rororop
ppp1 
111 

ro
rororop
ppp6 
666 

600 Bp600 Bp600 Bp 
100 Bp-
--


rop
ppp6 
666 WT 
WTWTWT d.
d.d.d.k
kkko 
ooo K 
KKK ro
rororop
ppp1 
111 WT 
WTWTWT d.
d.d.d.k
kkko 
ooo K 
KKK

Marker 

300 Bpactin2B300 Bpactin2300 Bp actin2 
B 
100 Bp-
--


ro
ooop1
p1p1p1 r 
rrro
ooop
ppp6 
666 d.
d.d.d.k
kkko 
ooo WT 
WTWTWT K 
KKKMarker 


Abb. 3. 5: Expression der Gene rop1, rop6 (A) und actin2 (B) im Wildtyp und in den Mutanten. 

Die Expression der Gene rop1 (RT-PCR mit 33 Zyklen), rop6 (RT-PCR mit 28 Zyklen) und actin2 
(RT-PCR mit 25 Zyklen) wurde in WT- und Mutanten-Wurzeln untersucht (rop1-, rop6-Mutante, 
Doppelmutante d.ko, K: H2O). 

800 Bp500 Bpric4800 Bp 
500 Bp ric4 
Abb. 3. 6: Expression von ric4 im Wildtyp und in den ric4-Mutanten. Die Expression von ric4 
wurde in den Wurzeln des Wildtyps und in den Individuen ric4/2 (heterozygote Mutante), ric4/3 
(homozygote Mutante) und ric4/4 (heterozygote Mutante) untersucht (RT-PCR und PCR mit 35 
Zyklen, K: H2O). 

300 BpgapC300 Bp 
gapC 
Abb. 3. 7: Expression von gapC in den ric4-Mutanten. Die Expression von gapC wurde in den 
Wurzeln der Individuen ric4/2 (heterozygote Mutante), ric4/3 (homozygote Mutante) und ric4/4 
(heterozygote Mutante) untersucht (RT-PCR mit 28 Zyklen, Primerkombination GapC-RT-RP und 
GapC-LP, K: H2O). 


Ergebnisse 

3. 1. 3 Quantifizierung der T-DNA durch quantitative PCR 
Die durchschnittliche Anzahl von T-DNA-Insertionen in einer transformierten Pflanze liegt 
laut Statistik bei 1,5 Insertionsereignissen, sie werden stabil vererbt und per Zufall in das 
Genom integriert (Alonso et al., 2003). Da die Doppelmutante rop1rop6 für die Herstellung 
weiterer Mutanten (s. 2. 2. 8. 1 und 2. 2. 8. 2) verwendet wurde, und zusätzliche T-DNA-
Insertionen in kodierende Bereiche anderer Gene die Interaktion von Arabidopsis mit 

P. indica beeinflussen könnten, wurde eine Quantifizierung der T-DNA in den 
Ausgangsmutanten von rop1 und rop6 für die F1- und F2-Generationen durchgeführt. Zum 
Vergleich der Bandenstärke wurde eine als heterozygot getestete Mutante aus der 
F1-Generation der Linie rop1 verwendet. Bei allen weiteren Mutanten handelte es sich um 
homozygote knock-out-Mutanten. Die Doppelmutante rop1rop6 ging aus den homozygoten 
F2-Generationen der Mutanten rop1 und rop6 hervor. 
Für jede PCR-Reaktion wurden 0,5 µg DNA eingesetzt. Wie in Abb. 3. 8 zu sehen ist, besitzt 
der Wildtyp keine T-DNA-Insertion. In den homozygoten F1- und F2-Generationen von rop1 
bzw. rop6 war die T-DNA-Sequenz gleichwertig nachweisbar. Die Stärke der Bande für 
rop1rop6 wies auf eine höhere T-DNA Ausgangskonzentration hin. Die Bandenstärke einer 
heterozygoten rop1-Mutante hingegen ist leicht verringert. Abb. 3. 8 führt zu der Annahme, 
dass die homozygote rop1 Mutante der F2-Generation und die homozygoten rop6 Mutanten 
der F1- und F2-Generationen die gleiche Anzahl von T-DNA-Insertionen (eine Insertion) 
besitzen. 
Abb. 3. 8: Quantifizierung der T-DNA 
im Wildtyp und in den Mutanten. Für 
jede PCR-Reaktion wurden 0,5 µg DNA 
eingesetzt. Reihenfolge der Proben: WT, 
rop1/F1 (heterozygote Mutante), rop1/F2 
(homozygote Mutante), d. ko/F1 
(homozygote Doppelmutante), rop6/F1 
(homozygote Mutante), rop6/F2 
(homozygote Mutante), K: H2O, PCR mit 
32 Zyklen. 

100 Bp-
--WT rop1/ rop1/ d. ko/ rop6/ rop6/ K 
Marker F1 F2 F1 F2


F1 

3. 2 Die Überexpressionsmutanten OX-rop1 und OX-rop6 
Um die physiologischen Funktionen von ROP1 bzw. ROP6 und ihre Bedeutung für die 
Interaktion mit P. indica zu charakterisieren, wurden neben den knock-out-Linien dieser Gene 
auch Überexpressionslinien hergestellt. So verursacht das Fehlen oder die Hemmung von 
ROP1 in Pollenschläuchen u. a. eine Abnahme des F-Aktins an der Spitze des 
Pollenschlauches und eine Wachstumshemmung, die Überexpression hingegen führt zu einer 
Stabilisierung des F-Aktins und depolarisiertem Wachstum (Kost et al., 1999; Li et al., 1999; 

900 Bp900 Bp 

Ergebnisse 

Fu et al., 2001). Nach Selektion der transformierten Arabidopsis-Pflanzen (s. 2. 2. 11. 2) 
wurde die Gesamt-RNA isoliert und für die cDNA-Synthese eingesetzt. In den folgenden 
Abbildungen dient die Bezeichnung OX1 bzw. OX6 als Abkürzung für Einzelindividuen der 
Linien OX-rop1 und OX-rop6. Die mRNA von rop1 ist in den Pflanzen OX1/2 und OX1/4 
stärker exprimiert, als in OX1/1, OX1/3 und den als Kontrollen verwendeten Pflanzen OX6/1, 
OX6/3, OX6/4 bzw. WT (Abb. 3. 9). 

600 Bp600 Bprop1600 Bp600 Bprop1600 Bp600 Bp 
rop1 
10
1010101010100 B
0 B0 B0 B0 B0 B0 Bp
pppppp-
------O
OOOOOOX
XXXXXX1
111111/ 
////// OX
OXOXOXOXOXOX1
111111/
////// OX 
OXOXOXOXOXOX1
111111/ 
////// O
OOOOOOX
XXXXXX1
111111/
////// O 
OOOOOOX
XXXXXX6
666666/ 
////// OX
OXOXOXOXOXOX6
666666/
////// OX 
OXOXOXOXOXOX6
666666/ 
////// WT
WTWTWTWTWTWT WT 
WTWTWTWTWTWT K 
KKKKKK 
Ma
MaMaMaMaMaMar
rrrrrrk
kkkkkke
eeeeeer 
rrrrrr 1
111111 2 
222222 3 
333333 4 
444444 1 
111111 3 
333333 4 
444444 DN
DNDNDNDNDNDNA 
AAAAAA 

Abb. 3. 9: Expression von rop1 in den Überexpressionsmutanten und im Wildtyp. Die Expression 
von rop1 wurde in den Wurzeln der rop1-Überexpressionsmutanten (OX1/1-4), in den rop6Überexpressionsmutanten 
(OX6/1, 3, 4) und im WT untersucht (RT-PCR mit 35 Zyklen, K: H2O). 

In Abb. 3. 10 ist die Expression der mRNA von rop6 in den Überexpressionsmutanten und 
den Kontrollen OX1/2, OX1/4 und WT zu sehen. In den Mutanten OX6/1 und OX6/4 wird 
rop6 verstärkt exprimiert. Als Kontrolle für eine erfolgreiche cDNA-Synthese wurde das 
housekeeping-Gen gapC mit der Primerkombination GapC-LP und GapC-RP amplifiziert 
(Abb. 3. 11). 

10
1010100 B
0 B0 B0 Bp
ppp-
---OX
OXOXOX6
666/ 
/// O
OOOX
XXX6
666/
/// O 
OOOX
XXX6
666/ 
/// OX
OXOXOX1
111/
/// OX 
OXOXOX1
111/ 
/// WT
WTWTWT WT 
WTWTWT K 
KKK 
Ma
MaMaMar
rrrk
kkke
eeer 
rrr 1
1113
333 4 
444 2 
2224 
444 DN
DNDNDNA 
AAA 


ro
rororop
ppp6 
666 

60
6060600 B
0 B0 B0 Bp 
ppp 

Abb. 3. 10: Expression von rop6 in den Überexpressionsmutanten und im Wildtyp. Die 
Expression von rop6 wurde in den Wurzeln der rop6-Überexpressionsmutanten (OX6/1, 3, 4), in den 
rop1-Überexpressionsmutanten (OX1/2, 4) und im WT untersucht (RT-PCR mit 31 Zyklen, K: H2O). 


Ergebnisse 

400 BpgapC400 BpgapC400 Bp 
gapC 
10
10100 B
0 B0 Bp
pp-
--O
OOX
XX1
11/
//O
OOX
XX1/
1/1/O
OOX
XX1/
1/1/O
OOX
XX1/
1/1/O
OOX
XX6/
6/6/O
OOX
XX6
66/
//O
OOX
XX6
66/ 
// WT
WTWT WT 
WTWT K 
KK 
Ma
MaMar
rrk
kke
eer 
rr 1
11 2 
22 3 
334
44 1 
11 3
334 
44 DN
DNDNA 
AA 

Abb. 3. 11: Expression von gapC in den Überexpressionsmutanten und im Wildtyp. Die 
Expression von gapC wurde in den Wurzeln der rop1-Überexpressionsmutanten (OX1/1-4), in den 
rop6-Überexpressionsmutanten (OX6/1, 3, 4) und im WT untersucht (RT-PCR mit 30 Zyklen, K: 
H2O). 

3. 3 Phänotypische Charakterisierung der Mutanten 
Eine Veränderung des Genotyps durch Mutation kann zu Veränderungen im 
Entwicklungsprogramm (Ontogenese) einer Pflanze und zur Beeinflussung des Phänotyps 
führen. 

3. 3. 1 Analyse der Keimung 
Bei der Durchführung der Interaktionsexperimente zwischen dem Arabidopsis-Wildtyp und 
den Mutanten mit P. indica fiel auf, dass die Pflanzen der Linie rop1rop6 nach 9 Tagen 
Kultivierung auf MS-Medium und somit zu Beginn der Interaktionsexperimente (s. 2. 2. 4) 
größer waren als der Wildtyp. Es wurde vermutet, dass die Samen der Linie rop1rop6 früher 
keimen als der Wildtyp, da es Hinweise auf eine Beteiligung von ROP-GTPasen an der 
Samenkeimung gibt (Li et al., 2001; Zheng et al., 2002) und ROPs funktionell redundant sein 
können, wie am Beispiel von ROP1, ROP3 und ROP5 während des Pollenschlauchwachstums 
beobachtet wurde (Kost et al., 1999; Li et al., 1999; Vernoud et al., 2003). 
In Abb. 3. 12 ist die Anzahl der gekeimten Samen, bezogen auf die Anzahl der insgesamt 
gekeimten Samen (s. 2. 2. 12) dargestellt. Keimung ist definiert als der Durchbruch der 
embryonalen Wurzel durch Endosperm und Testa (Bewley, 1997). Der mikroskopisch 
sichtbare Austritt der Keimlingswurzel aus der Samenschale wurde demzufolge als Keimung 
gewertet. 


Ergebnisse 

--
0% 
10% 
20% 
30% 
40% 
50% 
60% 
70% 
80% 
90% 
--
Keimung 
der 
Samen 
in 
% 
WT rop1 OX-rop1 rop6 OX-rop6 rop1rop6 ric4 
Abb. 3. 12: Anzahl der gekeimten Samen des Wildtyps und der Mutanten. Die Keimung der 
Samen des Wildtyps und der rop1-, OX-rop1-, rop6-, OX-rop6-, rop1rop6- und ric4-Mutanten wurde 
nach 48 h Vernalisation bei 4 °C und anschließender Kultivierung im Dauerweißlicht (100 µmol m-2s-1 
bei 22 °C) für 24 h untersucht (3 unabhängige Wiederholungen mit ca. 50 Samen pro Experiment, 
Darstellung mit STABW). 

Nach 24 h sind 23,8 % der Samen des Wildtyps gekeimt. Die Mutante rop1 zeigt eine 
Keimungsrate von 67,9 %, das Fehlen von ROP1 führt demzufolge zu einer früheren 
Keimung der Samen. Die Überexpression von rop1 hat weder einen hemmenden noch 
fördernden Einfluss auf die Keimung. Das Fehlen bzw. die Überexpression von rop6 bewirkt 
eine um ca. 10 % erhöhte Keimungsrate verglichen mit dem Wildtyp. Die Doppelmutante 
rop1rop6 weist eine Keimungsrate von 80 % nach 24 h auf. Fehlen die GTPasen ROP1 und 
ROP6, so wirkt sich dies besonders stark auf eine frühere Keimung aus, wobei die knock-out-
Mutation von rop1 einen weitaus größeren Einfluss hat. Das Fehlen von RIC4 wirkt sich 
ebenfalls fördernd auf die Keimung aus. Die Keimungsrate nach 24 h beträgt 40 %. 

3. 3. 2 Wurzel- bzw. Wurzelhaarmorphologie im Wildtyp und in den Mutanten rop1, 
rop6, rop1rop6, OX-rop1 und OX-rop6 
Untersuchungen an Mutanten für die GTPasen ROP2, ROP4 und ROP6 sprechen für eine 
Beteiligung dieser Proteine an der Regulation des Wurzelhaarwachstum (Jones et al., 2002; 
Molendijk et al., 2001). Da P. indica Arabidopsis über die Wurzel bzw. Wurzelhaare 
besiedelt, war es von großem Interesse, die Morphologie der Wurzel und Wurzelhaare der 
Mutanten zu charakterisieren. Die 4 Tage alten Keimlinge (s. 2. 2. 15) wurden mikroskopisch 
auf Anzahl der Seitenwurzeln bzw. Seitenwurzelanlagen, Wurzeldicke bzw. -länge und die 
Beschaffenheit der Wurzelhaare untersucht. Die untersuchten rop1-und rop6-knock-out-und 
Überexpressions-Mutanten einschließlich der Doppelmutante und ric4-Mutante zeigten keine 
Veränderungen bezüglich der Anzahl der Seitenwurzeln. In der Dicke der Wurzel 


Ergebnisse 

unterschieden sich Mutanten und Wildtyp nicht voneinander (120 µm bis 200 µm). Die Länge 
der Primärwurzel der 4 Tage alten Keimlinge wies deutliche Unterschiede zwischen Mutanten 
und Wildtyp auf (Abb. 3. 13). 

---
0 
2 
4 
6 
8 
10 
12 
--
L änge 
der 
W 
u rzel 
in 
m 
m 
WT rop1 OX-rop1 rop6 OX-rop6 rop1rop6 
Abb. 3. 13: Länge der Primärwurzeln des Wildtyps und der Mutanten am 4. Tag nach der 
Keimung. Die Länge von mindestens 20 Primärwurzeln des Wildtyps und der Mutanten rop1, OXrop1, 
rop6, OX-rop6 und rop1rop6 wurde untersucht (Darstellung mit STABW). 

Die Länge der Wurzel des Wildtyps betrug 5 bis 6 mm, rop1 und rop1rop6 haben eine 
Wurzellänge von 9,5 mm und auch die Überexpressionsmutanten OX-rop1 und OX-rop6 
haben mit 7,5 mm eine längere Wurzel als der Wildtyp. Die rop6-knock-out-Mutation wirkt 
sich nicht auf die Wurzellänge aus, so dass die Wurzellänge von rop1rop6 auf die fehlende 
Expression von ROP1 zurückzuführen ist. 
Für die in Abb. 3. 14 A und B bzw. in Abb. 3. 15 und Abb. 3. 16 dargestellten Ergebnisse 
wurde ein 1 mm langer Primärwurzelabschnitt (2,5 mm entfernt von der Wurzelspitze) 
mikroskopiert. Die Wurzelhaare wurden unabhängig von ihrer Länge in die Messung 
einbezogen. Verzweigte Wurzelhaare wurden als ein Wurzelhaar gewertet, da nur eine 
Wurzelhaarbasis erkennbar war. Die Zahl der Wurzelhaare im Wildtyp liegt bei 
durchschnittlich 33,6 Wurzelhaaren/mm (Abb. 3. 14 A). Jede Wurzelhaarzelle bildet nur ein 
Wurzelhaar aus (Masucci und Schiefelbein, 1994). Keine der untersuchten Mutanten weist 
deutliche Abweichungen zu diesem Wert auf, ROP1 und ROP6 haben demnach keinen 
direkten Einfluss auf die Anzahl der Wurzelhaare je Wurzelhaarzelle. Die Insertion eines 
Wurzelhaares einer Wurzelhaar-ausbildenden Zelle befindet sich am Ende der Zelle in 
Richtung der Wurzelspitze (Masucci und Schiefelbein, 1994). Der Insertionsort der 
Wurzelhaare wies in keiner Mutante Abweichungen gegenüber dem Wildtyp auf. 


Ergebnisse 

A
AAB 
BB

-----
0 
100 
200 
300 
400 
500 
600 
Länge 
in 
µm 
WT rop1 OX-rop1 rop6 OX-rop6 rop1rop6 
0 
5 
10 
15 
20 
25 
30 
35 
40 
-
Anzahl 
der Wurzelhaare/mm 
WT rop1 OX-rop1 rop6 OX-rop6 rop1rop6 
Abb. 3. 14: Anzahl der Wurzelhaare (A) und Länge der Wurzelhaare (B) des Wildtyps und der 
Mutanten. Im Wildtyp und in den Mutanten rop1, OX-rop1, rop6, OX-rop6 und rop1rop6 wurde ein 
Wurzelabschnitt von 1 mm, der 2,5 mm von der Wurzelspitze entfernt lag, untersucht (mindestens 4 
unabhängige Experimente mit je 10 Wurzeln, Darstellung mit STABW). 

In Abb. 3. 14 B ist die durchschnittliche Länge der Wurzelhaare des Wildtyps und der 
Mutanten dargestellt. Der Mittelwert der Wurzelhaarlänge des Wildtyps liegt bei 370 µm. Das 
Fehlen von ROP1 führt zu einer geringen Abnahme der Länge der Wurzelhaare, wobei die 
Standardabweichung vom Mittelwert die Schwankungen der Messwerte wiederspiegelt. Die 
Abnahme der Wurzelhaarlänge in OX-rop1 und rop6 gegenüber der Länge des Wildtyps 
beträgt im Mittel 50 µm. Im Gegensatz dazu sind die Wurzelhaare der Linie OX-rop6 
durchschnittlich 100 µm länger als die des Wildtyps. Die Doppelmutante rop1rop6 besitzt mit 
ca. 270 µm im Mittel deutlich kürzere Wurzelhaare als die anderen Mutanten und der 
Wildtyp. Eine Veränderung der Dicke der Wurzelhaare konnte bei den Mutanten nicht 
beobachtet werden (Abb. 3. 16). Der Durchmesser der ausgewachsenen Wurzelhaare lag 
zwischen 10 und 15 µm. 
Im Wildtyp von Arabidopsis sind verzweigte Wurzelhaare selten, einige Mutanten zeigen 
jedoch eine größere Zahl verzweigter Wurzelhaare, wie z. B. tip1 (Ryan et al., 1998) oder 
cen2 (Parker et al., 2000). Die Mutanten tip1 und cen2 besitzen kürzere und dickere 
Wurzelhaare als der Wildtyp, die außerdem oft verzweigt sind (Grierson et al., 2001). In 
Abb. 3. 15 ist die Anzahl der verzweigten Wurzelhaare im Wildtyp und den Mutanten 
dargestellt. Es wurde keine Unterscheidung getroffen, ob die Verzweigung an der Basis oder 
an der Spitze des Wurzelhaares auftritt, da beide Ereignisse in gleichem Maße auftreten. Im 
Wildtyp ist von 100 Wurzelhaaren weniger als ein Wurzelhaar verzweigt, dies entspricht den 
Ergebnissen von Ryan et al., (1998) und Jones et al., (2002). Die Linien rop1 und rop1rop6 
besitzen eine geringe Anzahl verzweigter Wurzelhaare. Die Überexpression von rop6 und 
rop1 bewirkt eine deutliche Zunahme verzweigter Wurzelhaare von 10 -12 % gegenüber dem 


Ergebnisse 

Wildtyp. Das Fehlen von ROP6 wirkt sich nicht auf die Verzweigung der Wurzelhaare aus, so 
dass die Zunahme in rop1rop6 auf die fehlende Expression von rop1 zurückzuführen ist. In 
Abb. 3. 16 sind die verzweigten Wurzelhaare der Mutanten OX-rop1 (A-C) und OX-rop6 
(D und E) und des Wildtyps (F) dargestellt. 

Anzahl verzweigterr 
Wurzelhaare in 
%

20 
15 
10 
5 
0 

0,33 
4 
12 
0,7 
10 
6 
--
WT rop1 OX-rop1 rop6 OX-rop6 rop1rop6 

Abb. 3. 15: Anzahl der 
verzweigten Wurzelhaare im 
Wildtyp und in den 
Mutanten. 

Im Wildtyp und in den 
Mutanten rop1, OX-rop1, 
rop6, OX-rop6 und rop1rop6 
wurde ein Wurzelabschnitt von 
1 mm, der 2,5 mm von der 
Wurzelspitze entfernt lag, 
untersucht (mindestens 5 
unabhängige Experimente mit 
je 10 Wurzeln, Darstellung mit 
STABW). 

E 50µm 
A 80µm B 50µm 50µm C 
D 50µm 50µm F 
Abb. 3. 16: Verzweigte Wurzelhaare der Mutanten und des Wildtyps. A-C: OX-rop1, D und E: 
OX-rop6 und Wildtyp (F); A: Verzweigung der Wurzelhaare an der Basis; B, C: ausgewachsene 
Wurzelhaare mit einer Verzweigung an der Spitze des Wurzelhaares; D, E: mehrfach verzweigte 
Wurzelhaare; F: unverzweigte Wurzelhaare des Wildtyps 

Die Expression von ROP1 ist für die Polarität und das Wachstum des Pollenschlauches von 
großer Bedeutung (s. 1. 7) (Li et al., 1999; Fu et al., 2001; Gu et al., 2005). ROP1 wird, wie 
hier nachgewiesen werden konnte, auch in Wurzeln exprimiert (Abb. 3. 5 A). Die fehlende 
Expression von rop1 in den Linien rop1 und rop1rop6 verursacht u. a. eine frühere Keimung, 
dies ist vermutlich auch Ursache für die Längenzunahme der Primärwurzel der Keimlinge von 


Ergebnisse 

rop1 bzw. rop1rop6 gegenüber dem Wildtyp. Die Überexpression von rop1 wirkt sich vor 
allem auf die Morphologie der Wurzelhaare aus und führt bei diesen zu einer häufigeren 
Verzweigung an der Basis oder der Spitze eines Wurzelhaares (Abb. 3. 15, Abb. 3. 16 A-C). 
Die Überexpression von rop6 verursacht eine Längenzunahme der Wurzelhaare (Abb. 3.14 B) 
und einen erhöhten Anteil verzweigter Wurzelhaare (Abb. 3. 15, Abb. 3. 16 D und E). 

3. 4 Interaktionsexperimente von Arabidopsis und den Mutanten rop1, rop6, rop1rop6, 
OX-rop1, OX-rop6, ric4 mit P. indica 
3. 4. 1 Ergebnisse der auf PNM-Medium durchgeführten Interaktionsexperimente 
Die auf MS-Medium vorkultivierten Pflanzen wurden nach 9 Tagen auf PNM-Medium 
umgesetzt und mit bzw. ohne P. indica weiterkultiviert (s. 2. 2. 4). Nach 2, 4, 6, 10 und 14 
Tagen wurde das Gewicht von Spross und Wurzel jeder Pflanze bestimmt. Graphisch 
dargestellt werden zunächst der 2., 6. und der 14. Tag der Frischmasse der Kontrollpflanzen, 
um den Einfluss der Mutation auf den Phänotyp der Pflanzen zu dokumentieren 
(Abb. 3. 17 A-C). In Abb. 3. 18 A und B wird der Einfluss von P. indica auf das 
Frischgewicht der Mutanten in Bezug auf das Frischgewicht des Wildtyps dargestellt. Es wird 
der 6. Kultivierungstag abgebildet, da an diesem Messpunkt der wachstumsfördernde Effekt 
von P. indica auf den Wildtyp eintritt (Abb. 3. 18 A). Weiterhin ist der 14. Tag für eine 
abschließende Bewertung der Interaktion dargestellt (Abb. 3. 18 B). Es wurden 
durchschnittlich 5 unabhängige Wachstumskinetiken mit 12 Kontrollpflanzen und 12 mit Pilz 
kultivierten Pflanzen für jeden Messpunkt ausgewertet. 
Mit Ausnahme der Linien ric4 und rop6 besitzen die Mutanten nach 2 Tagen auf PNM-
Medium eine größere Wurzelmasse als der Wildtyp. Die Linien OX-rop1 und rop1rop6 
zeigen die größte Gewichtszunahme auf 150 % verglichen mit dem Frischgewicht von 100 % 
des Wildtyps. Die Linie ric4 weist nur 50 % der Wurzelmasse des Wildtyps auf. Eine geringe 
Zunahme des Sprossgewichts zeigen die Linien rop1, OX-rop1, rop6 mit ca. 10 % und eine 
deutlich größere Masse des Sprosses besitzen die Linien OX-rop6 (auf 126 %) und rop1rop6 
(auf 155 %). Das Sprossgewicht der Linie ric4 liegt bei 73 % des Wildtyps. Die angegebenen 
Prozentzahlen sind die Mittelwerte aus den Wachstumskinetiken. Anhand dieser Ergebnisse 
ist eine Verschiebung des Wurzel-/Sprossverhältnisses in der Linie OX-rop1 zugunsten der 
Wurzel feststellbar, d. h. das Frischgewicht der Wurzel (+ 50 %) nimmt gegenüber dem 
Frischgewicht des Sprosses (+ 10 %) stärker zu (Abb. 3. 17 A). 
Am 6. Kultivierungstag (Abb. 3. 17 B) weisen die Mutanten der Linien OX-rop1 eine größere 
Wurzelmasse (160 %) als der Wildtyp auf, die Mutanten OX-rop6 und rop1rop6 besitzen 
neben einer größeren Wurzelmasse (152 % und 176 %) auch ein erhöhtes Sprossgewicht 
(140 % bis 146 %). Die Linie ric4 weist 71 % der Wurzelmasse des Wildtyps auf. 


Ergebnisse 

A 
AA 

0 
50 
100 
150 
200 
Frischgewicht in 
%
Wurzel 
Sproß 
WT rop1 OX-
--rop1 rop6 OX-rop6 rop1rop6 ric4 

---
B---
0 
50 
100 
150 
200 
--
Frischgewicht 
in 
% 
WT rop1 OX-rop1 rop6 OX-rop6 rop1rop6 ric4 
B 
C250 
C 
Frischgewicht in 
%


200 
150 
100 
50 
0 

WT rop1 OX-rop1 rop6 OX-rop6 rop1rop6 ric4 

Abb. 3. 17: Wurzel-bzw. 
Sprossgewicht des Wildtyps 
und der Mutanten am 2. Tag 
(A), 6. Tag (B) und 14. Tag (C). 

Die Kultivierung des Wildtyps 
und der Mutanten rop1, OXrop1, 
rop6, OX-rop6, rop1rop6 
und ric4 erfolgte auf PNM-
Medium. Das Frischgewicht des 
Wildtyps wurde mit 100 % 
bewertet und das Frischgewicht 
der Mutanten wurde im 
Verhältnis zu diesem betrachtet 
(5 unabhängige Experimente mit 
je 12 Pflanzen, Darstellung mit 
SE). 


Ergebnisse 

Nach 14 Tagen Kultivierung auf PNM-Medium (Abb. 3. 17 C) zeigen sich ausgeprägte 
Unterschiede bezüglich der Wurzelmasse zwischen Wildtyp und Mutanten mit Ausnahme der 
Linie ric4. Die Wurzelmasse der Linie OX-rop1 ist um 137 % erhöht, die Linien rop1, rop6, 
und rop1rop6 weisen 80 bis 90 % mehr Wurzelmasse als der Wildtyp auf. Die Linie ric4 
erreicht 92 % des Frischgewichts vom Wildtyp. In Abb. 3. 17 C ist eine Zunahme des 
Sprossgewichts in den Linien rop1 auf 126 % und rop6 auf 114 % verglichen mit dem 
Wildtyp feststellbar. Die Linie OX-rop1 zeigt im Gegensatz dazu eine Abnahme des 
Sprossgewichts um ca. 13 %. Die Linie OX-rop1 zeigt eine deutliche Verschiebung des 
Wurzel-/ Sprossverhältnisses zugunsten des Wurzelwachstums. 
Die Interaktion mit P. indica führt nach 4 bis 6 Tagen zu einer Zunahme des Spross- und 
Wurzelgewichts bei Arabidopsis. Am 6. Kultivierungstag mit P. indica weisen mit Ausnahme 
der Doppelmutante rop1rop6 alle Mutanten eine Zunahme des Frischgewichts von Spross und 
Wurzel auf (Abb. 3. 18 A). Der Wildtyp zeigt eine Gewichtszunahme von 30 % (Wurzel) 
bzw. 39 % (Spross). Die Zunahme des Frischgewichts von Spross und Wurzel ist in den 
Linien rop1, OX-rop1und OX-rop6 geringer als beim Wildtyp. Die Linie rop6 weist eine 
größere Zunahme der Wurzelmasse als der Wildtyp auf (52 %), der Sprosszuwachs bleibt 
jedoch mit 16 % hinter dem des Wildtyps (39 %) deutlich zurück. In Abb. 3. 17 B ist zu 
sehen, dass die Wurzelmasse von rop6 nur gering (7 %) die Wurzelmasse vom Wildtyp 
übersteigt. Die alleinige knock-out-Mutation von rop6 beeinflusst die Interaktion mit dem Pilz 
in Bezug auf eine Zunahme der Wurzelmasse zunächst positiv. Die fehlende Expression von 
rop1 und rop6 in der Doppelmutante rop1rop6 hat einen negativen Einfluss auf die 
Interaktion. Das Gewicht der Wurzel zeigt keinen Zuwachs, dass Sprossgewicht nimmt sogar 
durch die Kultivierung mit dem Pilz ab. Wie Abb. 3. 17 B zeigt, weist diese Mutante am 6. 
Tag ohne P. indica ein höheres Spross- und Wurzelgewicht als der Wildtyp auf (146 % bzw. 
176 %). 
Nach 14 Tagen Kultivierung mit P. indica zeigt der Wildtyp eine Zunahme des Spross- und 
Wurzelgewichts von ca. 80 %, alle Mutanten liegen weit unter diesem Wert (Abb. 3. 18 B) 
Auch die Zunahme des Wurzelgewichts der rop6-Mutanten bleibt nun deutlich hinter dem 
Wildtyp zurück. Auf Grund der stark verringerten Zunahme des Spross- und Wurzelgewichts 
durch die Kokultivierung im Vergleich zum Wildtyp konnte festgestellt werden, dass ROP1, 
ROP6 und RIC4 Einfluss auf die Interaktion von Arabidopsis mit P. indica haben. 


Ergebnisse 

A 
AA 

Abb. 3. 18: Zunahme des Frischgewichts des Sprosses und der Wurzel des Wildtyps und der 
Mutanten am 6. Tag (A) und 14. Tag (B) der Kokultivierung mit P. indica. Die Zunahme des 
Spross- und Wurzelgewichts der Mutanten rop1, OX-rop1, rop6, OX-rop6, rop1rop6, ric4 und des 
--20 
-10 
0 
10 
20 
30 
40 
50 
60 
70 
Zunahme 
des 
Frischgewichts 
in 
%
Wurzel 
Sproß 
WT rop1 OX-rop1 rop6 OX-rop6 rop1rop6 ric4 
---
B0 
10 
20 
30 
40 
50 
60 
70 
80 
90 
100 
--
Zunahme 
des 
Frischgewichts 
in 
% 
Wurzel 
Sproß 
WT rop1 OX-rop1 rop6 OX-rop6 rop1rop6 ric4 
B 
Wildtyps wurde nach 6 bzw. 14 Tagen Kultivierung mit P. indica auf PNM-Medium bestimmt. Das 
Frischgewicht der Kontrollen wurde mit 100 % bewertet (nicht dargestellt) und mit dem Frischgewicht 
der mit P. indica kultivierten Pflanzen ins Verhältnis gesetzt (5 unabhängige Experimente mit je 12 
Kontroll- bzw. 12 Versuchspflanzen, Darstellung mit SE). 

3. 4. 2 Ergebnisse der auf Erde durchgeführten Interaktionsexperimente 
Die Pflanzen wurden, wie in 2. 2. 4 beschrieben, in Töpfen mit Erde mit und ohne Zusatz von 
Pilzmyzel bis zur Samenreife kultiviert. Nach 17 Tagen, 5 Wochen (Abb. 3. 19 bis 3. 21) und 
15 Wochen (Abb. 3. 22) wurden die Pflanzen fotografiert. Am 15. Tag wurde die Länge des 
Sprosses, der Durchmesser der Rosette und die Anzahl der Knospen, Blüten und Schoten für 


Ergebnisse 

jede Pflanze bestimmt. Anhand dieser Daten wurden den Mittelwerten entsprechende 
Pflanzen ausgewählt, dokumentiert und ihre weitere Entwicklung beobachtet. Nach 5 Wochen 
Kultivierung zeigte der Wildtyp einen sichtbaren Sprosszuwachs, verursacht durch den Pilz. 
Die Mutanten rop1rop6 und rop1 sind ohne P. indica im Durchschnitt größer als der Wildtyp 
ohne Pilz und werden durch diesen im Wachstum gehemmt (Abb. 3. 19 und 3. 21). Die Linie 
ric4 weist eine dem Wildtyp entsprechende Größe auf und wird ebenfalls durch P. indica im 
Wachstum negativ beeinflusst (Abb. 3. 19). Die Mutanten der Linien rop6, OX-rop6 
(Abb. 3. 20) und OX-rop1 (Abb. 3. 21) zeigen keinen Sprosszuwachs durch den Pilz. 

WT rop1rop6 ric4 

- P. indica 
WT rop1rop6 ric4 

+ P. indica 
Abb. 3. 19: Kokultivierung von 
Arabidopsis, rop1rop6-und ric4Mutanten 
mit P. indica. Nach 
einer Kultivierungszeit von 5 
Wochen in Erde wurde der 
Einfluss von P. indica (+) im 
Vergleich zu den Kontrollen (


P. indica) auf den Sprosszuwachs 
dokumentiert. 
WT rop6 OX-rop6 

-P. indica 
WT rop6 OX-rop6 

+ P. indica 
Abb. 3. 20: Kokultivierung von 
Arabidopsis, rop6-Mutanten und 
rop6-Überexpressionsmutanten 
mit P. indica. Nach einer 5wöchigen 
Kultivierungszeit in 
Erde wurde der Einfluss von 

P. indica (+) im Vergleich zu den 
Kontrollen (-P. indica) auf den 
Sprosszuwachs des Wildtyps und 
der Mutanten dokumentiert. 

Ergebnisse 

WT rop1 OX-rop1 

-P. indica 
Abb. 3. 21: Kokultivierung von 
Arabidopsis, rop1-Mutanten und 
rop1-Überexpressionsmutanten 
mit P. indica. Nach einer 
Kultivierungszeit von 5 Wochen in 
Erde wurde der Einfluss von 

P. indica (+) im Vergleich zu den 
Kontrollen (-P. indica) auf den 
Sprosszuwachs dokumentiert. 
WT rop1 OX-rop1 

+ P. indica 
Abb. 3. 22: Kokultivierung von 
Arabidopsis und ric4-Mutanten 
mit P. indica. Nach einer 
Kultivierungszeit von 15 Wochen 
befinden sich die Pflanzen im 
Zustand der Samenreife. Der 
Einfluss von P. indica (+) auf den 
Sprosszuwachs im Vergleich zu 
den Kontrollen (-P. indica) wurde 
dokumentiert. 

WT WT ric4 ric4 

– P. indica + P. indica – P. indica + P. indica 
Nach 15 Wochen Kultivierung auf Erde befanden sich die Pflanzen im Zustand der 

Samenreife. Nur beim Wildtyp konnte ein deutlicher Sprosszuwachs durch den Pilz 

festgestellt werden. Bei den Mutanten rop6, OX-rop6 und OX-rop1 konnte kein 

Sprosszuwachs festgestellt werden, allerdings erreichten die Mutanten rop1, rop1rop6 und 

ric4 (Abb. 3. 22), die zunächst eine negative Beeinflussung durch den Pilz bezüglich des 

Sprosswachstums aufwiesen, nun die Größe der Kontrollen, demzufolge konnten sie das 

Wachstumsdefizit ausgleichen. Die durchschnittliche Sprossgröße der Mutanten ist am Ende 

der Kultivierung der Größe der Wildtyp-Kontrollpflanzen vergleichbar (Abb. 3. 22). 


Ergebnisse 

Mit Hilfe der in Erde durchgeführten Experimente konnten die Ergebnisse aus 3. 4. 1 bestätigt 
werden. ROP1, ROP6 und RIC4 nehmen Einfluss auf Wachstum und Entwicklung von 
Arabidopsis und beeinflussen vor allem im noch frühen Stadium die Interaktion mit P. indica. 

3. 4. 3 Nachweis der P. indica-Sporen in Arabidopsis und den Mutanten rop1, rop6, 
rop1rop6, OX-rop1, OX-rop6 und ric4 
Um die Besiedelung der Wurzeln durch den Pilz zu überprüfen, wurden die Wurzeln mit den 
in 2. 2. 14 beschriebenen Färbemethoden behandelt. Wie bereits erwähnt, sind ROP1, ROP6 
und RIC4 an der Regulation des Aktinzytoskeletts von Arabidopsis beteiligt. Von besonderem 
Interesse war es herauszufinden, ob es in den knock-out-Linien rop1, rop6, rop1rop6 oder 
ric4 bzw. den Überexpressionsmutanten OX-rop1 und OX-rop6 zu einer veränderten 
Besiedelung durch Sporen oder Hyphen kommt. Die verwendeten Wurzeln stammten aus 
Versuchen, die auf PNM-Medium und auf Erde durchgeführt wurden. Bereits nach 6 bis 10 
Tagen waren Pilzhyphen auf der Wurzeloberfläche nachweisbar. Nach einer Kultivierungszeit 
von 6 Wochen auf PNM-Medium waren intrazelluläre Chlamydosporen in allen Mutanten in 
der Rhizodermis und sogar im Xylem vom Wildtyp und der Mutante rop1rop6 nachweisbar 
(Abb. 3. 23 B, siehe Pfeil). Extrazelluläre Chlamydosporen wurden selten beobachtetet. Für 
den Nachweis der Sporen der auf Erde durchgeführten Experimente, wurden die im Abschnitt 

3. 4. 2 beschriebenen Pflanzen am Ende der Kultivierungszeit verwendet. Im Wildtyp und in 
allen Mutanten konnten Sporen nachgewiesen werden. Der Hauptanteil der Sporen befindet 
sich auf der Wurzeloberfläche. Zahlreiche Sporen befinden sich in der Rhizodermis 
(Abb. 3. 23 E), und passen sich der Form der Pflanzenzelle an und können diese auch 
vollständig ausfüllen. Die auf Erde kultivierten Pflanzen wurden wesentlich stärker vom Pilz 
besiedelt, als die auf PNM-Medium kultivierten Pflanzen. Ein Unterschied im Grad der 
Besiedelung, die zwischen jedem Individuum variierte, konnte nicht zwischen Mutanten und 
Wildtyp festgestellt werden. Es wurden mindestens die Wurzeln von je 5 Pflanzen pro Linie 
und Experiment mikroskopiert. Dabei wurde festgestellt, das auch nach zahlreichen 
Waschschritten mit A. dest. noch Myzel und Sporen an der Wurzeloberfläche hafteten. Daher 
und auf Grund der veränderten Wurzel- bzw. Wurzelhaarmorphologie wurde auf einen 
quantitativen Nachweis des Pitef 1-Gens von P. indica mittels PCR verzichtet. Pitef 1 kodiert 
für den Translationselongationsfaktor EF-1a von P. indica (Bütehorn et al., 2000). Die 
fehlende Expression von rop1 und/oder rop6 bzw. ric4, sowie die Überexpression von rop1 
oder rop6 verhindern nicht das Eindringen von Chlamydosporen in die Wurzel bzw. 
verändern nicht die Besiedelung durch Hyphen und Sporen. 

Ergebnisse 

A 
C 
A 
B 
D 
E F 
Abb. 3. 23: Nachweis von Pilzsporen in den Wurzeln des Wildtyps und der Mutanten. 

A) Sporen in Wurzelhaaren des Wildtyps, das Leitgewebe ist grün angefärbt, die Sporen sind pink 
angefärbt, Sporenansammlung unten links befindet sich auf der Wurzeloberfläche; B) länglich-ovale 
Sporen im Xylem der Mutante rop1rop6 und drei einzelne Sporen in der Rhizodermis; A und B: Die 
Wurzeln wurden nach 6 Wochen Kultivierung auf PNM-Medium mit dem Pianese-Farbgemisch 
angefärbt. C) unbesiedelte Wildtyp-Wurzel (Kontrolle); D) Pilzhyphen auf der Wurzeloberfläche des 
Wildtyps; E) stark intra- und extrazellulär besiedelte Wurzel von OX-rop6; F) möglicherweise eine 
eindringende Spore, die ihre Gestalt verändert; C-F: Die Wurzeln wurden nach 15 Wochen 
Kultivierung in Erde mit Tintenblau-Essigsäure gefärbt. Der Balken rechts unten im Bild repräsentiert 
eine Länge von 100 µm. 


Ergebnisse 

3. 5 Veränderung der Struktur des Aktinzytoskeletts in den Wurzeln der Mutanten 
rop1, rop6 und rop1rop6 
Zu den Elementen des pflanzlichen Zytoskeletts gehört neben den Mikrotubuli das F-Aktin. 
Das filamentöse (F)-Aktin besteht aus zwei Ketten polymerisierter G-Aktin-Monomere, die 
sich helixartig umeinanderwinden. Der Durchmesser eines Filaments beträgt 5-9 nm. Durch 
Aktin-bündelnde Proteine wie Villin, Fimbrin oder den Elongationsfaktor-1a können 
F-Aktinfilamente zu höheren Strukturen wie Aktinkabeln und Aktinbündeln verknüpft 
werden (s. 1. 8. 2) (Hussey et al., 2006). 
Die Bildung von Aktinbündeln und Aktinkabeln hat Bedeutung für die Zytoplasmaströmung, 
Zellarchitektur, Organellenbewegung und Fixierung der Vakuole in der Zelle (Staiger et al., 
1994). Die Bildung von Aktinbündeln spielt auch bei der Positionierung des Zellkerns in 
einem bestimmten Abstand zur Wurzelhaarspitze in wachsenden Wurzelhaaren eine Rolle 
(Ketelaar et al., 2002). In Epidermiszellen von Arabidopsis wurde eine Bildung von 
Aktinbündeln durch den Angriff von Pathogenen in kompatiblen und inkompatiblen 
Interaktionen mit zwei Peronospora parasitica-Isolaten und dem Nicht-Pathogen 
Phytophthora sojae am Penetrationsort ausgelöst (Takemoto et al., 2003). 
Für die Visualisierung des F-Aktins am 2. und 6. Tag der Interaktion zwischen dem 
Arabidopsis-Wildtyp sowie den Linien rop1, rop6 und rop1rop6 mit P. indica wurde das 
GFP-FABD2-Konstrukt verwendet (s. 2. 2. 13). Das GFP-FABD2-Konstrukt besteht aus der 

2. Aktin-bindenden Domäne (ABD2) von Fimbrin 1 (At4g26700, AtFim1), an dessen 
N-Terminus GFP fusioniert wurde (Voigt et al., 2005). AtFim1 bindet an Aktinfilamente und 
verbindet diese miteinander zu höheren Strukturen. Die 2. Aktin-bindende Domäne ABD2 
weist eine hohe Bindungsaffinität zu Aktinfilamenten in vivo auf und ist zur Beobachtung des 
Aktinzytoskeletts in verschiedenen Pflanzenarten und Geweben geeignet (Kovar et al., 2000; 
Wang et al., 2004). Die Transformation mit dem GFP-FABD2-Konstrukt hat keine 
phänotypische Auswirkung auf Arabidopsis (Voigt et al., 2005). In Interaktionsexperimenten 
mit P. indica verhielten sich die mit dem GFP-FABD2-Konstrukt transformierten Linien 
rop1, rop6, rop1rop6 einschließlich des Wildtyps wie die nicht transformierten Linien. 
Untersucht wurde das Aktinzytoskelett in den Wurzeln von je 10 Pflanzen pro Linie, 
kultiviert mit bzw. ohne P. indica. Da der Pilz häufig über die Wurzelhaare in die Wurzeln 
eindringt, wurde vor allem die Wurzelhaarzone mikroskopisch untersucht. Dargestellt in den 
folgenden Bildern (Abb. 3. 24 A-H) wird der 2. Tag der Interaktion. Am 2. Tag der 
Kultivierung besteht noch kein physischer Kontakt zwischen Pflanze und Pilz. Die 
Wurzelhaarzone bzw. Differenzierungszone schließt sich der Streckungszone an, in der die 
Zellen durch Längenwachstum ihre endgültige Größe erreichen. In der Wurzelhaarzone 
kommt es zur Ausbildung von Wurzelhaaren, wobei nur Trichoblasten zur Ausbildung von 
Wurzelhaaren in der Lage sind. 

Ergebnisse 

50µmE50µmF50µm 
50µm 50µm 
E 50µmF 
G H 
50µmC50µmA 
50µmC 50µmDC 
B 50µm 
Abb. 3. 24: Visualisierung des F-Aktins in den Wurzeln des Arabidopsis-Wildtyps und der 
Mutanten. Mit Hilfe des GFP-FABD2-Konstrukts (Voigt et al., 2005) wurde die Struktur des 
Aktinzytoskeletts im Wildtyp und in den Mutanten für den 2. Tag der Kultivierung ohne P. indica 
(-P. i.) bzw. mit P. indica (+ P. i.) untersucht. A: Wildtyp – P. i.; B: Wildtyp + P. i.; C: rop1 – P. i.; 

D: rop1 + P. i.; E, G: rop1rop6 – P. i.; F, H: rop1rop6 + P. i. 

Ergebnisse 

In den Rhizodermiszellen der Wurzelhaarzone sind Aktinfilamentbündel, oft in 
Längsrichtung, nachweisbar (Voigt et al., 2005). Diese Beobachtung konnte ebenfalls in den 
Rhizodermiszellen des Wildtyps (Abb. 3. 24 A und B) gemacht werden. 
In Abb. 3. 24 A und B ist die Zusammenlagerung des F-Aktins zu Aktinbündeln (ungeordnet, 
antiparallel erscheinende Strukturen) sichtbar, diese Aktinbündel traten teilweise in den mit 

P. indica kultivierten Wurzeln verstärkt auf. Auch in den Mutanten rop1 
(Abb. 3. 24 C und D) und rop6 (nicht abgebildet) kam es zur Bildung von Aktinbündeln in 
Rhizodermiszellen, aber in geringerem Maße. In den Mutanten der Linie rop1rop6 
(Abb. 3. 24 E-H) konnte in keiner der untersuchten Wurzeln unabhängig von der Kultivierung 
die Bildung von Aktinbündeln beobachtet werden. Die Rhizodermiszellen der Doppelmutante 
rop1rop6 weisen wie der Wildtyp das meist an der Zellmembran liegende diffuse F-Aktin auf 
(Abb. 3. 24 G, älterer Bereich der Wurzelhaarzone), wirken aber auf Grund der fehlenden 
Aktinbündel und Aktinstränge bzw. -kabel (parallel erscheinende Ausrichtung des F-Aktins) 
„leer“. 
Das Aktinzytoskelett ist von großer Bedeutung für das polar ausgerichtete Wachstum der 
Wurzelhaare. Zunächst kommt es zu einer Auswölbung an der Stelle, an welcher ein 
Wurzelhaar ausgebildet wird (Abb. 3. 24 C, D, F). Diese Auswölbungen der Wurzelzellen 
besitzen ein ausgeprägtes Netzwerk aus F-Aktin und Aktinbündeln (Voigt et al., 2005). In der 
Mutante rop1rop6 konnten keine Aktinbündel an den Auswölbungen der Wurzelzellen 
gefunden werden. Das Auftreten von diffusem F-Aktin ist in der Mutante rop1rop6 
(Abb. 3. 24 F) jedoch im Gegensatz zu den Mutanten rop1 (Abb. 3. 24 C, D) und rop6 (nicht 
abgebildet) sehr ausgeprägt. Während des Spitzenwachstums findet man in den Wurzelhaaren 
des Wildtyps Aktinkabel entlang der Wachstumsrichtung, die kurz vor der Wurzelhaarspitze 
enden. An der Wurzelhaarspitze tritt vor allem ein Netzwerk aus feinem F-Aktin auf (Voigt et 
al., 2005). Auch in den Mutanten rop1 und rop6 wurden in wachsenden Wurzelhaaren z. T. 
Aktinkabel nachgewiesen (nicht dargestellt), in der Doppelmutante rop1rop6 konnten jedoch 
keine Aktinkabel nachgewiesen werden (Abb. 3. 24 G). In Abb. 3. 24 G befinden sich die 
Wurzelhaare im Längenwachstum, es ist nur feines, an der Plasmamembran lokalisiertes 
F-Aktin zu sehen. In Abb. 3. 24 H sind zahlreiche Wurzelhaaranlagen mit feinem, 
membranständigen F-Aktin zu sehen. Abb. 3. 24 G-H bestätigen die normale Insertion der 
Wurzelhaare am Ende der Zelle in Richtung der Wurzelspitze (Masucci und Schiefelbein, 
1994) in der Mutante rop1rop6 (s. 3. 3. 2). In Abb. 3. 24 E ist ein an der Basis verzweigtes 
Wurzelhaar der Mutante rop1rop6 zu sehen. 
Am 6. Tag der Interaktion (Abb. 3. 25) wurden die Wurzeln nach ihrer Lage zum Pilz in 
entfernt liegende und solche mit physischem Kontakt zum Pilz eingeteilt. Die Wurzeln mit 
direktem Pilzkontakt durchwachsen z. T. das ausgestanzte Pilzstück oder liegen diesem an. 
Im Zentralzylinder der Wurzel differenzieren sich zu diesem Zeitpunkt die Leitgewebe. 
Zunächst werden die Protophloemelemente zur Versorgung der wachsenden Wurzel 
ausgebildet. Mit dem Längenwachstum der Wurzelhaare beginnt die Differenzierung von 

Ergebnisse 

Protoxylemelementen. In den mit P. indica kultivierten Wurzeln des Wildtyps ist die 
Ansammlung von F-Aktin-Strängen im Leitgewebe besonders stark. In den Zellen der 
Rhizodermis sind Aktinbündel sichtbar (Abb. 3. 25 A und B). In den Wildtyp-Kontrollen war 
die Akkumulation des F-Aktins weniger stark ausgeprägt, als in den infizierten Wurzeln. Wie 
in Abb. 3. 25 C zu sehen ist, treten im Leitgewebe einzelne F-Aktin-Stränge auf und in den 
Zellen kommt es zur Bildung von Aktinbündeln. In einigen Wurzeln der Kontrollen war die 
Akkumulation des F-Aktins zu Strängen und Bündeln sehr viel schwächer ausgeprägt, als in 
Abb. 3. 25 C. Die Kultivierung mit P. indica führte in den Wurzeln des Wildtyps unabhängig 
vom direkt vorhandenen Kontakt zur verstärkten Akkumulation des F-Aktins zu 
Aktinbündeln und Aktinsträngen. In den Mutanten der Linien rop1 und rop6 kam es seltener 
in den Kontrollen und in infizierten Wurzeln zur Bildung von Aktinbündeln (Abb. 3. 25 D 
und E) und Aktinsträngen in der Rhizodermis und im Leitgewebe. Einige Wurzeln zeigten 
auch bei direktem Kontakt mit dem Pilz keine Bildung von Aktinbündeln (Abb. 3. 25 F). In 
den Mutanten von rop1rop6 (Abb. 3. 25 G und H) konnten unabhängig von der Kultivierung 
ohne bzw. mit Pilz keine Aktinbündel oder Aktinstränge nachgewiesen werden, dies stimmt 
mit den Ergebnissen des 2. Tages der Interaktion überein. 
Am 17. Tag der Interaktion wurden die mit P. indica kultivierten Wurzeln aller Linien von 
den Hyphen des Pilzes bewachsen und auch die zunehmende Differenzierung der Wurzel 
machte zufriedenstellende Aufnahmen unmöglich, aus diesem Grund wurde auf eine 
Auswertung verzichtet. 
Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass ROP1 und ROP6 für die Assemblierung des F-
Aktins zu Aktinbündeln und Aktinkabeln von großer Bedeutung sind. Das Fehlen von ROP1 
oder ROP6 führt zu einer Reduktion von Aktinbündeln und Aktinkabeln in den Wurzelzellen 
der Mutanten. In der Doppelmutante rop1rop6 fehlen Aktinbündel und Aktinkabel völlig. Im 
Wildtyp kommt es durch die Interaktion mit P. indica zu einer verstärkten Ausbildung von 
Aktinbündeln und Aktinkabeln vor allem im Leitgewebe. Eine Bildung von Aktinbündeln ist 
in der Doppelmutante rop1rop6 nicht möglich, demzufolge haben die kleinen G-Proteine 
ROP1 und ROP6 direkten Einfluss auf die Interaktion von Arabidopsis mit P. indica. 


Ergebnisse 

A50 µmB50 µmC50 µmD50 µmA 50 µm B 50 µm 
C50 µmC 50 µm D50 µmD 50 µm 
E50 µmE 50 µm 
G 50 µm 
F 50 µm 
H 50 µm 
Abb. 3. 25: Visualisierung des F-Aktins in den Wurzeln des Arabidopsis-Wildtyps und der 
Mutanten. Mit Hilfe des GFP-FABD2-Konstrukts (Voigt et al., 2005) wurde die Struktur des 
Aktinzytoskeletts im Wildtyp und in den Mutanten für den 6. Tag der Kultivierung ohne P. indica 
(-P. i.) bzw. mit (+P. i.) untersucht. A: Wildtyp +P. i., Wurzel hat keinen direkten Pilzkontakt; B: 
Wildtyp +P. i., Wurzel hat direkten Pilzkontakt; C: Wildtyp –P. i.; D: rop1 +P. i., Wurzel mit 
direktem Pilzkontakt; E, F: rop6 +P. i., Wurzel mit direktem Pilzkontakt; G: rop1rop6 –P. i.; H: 
rop1rop6 +P. i., Wurzel mit direktem Pilzkontakt 


Ergebnisse 

3. 6 Auswertung der microarray-Experimente 
Für den 2. und 6. Tag der Interaktion des Arabidopsis-Wildtyps bzw. der Doppelmutante 
rop1rop6 mit P. indica wurden microarray-Analysen durchgeführt, um festzustellen, welche 
Gene in Arabidopsis durch die Kultivierung mit dem Pilz reguliert werden (s. 2. 2. 16). Die 
Vergleichsanalysen der Einzelversuche von Arabidopsis -P. indica/ Arabidopsis + P. indica 
bzw. der Doppelmutante rop1rop6 -P. indica/ rop1rop6 + P. indica erfolgte mit der 
Affymetrix GeneChip Operating Software (GCOS 1.4). 
Am 2. und 6. Tag der Interaktion wurden ca. 70 % der auf dem Chip enthaltenen mRNAs 
exprimiert (insgesamt sind 24 000 Arabidopsis-Gensequenzen auf dem Gesamt-Genom Chip 
enthalten). In Tab. 3. 2 ist der Anteil der durch den Pilz regulierten mRNAs dargestellt. 
Da für jeden Zeitpunkt (2. und 6. Tag) nur eine Vergleichsanalyse durchgeführt wurde, ist ein 
statistischer Vergleich der regulierten mRNAs, d. h. mRNAs, die durch den Pilz hoch- bzw. 
herunterreguliert wurden, zwischen dem Wildtyp und der Doppelmutante rop1rop6 nicht 
möglich. In der Tab. 3. 2 ist zu sehen, dass im Wildtyp nach 2 Tagen ein höherer Prozentsatz 
regulierter mRNAs als bei der Doppelmutante auftrat, hingegen war am 6. Tag der Interaktion 
in der Doppelmutante ein höherer Anteil regulierter mRNAs gegenüber dem Wildtyp 
feststellbar. Dies legt die Vermutung nahe, das ROP1 und/oder ROP6 eine entscheidende 
Rolle in der Vermittlung der frühen Erkennung des Pilzes spielen könnten und eine knockout-
Mutation zu einer verzögerten Antwort auf den Pilz führt. 
Die durchgeführten microarrays bildeten die Grundlage zur Auswahl von Genen, deren 
mRNA-Expression mittels real-time PCR überprüft wurde. Anhand der Chip-Daten wurde 
übereinstimmend mit der TAIR-Datenbank (The Arabidopsis Information Resource) zur 
Expression von mRNAs in Arabidopsis-Wurzeln festgestellt, dass die aus der 
Pathogenabwehr bekannten Proteine PR1, PR5 (pathogenesis-related protein1 bzw. 5) 
(Uknes et al., 1992; Stein et al., 2008) sowie LOX3 (lipoxygenase3) (Thatcher et al., 2009), 
PDF1.2 (plant defensin, PR-12 Familie) (Sels et al., 2008) und ERF1 (ethylene response 
factor1) in Wurzeln nicht exprimiert werden und somit eine Analyse dieser mRNAs mit realtime 
PCR nicht sinnvoll war. 
In den Wildtyp-microarrays waren die mRNAs aller rop-GTPasen nachweisbar und wurden 
von der GCOS 1.4 Software mit present (nachweisbar) (s. 2. 2. 16) bewertet. Die mRNAs 
rop1 und rop6 wurden in der Doppelmutante auf Grund ihrer geringen Signalintensität von 
der GCOS 1.4-Software mit absent (nicht nachweisbar) bewertet. Die Analysen der 
microarrays des Wildtyps und der Mutante lieferten keinen Hinweis auf eine signifikante 
Regulation der mRNAs der rop-GTPasen (ROP1 bis ROP11) durch den Pilz. Die mRNAs der 
ric-Gene (ROP-Interactive CRIB-Motiv enthaltende Proteine, Wu et al., 2001) zeigten 
ebenfalls keine signifikante Regulation durch den Pilz, weder im Wildtyp noch in der 
Doppelmutante. Die mRNAs von ric1, ric2, ric4 und ric10 zeigten eine geringe 
Signalintensität, waren aber im Gegensatz zu den Blüten-spezifischen rics (ric3, ric5 und 


Ergebnisse 

ric6, Wu et al., 2001) in den microarrays und in der quantitativen RT-PCR (nicht abgebildet) 

nachweisbar. Über ric7, ric8 und ric9 gaben die durchgeführten microarrays keine Auskunft. 

Tab. 3. 2: Überblick über den Anteil regulierter mRNAs im Wildtyp und der Doppelmutante 

rop1rop6. Mit Hilfe von microarrays wurde der Anteil regulierter mRNAs in Wurzeln des Wildtyps 
und der Doppelmutante für den 2. und 6. Tag der Interaktion mit P. indica untersucht. 

Wildtyp 
-P.i./+ P.i. 
2. Tag 
rop1rop6 
-P.i./+ P.i. 
2. Tag 
Wildtyp 
-P.i./+ P.i. 
6. Tag 
rop1rop6 
-P.i./+ P.i. 
6. Tag 
exprimierte mRNAs 
regulierte mRNAs 
negativ regulierte mRNAs 
positiv regulierte mRNAs 
72,0 % 
11,0 % 
5,5 % 
5,5 % 
72,0 % 
5,0 % 
3,0 % 
1,6 % 
71,0 % 
5,5 % 
2,1 % 
3,4 % 
73,0 % 
8,0 % 
4,2 % 
3,8 % 

3. 7 Ergebnisse der real-time PCR-Experimente 
Anhand der microarrays wurden die folgenden, z. T. aus der Pathogenabwehr bekannten 
Gene für eine real-time PCR Analyse ausgewählt: At5g38910 (germin-like protein), 
At2g43510 (trypsin inhibitor), At2g43570 (chitinase), At5g26920 (calmodulin-binding 
protein), At2g02930 (gstf3), At1g02930 (gstf6) und At4g29340 (profilin4). Den genannten 
Genen war ein change call gemeinsam, d. h. das Expressionsverhältnis zwischen Kontrolle 
(-P. i.) und Behandlung (+ P. i.) unterscheidet sich signifikant voneinander (s. change pvalue, 
s. 2. 2. 16). Es wurde aber auch die Regulation von mRNAs untersucht, die keine 
signifikanten Veränderungen aufwiesen, deren Unterschiede in den Signalintensitäten 
zwischen Kontrolle und Behandlung jedoch auf eine mögliche Regulation hinwiesen. Aus 
diesem Grund wurde mittels real-time PCR untersucht, ob die Mutation von rop1 und rop6 zu 
einer verstärkten Expression der mRNA von rop2 führt, da die Signalintensität als Maß für 
die Häufigkeit eines Transkripts von rop2 am 6. Tag der Interaktion ohne und mit P. indica in 
der Doppelmutante gegenüber dem Wildtyp um 40 % erhöht war. Weiterhin zeigte sich eine 
geringe Zunahme der Transkriptmengen von rop3 und rop11 im Wildtyp am 6. Tag durch 

P. indica. Die mRNAs von ric2 und ric4 zeigten am 6. Tag eine Abnahme der 
Transkriptmengen durch P. indica und wurden aus diesem Grund ebenfalls mit real-time PCR 
untersucht. 
In Abb. 3. 26 A und B sind die Transkript-Level von At5g38910, einem germin-like protein, 
dargestellt. Germine und germin-like proteins (GLPs) gehören zu einer großen 
Multigenfamilie, über ihre Funktionen ist z. T. nur wenig bekannt, aber einige GLPs sind 
z. B. für die Pathogenabwehr von Bedeutung (Donaldson et al., 2001, Knecht et al., 2010). 
Durch die Interaktion mit P. indica kam es am 2. und 6. Tag im Arabidopsis-Wildtyp und in 
den Mutanten rop1, rop6 und rop1rop6 zu einer unterschiedlich starken Zunahme des 

Ergebnisse 

mRNA-Transkripts von At5g38910 (Abb. 3. 26 A und B). Da die Transkriptlevel 
(logarithmiert zur Basis 2) extrem voneinander abweichen, wird jedes Experiment einzeln 
dargestellt. Im 1. Experiment für den Wildtyp (Abb. 3. 26 A) war das Transkriptlevel von 
At5g38910 durch P. indica z. B. 158-fach (Vergleich microarray: 27,3) erhöht, im 2. 
Experiment lag jedoch nur eine 3-fache Zunahme der Transkriptmenge vor. Aufgrund der 
vorliegenden Ergebnisse konnte festgestellt werden, dass die Regulation von At5g38910 
unabhängig von den knock-out-Mutationen rop1 und rop6 ist und durch P. indica bereits in 
der frühen Phase der Interaktion ausgelöst wird. Ein möglicher Grund für die großen 
Schwankungen der Transkriptmengen kann die entwicklungsabhängige Expression von 
Germinen und GLPs in Keimlingen sein (Bernier et al., 2001; Zimmermann et al., 2006). Die 
durchgeführten microarrays geben ebenfalls Hinweise auf eine entwicklungsabhängige 
Expression von At5g38910. Am 2. Tag der Interaktion lagen die Signalintensitäten im 
Kontrollversuch (- P .i) bei 5,9 (WT) und 11,1 (rop1rop6), die mRNA war folglich kaum 
detektierbar und wurde erst durch den Kontakt mit dem Pilz extrem hochreguliert (WT: 
546,5; rop1rop6: 121,3). Am 6. Tag der Interaktion lagen die Signalintensitäten im 
Kontrollversuch bei 81,1 (WT) und 88,8 (rop1rop6). So könnte schon ein veränderter 
Erntezeitpunkt der Wurzeln von wenigen Stunden die Transkriptmenge beeinflusst haben. 

mRNA-
Level + 
P.
i 
./
- 
--
P.
i. 
(
log2) 
mRNA-Level 
+ 
P.i. 
/-
P.i. 
(
log2) 

A 
AAA

8 
7 
6 
5 
4 
3 
2 
1 
0 

B 
BB 

6 
5 
4 
3 
2 
1 
0 

WT rop1 rop6 rop1rop6 


WT rop1 rop6 rop1rop6 


ge
gegegeger
rrrrm
mmmmin-l
in-lin-lin-lin-li
iiiik
kkkke
eeee pr 
prprprpro
oooot
tttte
eeeei
iiiin 
nnnn 
(
((((A
AAAAt
tttt5g3
5g35g35g35g38910
8910891089108910) 
)))) 

Abb. 3. 26: mRNA-Level (log2) 
von At5g38910 am 2. Tag (A) 
und 6. Tag (B) der Interaktion 
zwischen P. indica, dem Wildtyp 
und den Mutanten. Die mRNA-
Level von At5g38910 (germin-like 
protein) wurden in den Wurzeln 
des Wildtyps und der Mutanten 
rop1, rop6 und rop1rop6 mit realtime 
PCR untersucht (mRNA aus 3 
unterschiedlichen Experimenten, 
Referenzgen gapC, jeder Balken 
repräsentiert ein Experiment). 


Ergebnisse 

In Abb. 3. 27 A und B ist die Expression von atti1 (Trypsin Inhibitor Protein1, At2g43510) 
dargestellt. Das Protein ATTI1 gehört zur Familie der Defensin-ähnlichen Proteine (DEFL). 
ATTI1 wird auf Grund seiner Funktion den Proteinase-Inhibitoren zugeordnet. Diese werden 
in vielen Pflanzenarten produziert und können z. B. von Botrytis cinerea gebildete Proteasen 
in vitro hemmen (Dunaevski et al., 2005). In Abb. 3. 27 A ist die Regulation der mRNA von 
atti1 am 2. Tag der Interaktion mit P. indica im Wildtyp und in den Mutanten rop1, rop6 und 
rop1rop6 dargestellt. Durch den Kontakt mit P. indica erfolgte im Wildtyp und in den 
Mutanten rop1, rop6 und rop1rop6 eine verstärkte Transkription von atti1. Im Wildtyp wurde 
atti1 im Mittel doppelt so stark exprimiert wie in den Mutanten rop1, rop6 und rop1rop6. Das 
Fehlen einer GTPase führte demzufolge zu einer geringeren Transkription von atti1 im frühen 
Stadium der Interaktion. Die fehlende Expression beider GTPasen in der Doppelmutante 
veränderte das Transkriptionslevel verglichen mit den einfachen knock-out-Mutanten kaum. 
Am 6. Tag der Interaktion (Abb. 3. 27 B) war atti1 im Wildtyp weiterhin hochreguliert, die 
Expression war aber geringer als am 2. Tag. In den Mutanten der Linien rop1 und rop6 war 
das Transkriptlevel von atti1 am 6. Tag höher als im Wildtyp. In der Linie rop1rop6 war das 
Transkriptlevel von atti1 mit dem des Wildtyps vergleichbar (Abb. 3. 27 B). 
Ein ähnliches Bild lieferten die real-time Ergebnisse von At2g43570, einer chitinase und 
At5g26920 (cbp60g), einem calmodulin-binding protein (Abb. 3. 27 A und B). Pflanzliche 
Chitinasen sind u. a. an der Abwehr von Pathogenen beteiligt, sie spielen aber auch eine Rolle 
in Wachstums- und Entwicklungsprozessen (Kasprzewska, 2003). Die Interaktion 
Calmodulin-bindender Proteine wie At5g26920 mit Calmodulin ist Ca2+-abhängig, ein Ca2+Einstrom 
in das Zytoplasma wird durch zahlreiche abiotische und biotische Faktoren 
ausgelöst (Reddy et al., 2002). Die Expression von At2g43570 und At5g26920 (cbp60g) 
wurde durch den Pilz im Wildtyp und in den Mutanten verstärkt, die Transkription war am 

2. Tag der Interaktion im Wildtyp stärker hochreguliert als in den Mutanten (Abb. 3. 27 A). 
Am 6. Tag war die Transkription von At2g43570 und cbp60g in den Mutanten von rop1 und 
rop6 höher als im Wildtyp, in der Doppelmutante war die Transkriptmenge von At2g43570 
und cbp60g mit der des Wildtyps vergleichbar (Abb. 3. 27 B). Dies führt zu der Hypothese, 
dass eine Regulation der Transkription als Antwort auf P. indica durch das Fehlen beider 
GTPasen stärker verzögert wird. 
Glutathion S-Transferasen werden durch verschiedene Stress-auslösende Faktoren in Pflanzen 
hochreguliert (Wagner et al., 2002). Am 2. und 6. Tag der Interaktion mit dem Pilz wurde 
gstf6 im Wildtyp und in den Mutanten rop1, rop6 und rop1rop6 verstärkt exprimiert 
(Abb. 3. 27 A und B). In den Mutanten ist kein wesentlicher Unterschied zur Regulation von 
gstf6 feststellbar, demzufolge ist das Fehlen einer oder beider GTPasen in den knock-out-
Mutanten für die Expression von gstf6 ohne Bedeutung. 
Am 2. Tag der Interaktion wurde gstf3 nur im Wildtyp hochreguliert (Abb. 3. 28 A). Die 
Expression von gstf3 war am 6. Tag der Interaktion in den Mutanten und im Wildtyp 

A-
0 
2 
4 
6 
8 
10 
12 
14 
16 
18 
20 
22 
24 
WT rop1 rop6 rop1rop6 
gstf6 (At1g02930) 
A 
mRNA-
Level 
+
P.
i.
/-
P.
i. 
B0 
2 
4 
6 
8 
10 
12 
14 
mRNA-
Level 
+ 
P.i. 
/-
P.
i. 
WT rop1 rop6 rop1rop6 
B 
0 
2 
4 
6 
8 
10 
12 
14 
16 
18 
20 
22 
24 
WT rop1 rop6 rop1rop6 
gstf6 (At1g02930) 
A 
mRNA-
Level 
+
P.
i.
/-
P.
i. 
B0 
2 
4 
6 
8 
10 
12 
14 
mRNA-
Level 
+ 
P.i. 
/-
P.
i. 
WT rop1 rop6 rop1rop6 
B 
Ergebnisse 

reguliert, wobei die Linie rop1rop6 eine größere Transkriptmenge aufwies als der Wildtyp 
(Abb. 3. 28 B). 
In Pflanzenzellen ist das Aktinzytoskelett in zahlreiche wichtige Prozesse involviert, wie 
Zellteilung, Morphogenese, Zytoplasmaströmung, Wurzelhaarwachstum und Pathogenabwehr 
(Baluška et al., 2000, Mathur und Hülskamp, 2002, Schütz et al., 2006). Zahlreiche Proteine 
nehmen Einfluss auf die Struktur des Aktinzytoskeletts, dazu gehört auch Profilin (Carlsson et 
al., 1977; Baluška et al., 2000). Die microarray-Analysen zeigten eine Regulation für 
profilin4. In Abb. 3. 28 A ist zu sehen, das profilin4 im Wildtyp leicht hochreguliert wurde, 
jedoch nicht in den Mutanten rop1, rop6 und rop1rop6. Die Linien rop6 und rop1rop6 
zeigten eine Abnahme des profilin4–Transkriptlevels um 20 % am 2. Tag der Interaktion. Am 

6. Tag der Interaktion wurde profilin4 im Wildtyp weiterhin hochreguliert, für die Mutante 
rop1 war auf Grund des Standardfehlers die Regulation von profilin4 nicht auswertbar, die 
Mutanten rop6 und rop1rop6 zeigten jedoch nur eine sehr geringe (rop6) bzw. keine 
Zunahme des Transkriptlevels (rop1rop6) von profilin4 (Abb. 3. 28 B). 
trypsin inhibitor atti1(At2g43
4343510) 
510)510) 

chitinase (At2g43570) 

cam-
--bind. protein cbp60g (At
AtAt5
55g
gg2692
269226920
00) 
)) 

Abb. 3. 27: mRNA-Level 
von At2g43510, At2g43570, 
At5g26920 und At1g02930 
am 2. Tag (A) und 6. Tag (B) 
der Interaktion von P. indica 
mit dem Wildtyp und den 
Mutanten. Die mRNA-Level 
wurden in den Wurzeln des 
Wildtyps und der Mutanten 
rop1, rop6 und rop1rop6 mit 
real-time PCR untersucht 
(mRNA aus 3 verschiedenen 
Experimenten, Referenzgen 
gapC, Darstellung mit SE). 


3 
3,5 
3 
3,5 pr
prpr
of
ofof
i
ii
l
ll
i
ii
n
nn
4 
44 
0 
0,5 
1 
1,5 
2 
2,5 
mRNA-Level 
+ 
P.
i. 
/-
P.
i. 
WT rop1 rop6 rop1rop6 
0 
0,5 
1 
1,5 
2 
2,5 
WT rop1 rop6 rop1rop6 

A
AAB 
BB

Ergebnisse 

g
gggs
ssstf3 
tf3tf3tf3 

Abb. 3. 28: mRNA-Level von At2g02930 (gstf3) und At4g29340 (profilin4) am 2. (A) und 6. Tag (B) 
der Interaktion von P. indica mit dem Wildtyp und den Mutanten. Die mRNA-Level wurden in den 
Wurzeln des Wildtyps und der Mutanten rop1, rop6 und rop1rop6 mit real-time PCR untersucht 
(mRNA aus 3 unterschiedlichen Experimenten, Referenzgen gapC, Darstellung mit SE). 

Das Fehlen der GTPasen ROP1 und/oder ROP6 hat den vorliegenden Ergebnissen zufolge 
einen Einfluss auf die durch P. indica verursachte mRNA-Regulation von atti1, chitinase 
At2g43570, cbp60g, gstf6, gstf3 und profilin4 in den Wurzeln des Arabidopsis-Wildtyps und 
der Mutanten. Im Wildtyp erfolgte die vom Pilz ausgelöste Regulation der Transkription von 
atti1, chitinase At2g43570, cbp60g, gstf6, gstf3 und profilin4 schnell. Die Expression dieser 
aus der Pathogenabwehr bekannten Gene war am 6. Tag weniger stark reguliert als am 2. Tag. 
Die knock-out-Mutationen von ROP1 und/oder ROP6 führten zu einer verzögerten Antwort 
auf den Pilz, die sich in der Zunahme der Transkription der untersuchten Gene am 6. Tag 
zeigte. In den knock-out-Mutanten wies die mRNA von profilin 4 keine Hochregulation durch 
den Pilz auf (Abb. 3. 27 A, B und Abb. 3. 28 A, B). 
In Abb. 3. 29 A und B sind die jeweiligen Transkriptionslevel der mRNAs von rop2, rop3, 
rop11, ric2 und ric4 am 2. und 6. Tag der Interaktion von P. indica mit der Doppelmutante 
rop1rop6 zu sehen. P. indica hatte den real-time PCR-Ergebnissen zufolge keinen Einfluss 
auf die Expression der untersuchten Gene in der Doppelmutante. Auch im Wildtyp war eine 
Regulation von rop1, rop2, rop3, rop6, rop11, ric2 und ric4 durch die Interaktion mit dem 
Pilz nicht nachweisbar (Abb. 3. 30 A und B). 
In Abb. 3. 31 A und B ist die Expression von rop2 in der Doppelmutante gegenüber dem 
Wildtyp dargestellt. Das Fehlen von ROP1 und ROP6 führte nicht, wie auf Grund der 
microarrays vermutet wurde, zu einer verstärkten Transkription von rop2 in der Linie 
rop1rop6 weder in den Kontrollen (Abb. 3. 31 A) noch in den mit Pilz kultivierten Pflanzen 
(Abb. 3. 31 B). 


Ergebnisse 

A
AAB 
BBB 


r
rrrrop2 
op2op2op2op2 
-
rop3rop11ric4ric2-
0 
1 
2 
mRNA-Levelrop1rop6 
+ 
P.
i.
/-
P.
i. rop3rop11ric4ric2-
rop3rop11ric4ric2rop3 
rop11 
ric4 
ric2 
0 
1 
2 
1 
mRNA-Level 
rop1rop6 
+
P.
i.
/-
P.
i. 
Abb. 3. 29: mRNA-Level von rop2, rop3, rop11, ric2 und ric4 am 2. (A) und 6. Tag (B) der 
Interaktion der Doppelmutante rop1rop6 mit P. indica. Die mRNA-Level wurden in den Wurzeln 
von rop1rop6 mit real-time PCR untersucht (mRNA aus 3 unterschiedlichen Experimenten, 
Referenzgen gapC, Darstellung mit SE). 

-
rop6rop2rop3rop11ric4ric2rop1-
AB-
0 
1 
2 
1 
-
rop6 
rop2 
rop3 
rop11 
ric4 
ric2 
rop1 
mRNA-Level 
WT 
+
P.
i.
/-
P.
i. 
A B 
0 
1 
2 
1 
mRNA-
Level 
WT+ 
P.
i 
./
-
P.
i. 
Abb. 3. 30: mRNA-Level von rop1, rop2, rop3, rop6, rop11, ric2 und ric4 am 2. (A) und 6. Tag (B) 
der Interaktion des Wildtyps mit P. indica. Die mRNA-Level wurden in den Wurzeln des Wildtyps 
mit real-time PCR untersucht (mRNA aus 3 unterschiedlichen Experimenten, Referenzgen gapC, 
Darstellung mit SE). 

A
AAB 
BB 

2. TagderInteraktion6. TagderInteraktion-
0 
1 
2 
rop2 
mRNA-Level 
WT-
P.
i. 
/ 
rop1rop6 
-
P.
i. 
2. TagderInteraktion6. TagderInteraktion2. Tag der Interaktion 
6. Tag der Interaktion 
0 
1 
2 
rop2 
mRNA-
Level WT+
P.
i.
/rop1rop6+ 
P.
i. 
Abb. 3. 31: mRNA-Level von rop2 im Wildtyp und in der Doppelmutante rop1rop6 am 2. und 6. 
Tag der Interaktion ohne P. indica (A) und mit P. indica (B). Die mRNA-Level wurden in den 
Wurzeln des Wildtyps und der Doppelmutante rop1rop6 mit real-time PCR untersucht (mRNA aus 3 
unterschiedlichen Experimenten, Referenzgen gapC, Darstellung mit SE). 


Ergebnisse 

3. 8 Ergebnisse der Ca2+-Messungen in den Arabidopsis-Apoaequorin-Transformanten 
Veränderungen des zytosolischen Ca2+-Spiegels werden durch zahlreiche abiotische und 
biotische Stimuli hervorgerufen (Knight et al., 1991; Kiegle et al., 2000, Blume et al., 2000). 
Der aus P. indica isolierte Zellwandextrakt (ZWE) verursacht in den Wurzelzellen von 
Arabidopsis-Apoaequorin-Transformanten (s. 2. 2. 8. 2) einen schnellen Anstieg des 
zytosolischen Ca2+-Spiegels (Vadassery et al., 2009a). 
In Pollenschläuchen reguliert die ROP1-GTPase die Formation eines an der Spitze des 
Pollenschlauches fokussierten Ca2+-Gradienten (Li et al., 1999; Gu et al., 2005). Durch die 
Interaktion von ROP1 mit dem pollenspezifischen Protein RIC3 kommt es zur Ca2+Akkumulation 
an der Spitze des Pollenschlauches auf Grund eines Ca2+-Einstromes. Dieser 
Ca2+-Einstrom findet vermutlich durch Ca2+-Kanäle, die sich in der Plasmamembran 
befinden, statt (Gu et al., 2005). Die Untersuchungen von Gu und Mitarbeitern (2005) führten 
dazu, transgene rop1-, rop6- und rop1rop6-Apoaequorin-Linien innerhalb dieser Arbeit 
herzustellen, um eine mögliche Beteiligung von ROP1 und ROP6 bei der Regulation des 
Ca2+-Gradienten in den Wurzelzellen durch den Zellwandextrakts (ZWE) von P. indica 
festzustellen. Die Linien wurden wie in 2. 2. 8. 2 beschrieben, durch die Kreuzung mit einer 
Arabidopsis-pMAQ2-Linie hergestellt. Die in Bezug auf die knock-out-Mutation von rop1, 
rop6 bzw. rop1rop6 homozygoten F2-Generationen, in denen auch das Apoaequorin-Plasmid 
nachweisbar war, wurden für die Messungen verwendet. In der F2-Generation trat eine 
Reduktion der Aequorin-Lumineszenz auf. Dieser Effekt wurde auch von anderen 
Arbeitsgruppen beobachtet (Knight et al., 1991; Ranf et al., 2008). Mit den verwendeten 
Primern AEQ-fwd und AEQ-rev war nur ein Nachweis der pMAQ2-Sequenz möglich, eine 
Unterscheidung zwischen hetero-, bzw. homozygoten Apoaequorin-Linien konnte nicht 
getroffen werden, da keine Angaben über die Lokalisation der Plasmidsequenz im Genom 
vorlagen. Um die Messungen der transgenen rop-Linien mit dem Wildtyp vergleichen zu 
können, wurden mehrere Linien untersucht. Eine verwertbare Grundlumineszenz konnte 
dadurch ereicht werden, dass 4-6 Wurzeln für eine Messung eingesetzt wurden. Zusätzlich 
wurde die Menge des eingesetzten Coelenterazin von 5 µl auf 15 µl/100 µl H2O (s. 2. 2. 10) 
für alle Linien einschließlich des Wildtyps erhöht. 
Die Transformation mit dem Ca2+-Sensorprotein Apoaequorin ermöglichte die Messung des 
zytosolischen Ca2+-Spiegels in den transgenen Linien des Wildtyps und in den Linien rop1, 
rop6 bzw. rop1rop6 nach der Zugabe des ZWE von P. indica (Abb. 3. 32 A-D). Zunächst 
erfolgte die Messung des zytosolischen Ca2+-Spiegels vor der Zugabe des ZWE für 1 min. Die 
Grundlumineszenz liegt im Wildtyp bei 0,095 µM. Nach Zugabe des ZWE kam es zu einem 
schnellen Anstieg des Ca2+-Spiegels im Zytosol nach 1 min auf 0,27 µM für wenige 
Sekunden. Anschließend fiel der zytosolische Ca2+-Spiegel wieder ab und erreichte nach 
20 min einen Wert von 0,12 µM. Die Zugabe von H2O verursachte keinen Ca2+-Einstrom in 
das Zytosol (Abb. 3. 32 A). 


Ergebnisse 

A
AAB 
BB 

0,30

0,30 

0,25 

0,25 

0 2 4 6 8 1012 1416 1820 
Zeit (min) 


0 2 4 6 8 1012 1416 1820 
Zeit (min) 


0,20 

0,15 

0,10 

0,20 

0,15 

0,10 

[Ca2+
]
zyt 
(µM) 
[Ca2+
]
zyt 
(µM) 

[Ca2+
]
zyt 
(µM) 
[Ca2+
]
zyt 
(µM) 


0,05 

0,05 

0,00 

0,00 

C
CCD 
DD 

0,30

0,30 

0,25

0,25 


0,20 

0,20 
0,15

0,15 

0,10

0,10 

0,05 0,05 
0,00 
0 2 4 6 8 1012 
Zeit (min) 
1416 1820 
0,00 
0 2 4 6 8 10 12 
Zeit (min) 
14 16 18 20 

Abb. 3. 32: Messung des intrazellulären Ca2+-Spiegels nach ZWE-Zugabe in den transgenen 
Wurzeln des Wildtyps und der Mutanten. Der Wildtyp und die Mutanten rop1, rop6 sowie 
rop1rop6 wurden mit dem Apoaequorin-Plasmid pMAQ2 transformiert. In den transgenen 
Pflanzenwurzeln des Wildtyps (A), der Mutante rop1 (B), rop6 (C) und rop1rop6 (D) wurde dieÄnderung des intrazellulären Ca2+-Spiegels [Ca2+]zyt durch die Zugabe von 50 µl ZWE 
(Zellwandextrakt isoliert aus P. indica) gemessen. Die Messung des Ca2+-Spiegels erfolgte alle 5 s für 
20 min und wurde in RLUs (relative light units) berechnet. Für jedes Experiment wurden 4 Wurzeln 
verwendet und 4 Wiederholungen durchgeführt. Als Kontrolle wurde H2O verwendet. 

In der Abb. 3. 32 B ist der intrazelluläre Ca2+-Spiegel vor bzw. nach Zugabe des ZWE zu den 
Wurzeln von rop1 zu sehen. Die Schwankungen der Grundlumineszenz (0,05-0,1) und die 
Schwankungen nach dem Abfall des Ca2+-Gipfels sind durch die Verwendung mehrerer 
Wurzeln je Messung und deren z. T. reduzierte Aequorin-Lumineszenz bedingt. 
Anhand der Abb. 3. 32 B und der hier nicht dargestellten Messung der Entladung des 
Aequorins (s. 2. 2. 10) wurde festgestellt, dass der durch den ZWE ausgelöste Ca2+-Einstrom 
in das Zytoplasma der Wurzelzellen unabhängig von ROP1 ist. Der Anstieg des 
intrazellulären Ca2+ 1 min nach Zugabe des ZWE auf 0,25 µM und der anschließende Abfall 


Ergebnisse 

des Ca2+ im Zytosol ist der Ca2+-Signatur (Kurvenverlauf) des Wildtyps vergleichbar. Die 
Ca2+-Signatur von ROP6 (Abb. 3. 32 C) lässt ebenfalls darauf schließen, dass ROP6 keinen 
Einfluss auf den Ca2+-Einstrom in das Zytoplasma hat. Auch die Doppelmutante rop1rop6 
zeigte keinen veränderten Ca2+-Einstrom in das Zytoplasma (Abb. 3. 32 D). 

3. 9 Klassifizierung und phylogenetische Analyse der kleinen G-Proteine in Arabidopsis 
In Arabidopsis wurden 93 Gene für kleine G-Proteine identifiziert. Diese werden in die 
4 Familien ROP (Rho-related proteins in plants), RAB, ARF und RAN eingeteilt (Vernoud et 
al., 2003). Übereinstimmend mit Vernoud et al. (2003) wurden in dieser Arbeit 21 GTPasen 
für die ARF-Familie, 11 GTPasen für die ROP-Familie und 4 GTPasen für die RAN-Familie 
gefunden (Abb. 3. 34). Aufgrund des Sequenzvergleichs wurde At1g07410, ein Mitglied der 
57 RAB-GTPasen (Vernoud et al., 2003), entfernt. At1g07410 (RABA 2b) gehört zu den 
9 RAB-GTPasen, von denen keine cDNA-Sequenz oder expressed sequence tags (ESTs) 
bekannt sind. Auf Grund seiner Struktur und funktionellen Motive wird es dennoch den RAB-
GTPasen zugeordnet (Rutherford und Moore, 2002). 
In der Abb. 3. 33 sind die ROP-GTPasen vergrößert dargestellt. Die ROP-GTPasen weisen 
eine z. T. sehr große Sequenzübereinstimmung auf, so sind ROP2 und ROP4 zu fast 95 % 
identisch (Yang, 2002). Die in Abb. 3. 33 farblich hervorgehobenen ROPs (ROP1 bis ROP6) 
werden auf Grund der großen Sequenzübereinstimmungen einer gemeinsamen ROP-
Untergruppe zugeordnet. 
Die Bearbeitungsschritte, die zur Berechnung des unrooted neighbor-joining tree notwendig 
waren (Abb. 3. 34), sind unter 2. 2. 17 beschrieben. 

At5g62880 
At3g48040 
At1g20090 
At1g75840 
At4g35020 
At4g35950 
At2g17800 
At3g51300 
At5g45970 
At4g28950 
At2g44690 
Abb. 3. 33: Ausschnitt des neighbor-joining tree aus Abb. 3. 34 zur vergrößerten Darstellung der 
ROP-GTPasen von Arabidopsis. ROP1 (At3g51300), ROP2 (At1g20090), ROP3 (At2g17800), 
ROP4 (At1g75840), ROP5 (At4g35950) und ROP6 (At4g35020) werden einer ROP-Untergruppe 
zugeordnet (Yang, 2002) und besitzen eine Sequenzübereinstimmung von 86-95 % (orange unterlegt). 


Ergebnisse 

At5g20020 


RAN 
RAB 
ROP 
ARF 
At5g10260 

At5g45130

At3g09910 

At4g18800 
At5g45750 
At1g01200 
At3g53610 
At5g47960 
At5g62880 
At3g48040 
At1g20090 
At4g35020 At3g51300At2g2239 
At1g02130 
At1g75840 
At4g35950 
At2g17800At5g45970At4g28950At2g44690 
At5g67560 At1g28550 At4g17530 
At3g49870 
At3g49860 
At5g37680 
At4g02080 
At1g1820 At1g16920 
At2g3387 At4g39990 
At1g56330 
At1g09180 
At1g02440 At3g22950At4g09720 
At1g23490 
At1g02430 
At3g03120 
At5g17060At1g70490At1g10630At1g52280 
At2g47170At3g62290At5g14670 
At2g15310 
At2g18390At5g52210 
At5g55190 
At5g55080 
At2g2188At1g49300 
At5g39620 
At2g22290At4g39890 
At5g64990 
At4g19640 
At3g54840 
At5g03520 
At4g1716At2g44610 
At5g4720At1g73640At2g3168 
At3g0741At1g06400 
At5g47520 At4g17170At1g09630At3g15060 
At5g6086 
At4g18430 
At5g20010 
At1g22740 
At3g18820At3g16100 
At5g0353 
At3g0990At3g12160At5g65270At3g4683At1g05810 
At2g4313At1g43890 At3g46060 
At5g5915 
At3g11730At4g35860 
Abb. 3. 34: unrooted neighbor-joining tree der kleinen G-Proteine von Arabidopsis. Der 
Sequenzvergleich der Proteinsequenzen der 93 kleinen GTPase-Gene wurde mit dem Programm 
MultAlin (Corpet, 1988) durchgeführt. Dadurch kam es zur Entfernung des Gens At1g07410, das zu 
den 57 Genen der RAB-Familie gehört (Vernoud et al., 2003). Nach dem Sequenzvergleich erfolgte 
die manuelle Entfernung sogenannter “gaps“. Das führte zu einer stärkeren Bewertung konservierter 
Proteinsequenzen. Mit dem Programm TreeTop (Yushmanov und Chumakov, 1988; Brodsky et al., 
1995) von GenBee wurde ein phylogenetischer Baum mit 1000 Bootstrap-Wiederholungen berechnet 
und mit Phylip (Felsenstein, 1989) als unrooted neighbor-joining tree dargestellt. 


Diskussion 

4 Diskussion 

Pflanzen interagieren trotz ihres meist festen Standorts mit einer Vielzahl von Organismen. 
Um auf diese zu reagieren, sind Mechanismen zur Wahrnehmung und Weiterleitung von 
Signalen erforderlich. Kleine G-Proteine sind als molekulare Schalter an der 
Signaltransduktion vieler Prozesse wie der Interaktion mit der Umwelt oder der 
Pflanzenentwicklung beteiligt. Die kleinen G-Proteine der ROP-Familie sind in zahlreiche 
Signalwege wie Wachstumsprozesse, die Weiterleitung von Hormonsignalen oder in die 
Erkennung von pathogenen und nicht-pathogenen Organismen involviert. Die Interaktion der 
Modellpflanze Arabidopsis mit P. indica, einem endophytisch lebenden Pilz, der das 
Wachstum zahlreicher Pflanzen fördert, ermöglicht durch die Analyse von Mutanten, Gene zu 
finden, die für die Signaltransduktion und die Ausbildung einer symbiotischen Beziehung von 
Bedeutung sind. In dieser Arbeit wurde anhand von knock-out-und Überexpressionsmutanten 
untersucht, ob die kleinen G-Proteine ROP1 und ROP6 für die Erkennung und Ausbildung 
der symbiotischen Beziehung zwischen Arabidopsis und P. indica eine Rolle spielen. Da 
ROP-GTPasen möglicherweise funktionell redundant sein können und ROP1 mit ROP6 eine 
Sequenzhomologie von mehr als 94 % aufweist (Zheng und Yang, 2000), wurde die 
Doppelmutante rop1rop6 hergestellt. Eine knock-out-Mutante des ROP-interagierenden 
Proteins RIC4 wurde ebenfalls untersucht. Die Mutanten wurden phänotypisch 
charakterisiert, und in Interaktionsversuchen wurde der Einfluss von P. indica auf das 
Wachstum und die Besiedelung der Mutanten untersucht. Die Erkennung eines pathogenen 
bzw. nicht-pathogenen Organismus durch die Pflanze löst u. a. einen schnellen Ca2+-Einstrom 
in das Zytoplasma aus, führt zu Veränderungen der Genexpression und zur Umstrukturierung 
des Aktinzytoskeletts. Mit Hilfe von rop-knock-out-Mutanten, die eine Visualisierung des 
Aktinzytoskeletts oder aber die Messung des intrazellulären Ca2+-Spiegels ermöglichen, 
wurde ermittelt, ob ROP1 und/oder ROP6 an diesen Prozessen beteiligt sind. 
Weiterhin wurde untersucht, ob die P. indica-induzierte Regulation ausgewählter Gene von 
ROP1 und/oder ROP6 beeinflusst wird. 

4. 1 Die kleinen G-Proteine ROP1 und ROP6 sowie das ROP-Effektor Protein RIC4 
beeinflussen den Zeitpunkt der Keimung von Arabidopsis 
Die kleinen G-Proteine ROP1 und ROP6 sowie der G-Protein-Interaktionspartner RIC4 
beeinflussen die Entwicklung und den Phänotyp von Arabidopsis. Die Analyse der Keimung 
ergab, dass die GTPasen ROP1 und ROP6 den Zeitpunkt der Keimung beeinflussen 
(Abb. 3. 12). Die Keimung eines Samens kann in drei Phasen gegliedert werden: in Phase 1 
kommt es zur Wasseraufnahme und Quellung des Samens, in Phase 2 werden metabolische 
Prozesse wieder aufgenommen und in Phase 3 kommt es zum Durchbruch der embryonalen 
Wurzel durch die Samenschale (Bewley, 1997). Es wird angenommen, dass die Ausdehnung 
der Keimlingswurzel durch die Zunahme der Zelllänge zustande kommt. Ob Zellteilung 


Diskussion 

ebenfalls eine Rolle bei der Keimung spielt, wird kontrovers diskutiert (Barroco et al., 2005; 
Masubelele et al., 2005). Die Wirkung von ROP1, das als pollenspezifisch exprimiert 
beschrieben wurde (Li et al., 1998; Gu et al., 2005) und daher nur in Pollenschläuchen von 
Tabak untersucht wurde (Gu et al., 2005; Lee et al., 2008), spielt bei der zeitlichen 
Beeinflussung der Keimung eine größere Rolle als ROP6. Die Expression von rop1 in 
Arabidopsis-Wurzeln konnte in dieser Arbeit mit RT-PCR, real-time PCR und in microarrays 
unabhängig voneinander nachgewiesen werden. Vermutlich konnten Li et al. (1998) das 
mRNA-Transkript von rop1 in Wurzeln nicht nachweisen, da die verwendeten RT-PCR-
Zyklen zu gering gewählt waren (25 Zyklen). Das mRNA-Level von rop1 ist in Arabidopsis-
Wurzeln geringer als das von rop6. Dies konnte anhand der microarray-Daten, der RT-PCR 
(Abb. 3. 5) und real-time PCR festgestellt werden. 
Untersuchungen ergaben, dass ROPs eine Rolle in der Regulation der Signalwege 
verschiedener Pflanzenhormone wie Auxin (Tao et al., 2002; 2005), Abscisinsäure (ABA) 
und Brassinosteroiden spielen (Li et al., 2001; Lemichez et al., 2001; Zheng et al., 2002; Xin 
et al., 2005). So führte die Zugabe von ABA in DN-rop2-Mutanten (dominant negative 
Mutanten) zur Verstärkung der Samenruhe und zu einem gegenteiligen Effekt in CA-rop2Mutanten 
(konstitutiv aktive Mutanten) (Li et al., 2001). ROP2 zeigt eine 
Sequenzübereinstimmung von mehr als 80 % mit ROP6 und ROP1 (Li et al., 1998; Zheng 
und Yang, 2000). Eine verstärkte Reaktion auf ABA zeigten auch rop10-knock-out-Mutanten. 
Dies wurde für den ABA-induzierten Schluss der Spaltöffnungen, die Hemmung der 
Samenkeimung durch ABA, die Hemmung der Zunahme der Wurzellänge des Keimlings und 
für die ABA-induzierte Genexpression untersucht (Zheng et al., 2002; Xin et al., 2005). 
Wurden die Samen der Mutanten von rop2 und rop10 einer Kältebehandlung bei 4 °C für 4 
Tage unterzogen, keimten sie ebenso wie die Samen des Wildtyps (Li et al., 2001; Zheng et 
al., 2002). 
Für rop1-und rop6-Mutanten wurde die Keimung bisher nicht untersucht, aber die 
Ergebnisse weisen darauf hin, dass ROP1 und ROP6 ebenfalls an der ABA-gesteuerten 
Dormanz beteiligt sind. Für ROP6 konnte eine Beteiligung am ABA-induzierten Schließen 
der Stomata nachgewiesen werden (Lemichez et al., 2001). Durch die Kältebehandlung der 
untersuchten Mutanten und des Wildtyps (Abb. 3. 12) wurde endogenes ABA abgebaut, so 
dass die Keimung der Mutanten mit der des Wildtyps (siehe: Li et al., 2001; Zheng et al., 
2002) vergleichbar sein sollte. Die verstärkte Keimung der hier untersuchten knock-out-
Mutanten kann durch eine verschiedenartige Empfindlichkeit auf ABA oder unterschiedliches 
Eingreifen in die Regulation der ABA-Signalwege hervorgerufen sein, wofür die verstärkte 
Keimung von rop1-Mutanten gegenüber den rop6-Mutanten sprechen würde. Die 
Überexpression von rop1 und rop6 muss nicht zu einem hemmenden, d. h. gegenteiligen 
Einfluss führen, da möglicherweise andere ROP-spezifische Signalwege angeschaltet werden. 
Wie bereits erwähnt, weisen Untersuchungen darauf hin, dass ROPs positive Regulatoren in 
Auxin-Signalwegen und negative Regulatoren in ABA-Signalwegen sind (Abb. 1. 2) (Nibau 


Diskussion 

et al., 2006). Die Informationen über die Regulation dieser Signalwege sind jedoch gering. 
Bekannt ist, dass verschiedene ROPs Auxin-abhängig und -unabhängig die Expression des 
Auxin-induzierbaren Promotors DR5 in Tabak-Protoplasten stimulieren. Dazu gehören ROP1 
und ROP6. Außerdem sind ROPs an der Vermittlung der Auxin-induzierten Genexpression 
durch den Abbau der Aux/IAA-Transkriptions-Repressorproteine beteiligt (Tao et al., 2002; 
2005). 
Neuere Untersuchungen ergaben, dass Auxin in frühen Stadien der Keimlingsentwicklung 
hemmend auf die Elongation der Keimlingswurzel wirkt. ABA unterdrückt ebenfalls die 
Elongation der Keimlingswurzel. Dies geschieht vermutlich durch Verstärkung der 
Auxinsignalgebung in der Elongationszone (Belin et al., 2009). Möglicherweise sind die hier 
untersuchten rop-knock-out-Mutanten empfindlich für ABA, können aber die Auxin-
Signalgebung nicht fördern, welche die Elongation der frühen Keimlingswurzel hemmen 
würde. Die rop1-und rop6-Überexpressionsmutanten sind möglicherweise unempfindlich für 
ABA, so dass der beschriebene Prozess der verstärkten Auxinsignalgebung in der 
Elongationszone nicht ausgelöst wird. 
Es wurde bisher nicht untersucht, wie sich die fehlende Expression spezifischer ROPs auf die 
Expression anderer ROPs auswirkt, die in die gleichen Signalwege involviert sind. Für die 
Samenkeimung ist die Regulation zahlreicher Prozesse von Bedeutung, in die ROPs 
eingreifen, wie die Regulation des Aktinzytoskeletts oder die durch Brassinosteroide 
verursachte Zunahme der Zelllänge (Gu et al., 2004; Li et al., 2005). Die Samenkeimung ist 
einer von mehreren Prozessen, bei dem die Interaktion von Brassinosteroiden mit anderen 
Pflanzenhormonen beschrieben wurde. In Arabidopsis kann die Keimung verschiedener 
Gibberellin-Biosynthese-Mutanten teilweise durch die Zugabe von Brassinosteroiden oder 
Gibberellin aufgehoben werden (Haubrick und Assmann, 2006). Gibberellin wirkt sich 
stimulierend auf die Keimung aus und wird als Gegenspieler von ABA betrachtet. 
Die knock-out-Mutante ric4 weist ebenfalls eine verstärkte Samenkeimung auf, dennoch 
zeigte diese Mutante anschließend eine Wachstumsverzögerung gegenüber dem Wildtyp 
(Abb. 3. 17 A und B). Letztlich erreicht die ric4-Mutante aber eine dem Wildtyp 
vergleichbare Größe am Ende der Wachstumsperiode (Abb. 3. 17 C und Abb. 3. 22). RIC4 
ist, wie die folgenden Beispiele zeigen, mit Wachstumsprozessen assoziiert. Ein 
verlangsamtes Wachstum der ric4-Mutante ist daher nicht verwunderlich. Es konnte gezeigt 
werden, dass dieses Protein mit verschiedenen ROPs interagieren kann (s. 1. 5. 4). So wird in 
eingeschränkt diffus wachsenden Blattepidermiszellen RIC4 durch ROP2 aktiviert und fördert 
das lokale Auswachsen eines Zellbereichs durch die Zusammenlagerung von F-Aktin (Fu et 
al., 2005). Die Zellen der Keimlingswurzel dehnen sich jedoch in ihrer Länge aus und 
unterscheiden sich daher vom Wachstumstyp der Pollenschläuche und der 
Blattepidermiszellen (Wasteneys und Galway, 2003). In Pollenschläuchen reguliert ROP1 
durch die Interaktion mit RIC4 die Zusammenlagerung des F-Aktins. Die Interaktion von 
ROP1 mit RIC3 fördert das Auflösen dieser Strukturen in einem Ca2+-abhängigen Prozess. 


Diskussion 

Durch diese beiden gegenläufigen Prozesse wird die Dynamik des F-Aktins gewährleistet und 
das Wachstum des Pollenschlauches reguliert (Gu et al., 2005). Die mRNA von ric3 wird 
ausschließlich in Infloreszenzen exprimiert (Wu et al., 2001) und konnte auch im Rahmen 
dieser Arbeit weder in den microarrays, noch mit RT-PCR in Wurzeln nachgewiesen werden. 
Welche Rolle RIC4 bei der Keimung und dem Wachstum der Keimlingswurzel spielt und mit 
welchen ROP(s) RIC4 interagiert und ob das Protein in weitere Signalwege (z. B. 
Hormonsignalwege) involviert ist, ist bisher unklar. Das Protein wirkt aber ganz offenbar 
regulierend auf den Keimungsvorgang. Bei den verstärkten Keimungsraten der ric4-und rop-
Mutanten (knock-out- und Überexpressionsmutanten) könnten neben Hormonsignalwegen 
auch Prozesse der Aktindynamik eine Rolle spielen. 

4. 2 Der Einfluss von ROP1 und ROP6 auf die Wurzel von Arabidopsis 
Die Längen der Primärwurzeln wiesen nach 4 Tagen deutliche Unterschiede zwischen dem 
Wildtyp und den Mutanten auf (Abb. 3. 13). Es ist anzunehmen, dass sich diese Unterschiede 
mit Ausnahme der ric4-Mutante auf die Prozesse zurückführen lassen, die zur früheren 
Keimung geführt haben. 
Verschiedene Pflanzenhormone beeinflussen die Ausbildung von Seitenwurzeln, z. B. zeigt 
Ethylen positive und negative Effekte auf die Ausbildung von Seitenwurzeln. Cytokinin und 
ABA wirken sich negativ auf die Ausbildung von Seitenwurzeln aus, wohingegen 
Brassinosteroide und Auxin diese positiv beeinflussen (Fukaki und Tasaka, 2009). Endogenes 
Auxin ist an der embryonalen und postembryonalen Entwicklung beteiligt, beeinflusst Licht- 
und Schwerkrafttropismen, Zellelongation, Zelldifferenzierung und Zellteilung (Fleming, 
2006). Die Behandlung mit Brassinosteroiden führt zu Veränderungen der endogenen Auxin-
Menge und/oder verstärkt die Auxin-Sensitivität. Das spricht für eine Vernetzung von Auxin- 
und Brassinosteroid-Signalwegen (Teale et al., 2006). Brassinosteroide fördern vermutlich die 
Bildung von Seitenwurzeln durch die Stimulation des akropetalen Auxin-Transports (Bao et 
al., 2004). ROPs sind, wie bereits erwähnt wurde, mit hoher Wahrscheinlichkeit positive 
Regulatoren von Auxin-gesteuerten Signalwegen. So führte die Aktivierung eines ROP-
Homologs (NtRac1) aus Tabak durch Auxin zur Aktivierung Auxin-regulierter Promotoren. 
Durch die Überexpression von NtRac1 kam es zu einer starken Wurzelverzweigung (Tao et 
al., 2002). CA-rop2-und DN-rop2-Mutanten zeigten eine reduzierte Länge der Primärwurzel. 
In CA-rop2-Mutanten kam es zu einer verstärkten Ausbildung von Seitenwurzeln, in DNrop2-
Mutanten nahm die Anzahl der Seitenwurzeln ab. Bereits die Behandlung mit niedrigen 
Auxin-Konzentrationen führte in CA-rop2-Mutanten zu einer extremen Zunahme der 
Seitenwurzeln, wohingegen DN-rop2-Mutanten keine Zunahme der Seitenwurzeln auch bei 
höheren Auxin-Konzentrationen zeigten (Li et al., 2001). 
Auxin liegt in der Pflanze hauptsächlich als inaktives Konjugat vor. Es wird in jungem 
Sprossgewebe und im meristematischen Gewebe an der Wurzelspitze gebildet. Auxin wird 
spezifisch und aktiv transportiert. Bei diesem Prozess spielen polar lokalisierte 


Diskussion 

Plasmamembranproteine, die PINs (Auxin-Efflux-carrier), eine wichtige Rolle. Der PIN-
abhängige Auxintransport ist an der Regulation der Wurzel- und Organentwicklung beteiligt 
(Teale et al., 2006). Das ROP-interagierende Protein ICR1 (Lavy et al., 2007) ist für das 
Einschleusen von PIN-Proteinen an polaren Domänen der Plasmamembran mitverantwortlich 
(Hazak et al., 2010). ROP2 beeinflusst wahrscheinlich die Lokalisation des Auxin-Effluxcarrier 
PIN2 (Li et al., 2005). Ob die Lokalisation von PINs ein vom Aktinzytoskelettabhängiger 
Prozess ist, wird kontrovers diskutiert. Rahman et al. (2007) halten es jedoch für 
unwahrscheinlich, dass die Lokaliation von PIN2 ein vom Aktinzytoskelett-abhängiger 
Prozess ist. 
Die untersuchten rop1-und rop6-knock-out- und Überexpressionsmutanten einschließlich der 
Doppelmutante und ric4-Mutante zeigten keine Veränderungen bezüglich der Anzahl der 
Seitenwurzeln. Daraus lässt sich schließen, dass ROP1, ROP6 und RIC4 nicht an der Auxin-
induzierten Ausbildung von Seitenwurzeln während dieses Entwicklungszeitpunkts beteiligt 
sind. Da ROPs jedoch eine gewebe- und entwicklungsabhängige Expression aufweisen 
können (Li et al., 1998), kann nicht ausgeschlossen werden, dass ROP1 und ROP6 zu einem 
späteren Zeitpunkt, der für die Interaktionsexperimente mit P. indica keine Bedeutung hatte, 
Einfluss auf die hormonell gesteuerte Ausbildung von Seitenwurzeln nehmen. 

4. 3 ROP1 und ROP6 beeinflussen die Ausbildung von Wurzelhaaren 
Die Ausbildung von Wurzelhaaren wird neben dem Pollenschlauch-Wachstum als Modell-
System für das polare Wachstum von Zellen verwendet. Die Entwicklung von Wurzelhaaren 
lässt sich in drei Stadien gliedern: 

1. die Wurzelhaarinitiation, 
2. die Transition zum Spitzenwachstum und 
3. das Spitzenwachstum (Dolan et al., 1994). 
Anhand der Analyse von Wurzelhaarmutanten konnten mehr als 40 Gene identifiziert werden, 
die für die korrekte Ausbildung von Wurzelhaaren von Bedeutung sind (Grierson et al., 
2001). Stoffe, die die Mikrotubuli-Struktur oder Aktinfilamente auflösen, aber auch 
Exozytose-Inhibitoren können ein Anschwellen oder Verzweigen von Wurzelhaaren auslösen 
(Ovecka et al., 2000). 
ROP-GTPasen konnten während der Wurzelhaarinitiation und an der Spitze des wachsenden 
Wurzelhaares an der Membran nachgewiesen werden (Molendijk et al., 2001). ROP2 ist für 
die Wurzelhaarinitiation erforderlich (Jones et al., 2002). Währenddessen befindet sich ROP2 
an der Zellmembran und ist in der anschließenden Elongationsphase im Zytoplasma 
lokalisiert. In scn1-Mutanten kommt es zu Lokalisationsstörungen von ROP2. Das Gen scn1 
kodiert für ROP-GDI1 (s. 1. 5. 3) und reguliert vermutlich die Lokalisation von ROP2 sowie 
die räumliche Regulation von ROS an der Spitze des Wurzelhaares (Carol et al., 2005). An 
der Lokalisation von ROP2 am Ende der Trichoblasten ist vermutlich auch ein Auxingradient 
beteiligt sein (Fischer et al., 2006). 

Diskussion 

Für das Wurzelhaarwachstum ist die Bildung von ROS (reactive oxygen species) an der 
Spitze des Wurzelhaares durch die NADPH-Oxidase AtrbohC/RHD2 essentiell. Dies führt 
zur Aktivierung von Ca2+-Kanälen und zur Bildung eines Ca2+-Gradienten an der Spitze des 
Wurzelhaares (Foreman et al., 2003; Carol und Dolan, 2006). In der rhd2-Mutante kommt es 
zwar zur Wurzelhaarinitiation, dass Spitzenwachstum bleibt jedoch aus und ein Ca2+-Gradient 
ist nicht nachweisbar (Grierson et al., 2001; Foreman et al., 2003). In in vitro-Experimenten 
konnte gezeigt werden, dass NADPH-Oxidasen durch Ca2+ direkt stimuliert werden können, 
so dass man einen Regulationsmechanismus für die NADPH-Oxidase-Aktivität annehmen 
kann (Sagi und Fluhr, 2001; Carol und Dolan, 2006). Zahlreiche Hinweise sprechen dafür, 
dass die NADPH-Oxidase RHD2 direkt durch ROPs aktiviert wird. So erfolgt die Aktivierung 
der humanen NADPH-Oxidase der neutrophilen Granulozyten, die weitreichende Homolgien 
zur pflanzlichen NADPH-Oxidase aufweist, durch kleine GTPasen (Babior, 1999). Auch ein 
homologes ROP-Protein in Reis (OsRAC1) bindet in vivo an die NADPH-Oxidase. ROP2 
konnte in wachsenden Wurzelhaaren nachgewiesen werden (Jones et al., 2002) und die 
Überexpression von ROP2 verstärkt die Bildung von ROS (Jones et al., 2007). In den hier 
untersuchten knock-out-und Überexpressionsmutanten konnte keine Veränderung der 
Bildung von ROS (NBT-Färbung zum Nachweis des Superoxidanions) in Wurzelhaaren 
festgestellt werden. Daher ist anzunehmen, dass die untersuchten ROPs nicht in die 
Aktivierung der NADPH-Oxidase in Wurzeln involviert sind. 
ROP2 ist in die Kontrolle verschiedener Stadien der Wurzelhaarentwicklung involviert. Die 
Überexpression von rop2 führt zur Ausbildung mehrerer Wurzelhaare an einer Zelle, wirkt 
sich auf den Initiationsort aus und führt zu einer Zunahme der Länge der Wurzelhaare, die 
sich dann an der Spitze z. T. verzweigen. DN-rop2-Mutanten haben weniger und kürzere 
Wurzelhaare als der Wildtyp (Jones et al., 2002). Die hier untersuchten GTPasen ROP1 und 
ROP6 sind für die Wurzelhaarmorphogenese ebenfalls von Bedeutung. Die Anzahl der 
Wurzelhaare zeigte jedoch in keiner der untersuchten Mutanten eine deutliche Veränderung 
(Abb. 3. 14 A). Auch der Insertionsort der Wurzelhaare wies keine Veränderung auf. Es 
konnte jedoch nachgewiesen werden, dass ROP1 und ROP6 Einfluss auf die Länge der 
Wurzelhaare haben. Die Doppelmutante rop1rop6 besitzt deutlich kürzere Wurzelhaare als 
der Wildtyp. Die knock-out-Mutation von rop1 oder rop6 führte zu einer geringeren Abnahme 
der Wurzelhaarlänge als bei der Doppelmutante rop1rop6. Das ist ein Hinweis auf eine 
mögliche Redundanz von ROP1 und ROP6, da sich das Fehlen beider GTPasen stärker 
auswirkt. Die Überexpression von ROP6 führte zu einer deutlichen Zunahme der 
Wurzelhaarlänge (Abb. 3. 14 B). Diese Ergebnisse sind mit den Veränderungen vergleichbar, 
die aus der Untersuchung der Wurzelhaarlänge von DN-rop2-und CA-rop2-Mutanten und 
rop2-Überexpressionsmutanten gewonnen wurden (Jones et al., 2002). 
Die Überexpressionsmutanten zeigten eine deutliche Zunahme verzweigter Wurzelhaare 
(Abb. 3. 15) an der Basis und an den Spitzen der Wurzelhaare (Abb. 3. 16). Jones et al. 
(2002) beobachteten eine Zunahme verzweigter Wurzelhaarspitzen an rop2



Diskussion 

Überexpressionsmutanten, aber weniger häufig, als es bei den hier untersuchten Mutanten 
auftrat. Dies kann auf experimentelle Unterschiede zurückzuführen sein, weist aber auf die 
Bedeutung von ROP1 und ROP6 für das Spitzenwachstum hin, wenngleich die Expression 
dieser Proteine in wachsenden Wurzelhaaren noch nicht belegt ist. Die Expression von CAROP4 
und CA-ROP6 führte in den Wurzeln transgener Arabidopsis-Pflanzen zu einer 
Delokalisation des Ca2+-Gradienten an der Spitze des Wurzelhaares und zum Anschwellen 
des Wurzelhaares, polares Wachstum wurde verhindert (Molendijk et al., 2001). Ein 
Anschwellen der Wurzelhaare konnte bei den rop1-und rop6-Überexpressionsmutanten nicht 
beobachtet werden, dies liegt vermutlich an der Verwendung unterschiedlicher Mutanten. 
CA-Mutanten sind im Gegensatz zu Überexpressionsmutanten permanent aktiviert und 
können durch GTPase-aktivierende Proteine (GAPs) nicht inaktiviert werden (Yang, 2002). 
In Saccharomyces cerevisiae ist eine Signalkaskade kleiner GTPasen an der Knospenbildung 
beteiligt, dazu gehört die RHO-GTPase Cdc42 (cell division cycle 42) (Park und Bi, 2007). 
Eine solche Signalkaskade könnte auch bei der Ausbildung von Wurzelhaaren zugrunde 
liegen. Es ist anzunehmen, dass verschiedene ROPs zum Teil funktionell redundant an diesem 
Prozess beteiligt sind. So wirkt sich die Überexpression von ROP7 ebenfalls auf die 
Entwicklung der Wurzelhaare aus und scheint den Übergang von der Initiation zum 
Spitzenwachstum zu beeinflussen (Jones et al., 2002). 
ROP1 und ROP6 sind nicht wie ROP2 (Jones et al., 2007) an der Initiation der Wurzelhaare 
beteiligt und daher vermutlich erst in die Transition zum Spitzenwachstum und/oder das 
Spitzenwachstum (Dolan et al., 1994) involviert. 
Für das Wurzelhaarwachstum ist die Dynamik des Aktinzytoskeletts und im Unterschied zum 
Pollenschlauchwachstum auch die Dynamik der Mikrotubuli von großer Bedeutung, um einen 
geordneten Vesikel- und Organellentransport zu gewährleisten (Bibikova et al., 1999; 
Baluška et al., 2000; Cheung et al., 2008). Wachsende Wurzelhaare zeigen Aktinkabel 
entlang der Wurzelhaarachse und an der Spitze ein feines Aktinnetzwerk. ROP2 ist an der 
Regulation des F-Aktin-Netzwerks an der Wurzelhaarspitze beteiligt (Jones et al., 2002). Der 
Phänotyp der CA-rop2-Mutation wird durch eine Mutation in mrh2 (ARM domain-containing 
kinesin-like protein) verstärkt. Das ARM domain-containing mrh2-Fragment kann 
Aktinfilamente binden und ist vermutlich an der Koordination von Aktinfilamenten und 
Mikrotubuli während des Wurzelhaarwachstums beteiligt (Yang et al., 2007). Die 
Mechanismen der Regulation des Zytoskeletts und die Beziehung zu ROP2 sind noch unklar. 
Die Lokalisation von ROP-Proteinen ist unabhängig von der Dynamik des Aktinzytoskeletts, 
wie durch die Behandlung mit den Aktin-auflösenden bzw. den die Aktinpolymerisation 
hemmenden Stoffen Latrunculin B und Cytochalasin D nachgewiesen werden konnte 
(Molendijk et al., 2001). 
Die Wurzelhaarinitiation ist unabhängig vom Aktinzytoskelett (Baluška et al., 2000). Die 
Untersuchung des Aktinzytoskeletts der mit dem GFP-FABD2-Konstrukt transformierten 
knock-out-Linien rop1, rop6 und rop1rop6 zeigte eine Verminderung der Bildung von 


Diskussion 

Aktinkabeln in den Wurzelzellen der Linien rop1 und rop6 und ein Fehlen von Aktinkabeln 
in der Doppelmutante rop1rop6 (Abb. 3. 24 und Abb. 3. 25). Während des 
Wurzelhaarwachstums kommt es im Arabidopsis-Wildtyp zur Bildung von Aktinkabeln 
entlang der Wachstumsachse. An der apikalen Region des Wurzelhaares treten feine 
Aktinstrukturen auf. CA-rop2-und DN-rop2-Mutanten zeigten Veränderungen dieser 
Aktinstrukturen (Jones et al., 2002). Aber auch in Pollenschläuchen treten axiale Aktinkabel 
auf und ROP1 ist an der Regulation des an der Spitze lokalisierten F-Aktins beteiligt (Fu et 
al., 2001). In der Doppelmutante rop1rop6 (Abb. 3. 24 G und H) konnten in den wachsenden 
Wurzelhaaren keine axialen Aktinkabel nachgewiesen werden, was für eine essentielle 
Bedeutung von ROP1 und ROP6 bei der Dynamik des F-Aktins in Wurzeln spricht und die 
Abnahme der Wurzelhaarlänge verursacht haben könnte. Auch eine Beteiligung von ROP1 
und ROP6 an der Exozytose könnte die Verzweigung von Wurzelhaarspitzen und das 
verringerte Längenwachstum der Wurzelhaare verursacht haben, da die Dynamik des 
F-Aktins für exozytotische Prozesse eine wichtige Rolle spielt, wie am Beispiel von ROP1 
beim Wachstum von Pollenschläuchen gezeigt werden konnte (s. 1. 7) (Lee et al., 2008). 
Mit Hilfe von Interaktionsexperimenten zwischen dem Arabidopsis-Wildtyp, den Mutanten 
und P. indica sollte festgestellt werden, welchen Einfluss ROP1, ROP6 und RIC4 auf die 
Beziehung zu P. indica haben und ob ein wachstumsfördernder Effekt, der das 
charakteristische Merkmal für eine positive Interaktion ist, nachgewiesen werden kann. Um 
eine Zunahme der Spross- und Wurzelmasse schon nach wenigen Tagen feststellen zu 
können, wurden die Experimente auf einem für den Pilz- und das Pflanzen-Wachstum 
geeignetem Medium durchgeführt (s. 2. 2. 4). Zunächst wurde das Wachstum der Mutanten 
ohne den Einfluss des Pilzes betrachtet, um den Einfluss von ROP1, ROP6 und RIC4 auf das 
Wurzel- und Sprossgewicht festzustellen. Die Mutante ric4 ist zunächst kleiner als der 
Wildtyp, erreicht aber am Ende der Kultivierungszeit eine dem Wildtyp vergleichbare Größe 

(s. 4. 1). Die rop1-Überexpressionsmutante zeigte eine starke Zunahme der Wurzelmasse 
während der gesamten Kultivierungszeit und nach 14 Tagen eine Abnahme der Sprossmasse 
im Vergleich zum Wildtyp (Abb. 3. 17 A-C). Die Verschiebung des Wurzel- und 
Sprossverhältnisses zugunsten der Wurzel legt die Vermutung nahe, dass die Mutante unter 
Trockenstress leidet, und daher das Wurzelwachstum fördert, um Wasserressourcen zu 
erschließen. Eine DN-rop10-Mutante wies einen geringeren Wasserverlust über die Blätter 
und eine stärkere Reaktion auf den durch ABA-induzierten Schluss der Stomata auf (Zheng et 
al., 2002). Auch auf Ebene der Genexpression kommt es in rop10-knock-out-Mutanten zu 
Veränderungen. Als Antwort auf eine geringe ABA-Konzentration werden mehr Gene 
exprimiert als im Wildtyp, wobei eine Gruppe von Genen nur in der rop10-Mutante aktiviert 
wird und nicht im Wildtyp. ROP10 scheint an der Regulation von Genen, die durch geringe 
ABA-Konzentrationen aktiviert werden, beteiligt zu sein. Fast alle diese Gene werden auch 
durch abiotischen und biotischen Stress induziert (Xin et al., 2005). Man kann sicher davon 
ausgehen, dass die Überexpression ebenfalls Einfluss auf die Expression Stress-induzierter 

Diskussion 

Gene nimmt. Untersuchungen von Lemichez et al. (2001) zeigten, dass ROP6 in die 
Schließung der Stomata involviert ist. ABA führt zur Schließung der Spaltöffnungen in 
Arabidopsis-Wildtyp-Zellen. Die Zugabe von ABA führt zur Inaktivierung von ROP6 in 
Abhängigkeit von der verwendeten ABA-Konzentration im Wildtyp. In CA-rop6-Mutanten 
blieben die Stomata auch nach Zugabe von ABA geöffnet. Diese Mutanten müssten unter 
Trockenstress leiden, da sie den Wasserverlust über die Spaltöffnungen nicht regulieren 
können. Das führt wahrscheinlich dazu, dass die ABA-Synthese gesteigert wird, was auch zu 
Veränderungen der Genexpression vor allem von Streß-assoziierten Genen führen kann. Die 
Auswirkungen der Mutationen auf das Spross- und Wurzelwachstum dieser CA-rop6- und 
DN-rop6-Mutanten wurde jedoch von Lemichez et al. (2001) nicht untersucht. Nach 14tägiger 
Kultivierung wies auch die rop6-Überexpressionsmutante die Tendenz zur 
Verschiebung des Wurzel-/Sprossverhältnisses auf (Abb. 3. 17 C). So beträgt der 
Sprosszuwachs einer Pflanze des Wildtyps zwischen dem 6. bis 14. Tag 10 mg und der 
Wurzelzuwachs 1,2 mg. In der rop6-Überexpressionsmutante beträgt der durchschnittliche 
Sprosszuwachs im gleichen Zeitraum nur 3 mg und der Zuwachs der Wurzel war mit 1,5 mg 
größer als der des Wildtyps (nicht dargestellt). Die Wurzelmasse der rop1-und rop6-knockout-
Mutanten nimmt während der Kultivierung ebenfalls zu, dass Sprossgewicht jedoch auch, 
wenn auch in geringerem Maße im Vergleich zum Wildtyp. Die Doppelmutante rop1rop6 
zeigte zunächst ein höheres Frischgewicht für Spross und Wurzel als der Wildtyp, 
wahrscheinlich teilweise bedingt durch die frühere Keimung. Der Sprosszuwachs war nach 14 
Tagen Kultivierung geringer als der Wurzelzuwachs. Die Kultivierung auf PNM-Medium in 
nicht luftdicht-verschlossenen Petrischalen begrenzt den Wasserverlust zunächst, so dass die 
Mutanten geringerem Trockenstress ausgesetzt sind. Möglicherweise ist ROP1 neben ROP10 
(Zheng et al., 2002) und ROP6 (Lemichez et al., 2001) ebenfalls an der Schließung der 
Stomata beteiligt. 
Wie schon erwähnt, können ROPs gewebe- und entwicklungsspezifisch exprimiert werden 
und funktionell redundant sein. Es ist möglich, dass an der Verschiebung des Wurzel- und 
Sprossverhältnisses und der starken Zunahme der Wurzelmasse weitere Hormonsignalwege 
wie Auxin oder Brassinolide beteiligt sind. Bisher wurde nur der Einfluss von ROP2 auf den 
Phänotyp von Arabidopsis genauer beschrieben. So sind homozygote CA-rop2-Mutanten 

z. B. Embryo-lethal, was die besondere Bedeutung von ROP2 für die Pflanzenentwicklung 
unterstreicht. Heterozygote CA-rop2-Mutanten besitzen einen etwas kleineren Spross als der 
Wildtyp und weisen eine verstärkte Spross-Apikal-Dominanz mit weniger Infloreszenzen auf. 
Der bereits beschriebene Einfluss von ROP2 auf das Wurzelsystem (s. 4. 2) spricht für eine 
Beteiligung an Auxinsignalwegen. ROP2 ist auch, wie schon erwähnt, in die Regulation von 
Brassinosteroid- und ABA-Signalwegen involviert (Li et al., 2001). Keine der hier 
charakterisierten Mutanten wies Unterschiede in der Spross-Apikaldominanz auf, wie auch in 
den Abb. 3. 19 - 3. 22 zu sehen ist oder eine veränderte Zahl von Seitenwurzeln bis zum 14. 

Diskussion 

Tag der Interaktion. Daher ist anzunehmen, dass eine Beteiligung von ROP1 und ROP6 in 
Auxinsignalwegen (Tao et al., 2002) weniger essentiell für das Pflanzenwachstum ist. 
Die Interaktion mit P. indica führte nach einer Kultivierungszeit von 6 Tagen zu einer 
Zunahme der Spross- und Wurzelmasse des Arabidopsis-Wildtyps. Mit Ausnahme der 
Doppelmutante rop1rop6 zeigten alle Mutanten eine Zunahme des Spross-und 
Wurzelgewichts durch den Pilz (Abb. 3. 18 A). Diese Zunahme war jedoch geringer als die 
des Wildtyps, mit Ausnahme der rop6-knock-out-Mutante, die eine Zunahme der 
Wurzelmasse von 52 % gegenüber den 30 % des Wildtyps aufweist. Die Zunahme des 
Sprossgewichts ist jedoch deutlich geringer als die des Wildtyps mit 39 % und liegt bei 16 %. 
Die ric4-knock-out-Mutante weist eine Zunahme der Wurzelmasse von 30 % auf. Die 
Zunahme der Sprossmasse ist mit 15 % im Vergleich zum Wildtyp aber deutlich geringer. Die 
Doppelmutante rop1rop6 wies am 6. Tag ohne P. indica eine um fast 80 % erhöhte 
Wurzelmasse gegenüber dem Wildtyp auf (Abb. 3. 17 B). Die Reaktion auf P. indica könnte 
daher eine Abwehrreaktion auf Grund der größeren Angriffsfläche für die Interaktion bzw. 
Besiedelung durch P. indica darstellen. Auch die rop1-und rop6-Überexpressionsmutanten, 
die ohne P. indica eine größere Wurzelmasse aufwiesen (Abb. 3. 17 B), zeigten eine stark 
verringerte Zunahme der Wurzelmasse durch den Pilz im Vergleich zur Mutante rop6 
(Abb. 3. 18 A), die eine dem Wildtyp vergleichbare Wurzelmasse am 6. Tag ohne P. indica 
aufwies (Abb. 3. 17 B). Die Mutante ric4 wies am 6. Tag ohne Pilz eine geringere 
Wurzelmasse als der Wildtyp auf (Abb. 3. 17 B), erreichte aber durch die Kultivierung mit P. 
indica eine dem Wildtyp vergleichbare Zunahme des Wurzelgewichtes (Abb. 3. 18 A). Nach 
14 Tagen Kultivierungszeit zeigten alle Mutanten eine Zunahme des Spross- und 
Wurzelgewichtes durch den Pilz, welche jedoch stark verringert im Vergleich zum Wildtyp 
war (Abb. 3. 18 B). Die auf PNM-Medium durchgeführten Experimente wiesen eine 
veränderte Reaktion der Mutanten auf den Pilz nach. Um diese Ergebnisse zu bestätigen, 
wurden Experimente auf Erde, dem optimaleren Lebensraum für Pflanze und Pilz, 
durchgeführt. 
Alle auf Erde kultivierten Pflanzen wurden gleichmäßig mit Wasser versorgt. Die 
Überexpressionsmutanten OX-rop1 und OX-rop6 zeigten unter diesen Bedingungen keine 
Symptome von Trockenstress, obwohl die konstitutive Expression von rop6 das Schließen der 
Spaltöffnungen beeinträchtigt (Lemichez et al., 2001). Beide Überexpressionslinien zeigten 
ein dem Wildtyp vergleichbares Sprosswachstum (Abb. 3. 20 und Abb. 3. 21). 
Bei der Kultivierung von Arabidopsis mit P. indica auf Erde blieb der Sprosszuwachs durch 
den Pilz bei allen Mutantenlinien aus, nur der Wildtyp reagierte positiv auf P. indica. Die 
Mutanten rop1, rop1rop6 und ric4 zeigten sogar eine durch den Pilz verursachte Hemmung 
des Sprosswachstums (Abb. 3. 19 - 3. 22), welches aber bis zum Ende der Kultivierungszeit 
ausgeglichen werden konnte, so dass die mit P. indica infizierten Pflanzen eine Endgröße 
erreichten, die den Kontrollen entsprach. P. indica kann sich als bodenbewohnender Pilz 
wesentlich besser in der Erde vermehren als auf einem Medium, das seinen 


Diskussion 

Wachstumsansprüchen nur teilweise genügt. Dies wurde auch bei den durchgeführten 
Sporenfärbungen festgestellt. In allen Mutanten und im Wildtyp konnten Sporen 
nachgewiesen werden, jedoch variierte der Grad der Besiedelung stark zwischen den 
einzelnen Individuen. Die Wurzeln aller in Erde kultivierten Pflanzen wiesen eine extrem 
hohe Sporendichte insbesondere auf der Wurzeloberfläche auf. Es konnten in einigen Fällen 
Sporen im Leitgewebe der Wurzeln nachgewiesen werden (Abb. 3. 23 B). Bisher wurde nur 
eine Besiedelung der Wurzelrinde beobachtet (Varma et al., 1999). Die Abnahme des 
Sprossgewichts in der Doppelmutante rop1rop6 und der Mutante ric4 könnte durch eine 
anhaltende Abwehrreaktion der Mutanten auf den Pilz verursacht sein. Das Gleichgewicht, 
das in einer mutualistischen Beziehung zwischen der Pflanze und dem Pilz vorliegt, kann 
durch eine übermäßige Besiedelung durch den Pilz gestört werden und zu einer 
Abwehrreaktion der Pflanze führen (Kogel et al., 2006; Sherameti et al., 2008b; Oelmüller et 
al., 2009). In den Überexpressionsmutanten kam es ebenfalls zu keiner Wachstumszunahme 
durch die Kultivierung mit P. indica. Eine Wachstumsverzögerung durch den Pilz, wie es für 
die Mutanten rop1, rop1rop6 und ric4 beobachtet werden konnte, war in den 
Überexpressionsmutanten jedoch nicht nachweisbar. Das führte zu der Annahme, dass die 
Abwehrreaktion auf den Pilz weniger ausgeprägt war. 
Ist die normale Besiedelung einer Pflanze durch einen Symbionten beeinträchtigt, kann das 
ebenfalls Auswirkungen auf den Phänotyp der Pflanze haben. So ist die reguläre Besiedelung 
von Lolium perenne durch Epichloë festucae auf Grund der racA-knock-out-Mutation des 
Pilzes beeinträchtigt. Dies hat u. a. Auswirkung auf die Spross-Apikaldominanz der Pflanze. 
Die pilzliche GTPase RacA ist für die Aktivierung der NADPH-Oxidase NoxA 
verantwortlich. NoxA reguliert durch die Produktion von ROS das Hyphenwachstum im 
Symbiosepartner (Tanaka et al., 2008). Eine Mutation von P. indica wird jedoch nicht 
angenommen, da die inokulierten Wildtyp-Pflanzen einen normalen Sprosszuwachs zeigten. 
Bei der Interaktion von Pflanzen mit Mikroorganismen kommt es häufig zu Eingriffen in den 
Phytohormonhaushalt der Pflanze durch pilzliche Hormone oder andere Botenstoffe. So 
beeinflusst ABA Nod-Faktor- und Zytokinin-Signalwege während der Knöllchenbildung 
zwischen Sinorhizobium meliloti und Medicago truncatula (Ding et al., 2008). Für P. indica 
konnte die Bildung geringer Auxinkonzentrationen (Vadassery et al., 2008; Sirrenberg et al., 
2007) nachgewiesen werden. Dies scheint jedoch nicht die Ursache für den 
wachstumsfördernden Effekt zu sein, wie die Untersuchung von Mutanten zeigte (Vadassery 
et al., 2008). Hingegen ist Zytokinin für den wachstumsfördernden Effekt vermutlich von 
Bedeutung (Vadassery et al., 2008). Eine Beeinflussung des Phytohormon-Metabolismus von 
Gibberellin, Auxin und ABA auf Ebene der Genexpression konnte in den mit P. indica 
kultivierten Wurzeln der Gerste nachgewiesen werden (Schäfer et al., 2009) und könnte auch 
für die Interaktion zwischen Arabidopsis und P. indica von Bedeutung sein. Wie schon 
erwähnt, sind ROPs positive Regulatoren in Auxin-Signalwegen und negative Regulatoren in 
ABA-Signalwegen. So verändert die knock-out-Mutation von rop10 die ABA-induzierte 


Diskussion 

Expression mehrerer Gene, die auch durch abiotischen und biotischen Stress induziert werden 
(Lemichez et al., 2001; Tao et al., 2002; 2005; Zheng et al., 2002; Xin et al., 2005). 
ROP6 ist neben anderen ROPs in ABA-regulierte Signalwege involviert (Lemichez et al., 
2001; Li et al., 2001; Zheng et al., 2002). Welche Rolle die hier untersuchten ROPs für die 
Regulation des Phytohormonhaushalts spielen, kann auf Grund der wenigen Informationen 
über ROPs in Hormonsignalwegen (Tao et al., 2002; 2005; Zheng et al., 2002) und ihrer 
teilweise redundanten Funktionen sowie der gegenseitigen Beeinflussung von 
Hormonsignalwegen nicht festgestellt werden. Weiterhin sind die Informationen darüber, in 
welchem Umfang der Pilz in den Phytohormonhaushalt der Pflanze eingreift, sehr beschränkt. 
Mit Hilfe der durchgeführten Interaktionsexperimente wird jedoch deutlich, dass die kleinen 
G-Proteine ROP1, ROP6 und das ROP-Interaktionsprotein RIC4 für die mutualistische 
Beziehung zu P. indica von großer Bedeutung sind. 

4. 5 P. indica beeinflusst die Transkription verschiedener Gene im Arabidopsis-Wildtyp 
und in den Mutanten differentiell 
Mit Hilfe von microarrays für den 2. und 6. Tag der Interaktion konnte festgestellt werden, 
dass die Genexpression im Wildtyp und in der Doppelmutante rop1rop6 durch P. indica 
reguliert wird. Nach 2 Tagen lag im Wildtyp ein höherer Prozentsatz regulierter mRNAs vor 
als in der Doppelmutante. Am 6. Tag wies dagegen die Doppelmutante den größeren Anteil 
regulierter mRNAs im Vergleich zum Wildtyp auf (Tab. 3. 22). Das legte die Vermutung 
nahe, dass ROP1 und/oder ROP6 eine entscheidende Rolle für die P. indica-induzierte 
Genexpression spielen und eine knock-out-Mutation zu einer verzögerten Reaktion auf den 
Pilz führen könnte. Zahlreiche aus der Pathogenabwehr bekannte Gene wie pdf1.2, pr1 und 
pr5 (Sels et al., 2008; Uknes et al., 1992; Stein et al., 2008) wurden in den Wurzeln zu 
diesem Entwicklungszeitpunkt (9. oder 11. Tag nach der Keimung, dass entspricht dem 2. 
bzw. 6. Tag der Interaktion, s. 2. 2. 4) in den microarrays nicht exprimiert und wurden daher 
nicht untersucht (s. 3. 6). 
Um die aus den microarrays erhaltenen Daten zu überprüfen, wurden real-time Experimente 
für den Wildtyp, die Doppelmutante rop1rop6 und die knock-out-Mutanten rop1 und rop6 
durchgeführt. Bei den untersuchten Genen handelte es sich um das germin-like protein 
At5g38910, das Trypsin Inhibitor Protein1 atti1, das Calmodulin-bindende Protein cbp60g, 
die Chitinase At2g43570, die Glutathion S-Transferasen gstf3 und gstf6 sowie profilin4. Diese 
Gene wurden ausgewählt, da sie durch P. indica eine starke Regulation im Wildtyp und eine 
veränderte Regulation in der Doppelmutante aufwiesen. 
Das germin-like protein (GLP) At5g38910 wurde durch den Pilz im Wildtyp und in den 
Mutanten rop1, rop6, rop1rop6 extrem hochreguliert (Abb. 3. 26 A und B), die auftretenden 
Schwankungen der Transkriptmengen werden vermutlich durch die entwicklungsabhängige 
Expression von Germinen und GLPs hervorgerufen (Bernier et al., 2001; Zimmermann et al., 
2006). Germine und germin-like proteins gehören zu einer großen Multigenfamilie, über ihre 


Diskussion 

Funktionen ist z. T. nur wenig bekannt, aber einige GLPs sind z. B. für die Pathogenabwehr 
von Bedeutung (Donaldson et al., 2001; Zimmermann et al., 2006; Knecht et al., 2010). GLPs 
können die Besiedelung von Gerstenblättern durch den pathogenen Pilz Blumeria graminis 
begrenzen und einige GLPs werden durch die Infektion mit B. graminis verstärkt exprimiert 
(Zimmermann et al., 2006). GLPs zeichnen sich im Gegensatz zu den Germinen durch eine 
hohe Heterogenität der Aminosäuresequenzen aus. Über das hier untersuchte GLP 
(At5g38910) sind nur wenige Informationen verfügbar, vermutlich handelt es sich um ein 
germin-like protein der Unterfamilie 1, Mitglied 9, das mit hoher Wahrscheinlichkeit im 
extrazellulären Raum bzw. im Apoplasten lokalisiert ist (http://www.uniprot.org/). Das 
Protein besitzt wahrscheinlich keine Oxalatoxidase-Aktivität. Von verschiedenen 
Pflanzenspezies, wie z. B. Gerste oder Weizen ist bekannt, dass GLPs durch ihre 
Oxalatoxidase-Aktivität H2O2 produzieren und dadurch verschiedene Abwehrreaktionen, wie 
eine Veränderung der Zellwandstruktur oder einen oxidative burst als Antwort auf ein 
Pathogen hervorrufen können (Christensen et al., 2004; Zimmermann et al., 2006). 
Das Protein ATTI1 ist auf Grund seiner Struktur vermutlich ebenfalls im extrazellulären 
Raum und im Endomembransystem lokalisiert (http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/). Es 
gehört zur Familie der Defensin-ähnlichen Proteine (DEFL) und ist ein Proteinase-Inhibitor. 
Diese werden in vielen Pflanzenarten produziert und können z. B. von Botrytis cinerea 
gebildete Proteasen in vitro hemmen (Dunaevski et al., 2005). In Arabidopsis und in CUTE-
Mutanten wird ATTI1 nach Inokulation mit Botrytis cinerea verstärkt exprimiert. 
Arabidopsis-Transformanten, die ATTI1 überexprimieren, sind resistenter gegen eine 
Infektion mit dem Pathogen B. cinerea (Chassot et al., 2007). 
Die Expression des Calmodulin-bindenden Proteins CBP60g wird in Arabidopsis durch die 
Infektion mit einem pathogenen Stamm von Pseudomonas syringae und durch pathogen-or 
microbe-associated molecular patterns (PAMPs bzw. MAMPs) hochreguliert. Knock-out-
Mutanten von CBP60g lieferten auch Hinweise auf eine Beteiligung an der Aktivierung des 
Salizylsäuresignalwegs und weisen geringere Salizylsäurekonzentrationen durch MAMPs auf 
(Wang et al., 2009). Das CBP60g besitzt im Gegensatz zu anderen Mitgliedern dieser Familie 
keine Calmodulin-bindende Domäne im C-terminalen Teil sondern im N-terminalen Teil des 
Proteins. Die Interaktion Calmodulin-bindender Proteine mit Calmodulin ist Ca2+-abhängig 
(Reddy et al., 2002). 
At2g43570 gehört zu den putativen Endochitinasen, welche ß-1,4-glykosidische Bindungen 
im Inneren eines Chitin-Moleküls hydrolysieren. At2g43570 ist im Apoplasten und in der 
Zellwand lokalisiert. Vermutlich ist dieses Protein in der Lage, durch posttranslationale 
Modifikationen von Glykoproteinen an Umbauprozessen der Zellwand teilzunehmen (Minic 
et al., 2007). At2g43570 wird wahrscheinlich durch oxidativen Stress, der durch zahlreiche 
abiotische und biotische Faktoren ausgelöst werden kann, induziert (Bindschedler et al., 
2008). 


Diskussion 

Die Interaktion von P. indica mit Arabidopsis und den Mutanten rop1, rop6 sowie rop1rop6 
führte zu einer verstärkten Expression des GLPs At5g38910 (Abb. 3. 26 A und B) als Zeichen 
einer Abwehrreaktion, die unabhängig von den hier untersuchten ROPs ist. Diese Reaktion 
hält auch am 6. Tag an, dem Zeitpunkt, an dem der wachstumsfördernde Effekt von P. indica 
auf den Wildtyp, nicht aber auf die Doppelmutante rop1rop6, nachweisbar ist. Daraus lässt 
sich schließen, dass At5g38910 an einer Begrenzung der Besiedelung durch den Pilz beteiligt 
sein könnte. Durch die Interaktion des Wildtyps mit dem Pilz wird die mRNA von atti1, 
cbp60g und von der Chitinase At2g43570 am 2. Tag der Interaktion als Zeichen einer 
Abwehrreaktion gegen P. indica verstärkt exprimiert. Am 6. Tag werden diese Gene im 
Wildtyp weniger stark exprimiert als am 2. Tag. Die Transkription der Gene ist zu diesem 
Zeitpunkt in den rop1-und rop6-Mutanten höher als im Wildtyp. Die Doppelmutante zeigte 
eine wesentlich geringere Transkription als die rop1-und rop6-Mutanten (Abb. 3. 27 A und 
B). Die Regulation der Transkription dieser Gene als Antwort auf P. indica fällt offensichtlich 
durch das Fehlen von rop1 und rop6 geringer aus. Fehlen beide GTPasen fällt diese Reaktion 
noch stärker aus. Dies lässt eine direkte Beteiligung von ROP1 und ROP6 an der Erkennung 
des Pilzes und eine funktionelle Redundanz von mehreren ROPs oder die Beteiligung ROP-
unabhängiger Signalwege vermuten, da es auch in den Mutanten zu einer erhöhten 
Transkription kommt, die allerdings schwächer als im Wildtyp ausfällt und verzögert eintritt. 
Zu den early auxin-responsive-Genen gehören Glutathion-S-Transferasen, welche in die 
Entgiftung von Fremdstoffen involviert sind (Teale et al., 2006). Die Glutathion-S-
Transferase gstf6 wird z. B. durch Salizylsäure, H2O2 (Wagner et al., 2002), Pseudomonas 
syringae und Ethylen innerhalb weniger Stunden in Blättern von Arabidopsis stark 
hochreguliert (Lieberherr et al., 2003). P. indica bildet selbst geringe Mengen Auxin 
(Vadassery et al., 2008; Sirrenberg et al., 2007). Die mRNA der Glutathion S-Transferase 
gstf6 wurde durch den Pilz im Wildtyp und in den Mutanten verstärt reguliert, die Regulation 
ist offenbar unabhängig von ROP1 und ROP6 (Abb. 3. 27 A und B). Die mRNA von gstf3 
wurde im Wildtyp und in den Mutanten differentiell hochreguliert (Abb. 3. 28 A und B). Die 
Regulation weist auf eine verzögerte Abwehrreaktion gegen den Pilz in den Mutanten und 
einen direkten Einfluss von ROP1 und ROP6 hin. Auxin führt zur Aktivierung von ROPs und 
vermittelt die Auxin-induzierte Genexpression durch den Abbau der Aux/IAATranskriptions-
Repressorproteine. Der freie Auxin Response Faktor (ARF) kann dimerisieren 
und die Auxin-induzierte Genexpression stimulieren, die zwischengeschalteten 
Signalkomponenten sind allerdings unbekannt (Tao et al., 2002; 2005). Durch die knock-out-
Mutationen von rop1, rop6 und rop1rop6 könnte die Auxin-induzierte Genexpression 
beeinträchtigt sein und die veränderte Genexpression von gstf3 in den Mutanten begründen. 
Die verzögerte Genexpression könnte ein Hinweis auf funktionelle Redundanz weiterer ROPs 
sein. 
Die knock-out-Mutationen von rop1 und rop6 führten zu einer unterschiedlichen Regulation 
von profilin4. Profilin ist für die Dynamik des Aktinzytoskeletts essentiell, es kann 


Diskussion 

monomeres G-Aktin binden und dadurch die Aktinpolymerisation fördern oder verhindern, in 
Abhängigkeit von den vorhandenen G-Aktin- und Profilin-Konzentrationen. Profilin kann mit 
anderen Aktin-bindenden Proteinen, wie ADF (actin depolymerizing factor) oder Forminhomologen 
Proteinen interagieren (Hussey et al., 2006). Zusätzlich kann Profilin mit 
Membran-Phosphoinositiden interagieren und die Bindung von Phosphatidylinosit 
4,5-bisphosphat weist auf eine Beteiligung von Profilin in der Signaltransduktion hin 
(Drøbak, et al., 2004). Die mRNA von profilin4 wird am 2. Tag der Interaktion durch den 
Pilz im Wildtyp leicht hochreguliert, in den Mutanten kommt es dagegen zu einer Abnahme 
des Transkriptlevels (Abb. 3. 28 A). Am 6. Tag der Interaktion zeigte profilin4 im Wildtyp 
eine weitere Zunahme der Transkriptmenge, hervorgerufen durch den Pilz. Die Zunahme der 
mRNA von profilin4 blieb in den rop6-Mutanten gering (Abb. 3. 28 B). In der 
Doppelmutante kam es zu keiner Regulation des Gens. Die Regulation von profilin4 im 
Wildtyp lässt vermuten, dass es bereits am 2. Kultivierungstag zu Veränderungen der 
Dynamik des Aktinzytoskeletts kommt, die am 6. Tag noch zugenommen haben, 
möglicherweise durch den nun direkten Kontakt des Pilzes zur Wurzel. Die knock-out-
Mutation von rop1 und rop6 scheint die geringe bzw. ausbleibende Regulation der profilin4Transkription 
hervorzurufen. Dies wirkt sich vermutlich auf den durch P. indica 
hervorgerufenen Umbau des Aktinzytoskelett (Abb. 3. 24 und Abb. 3. 25) aus und könnte 
eine Ursache für die beobachtete Wachstumshemmung sein (Abb. 3. 18 A). Ob ROPs 
grundsätzlich einen Einfluss auf das Transkriptlevel von profilin4 haben, wurde bisher nicht 
nachgewiesen. Die hier durchgeführten microarrays lassen dies jedoch nicht vermuten, da die 
Signalintensitäten von profilin4 im Wildtyp und in der Doppelmutante ohne P. indica nahezu 
identisch waren. Offenbar ist ein Stimulus nötig, der zur Aktivierung von ROP1 und/oder 
ROP6 führt, um die Transkription von profilin4 zu beeinflussen. Ein gemeinsames räumliches 
Vorkommen von Profilinen mit ROP-Proteinen konnte in der pathogenen Interaktion 
zwischen Petroselinum crispum-Zellen und dem Oomyzeten Phytophtora infestans 
nachgewiesen werden. Während der Infektion kommt es zu einer Umlagerung der 
Aktinfilamente in Richtung des Appressoriums und am Penetrationsort wurde eine starke 
Profilin- und ROP-Akkumulation beobachtet (Schütz et al., 2006). 
Die real-time-Experimente konnten den auf Grund der microarrays vorhandenen Verdacht 
einer durch den Pilz ausgelösten Regulation von rop1, rop2, rop3, rop6, rop11, ric2 und ric4 
nicht bestätigen (Abb. 3. 29, 3. 30 A und B). Das bedeutet nicht, dass diese Gene keine 
Funktion für die durch den Pilz verursachte Signaltransduktion haben. Für rop1 und rop6 
konnte eine Beeinflussung der Genexpression nachgewiesen werden. Die Aktivität der 
Proteine setzt nicht unbedingt eine vermehrte Transkription voraus, sondern kann auch durch 
die ROP-interagierenden Proteine RopGEF, RopGDI und RopGAP erfolgen (s. 1. 5). Diese 
Aussage trifft auch für die Transkription von rop2 zu, die in der Doppelmutante keine 
Zunahme des mRNA-Levels gegenüber dem Wildtyp unabhängig vom Pilz zeigte 
(Abb. 3. 31 A und B). 


Diskussion 

4. 6 P. indica verursacht eine verstärkte Bildung von Aktinbündeln im Arabidopsis-
Wildtyp jedoch nicht in den rop1-, rop6-und rop1rop6-knock-out- Mutanten 
Das Aktinzytoskelett spielt in zahlreichen physiologischen Prozessen wie der Zellteilung, 
Zellstreckung, im Organellen- und Vesikelverkehr, bei der Endo- und Exozytose und in der 
Signaltransduktion eine wichtige Rolle. Für verschiedene pathogene Interaktionen wurde die 
Rolle des Aktinzytoskeletts untersucht. So geht die Akkumulation von Abwehrstoffen und 
Kallose mit der Umordnung der Aktinfilamente am Ort des Pathogenkontakts einher. Auch 
die Wanderung des Zellkerns an den Penetrationsort des Pathogens und die Akkumulation 
von Phenolen und H2O2 ist abhängig von der Dynamik des Aktinzytoskelett (Groß et al., 
1993; Mellersh et al., 2002). 
Durch den Angriff von B. graminis auf resistente Gerste kommt es zur Polarisation von 
Aktinfilamenten in Richtung des Penetrationsortes. Die Ausrichtung von Aktinfilamenten 
zum Penetrationsort geht offenbar mit einer erfolgreichen Pathogenabwehr einher (Takemoto 
et al., 2003; Schmelzer, 2002; Opalski et al., 2005). Für die symbiotische Beziehung 
zwischen Lotus japonicus und Mesorhizobium loti ist die Dynamik des Aktinzytoskeletts 
ebenfalls von Bedeutung, wie anhand von nap1-und pir1-Mutanten gezeigt werden konnte. 
Pir1 und NAP1 sind Untereinheiten des SCAR/WAVE-Komplexes und für die 
Umstrukturierung des Aktinzytoskeletts mitverantwortlich, die durch das Nod-Faktor 
produzierende Bakterium M. loti ausgelöst werden (Yokota et al., 2009). 
Durch die Visualisierung des F-Aktins mit dem GFP-FABD2-Konstrukt (s. 2. 2. 8. 1 und 3. 5) 
(Voigt et al., 2005) wurde der Einfluss von P. indica auf die Regulation des Aktinzytoskeletts 
von Arabidopsis und der knock-out-Mutanten rop1, rop6 und rop1rop6 für den 2. und 6. Tag 
der Interaktion untersucht (Abb. 3. 24 und 3. 25). Zwischen Mutanten und Wildtyp treten 
deutliche strukturelle Unterschiede im Aktinzytoskelett auf. In den Mutanten rop1 und rop6 
ist die Bildung von Aktinbündeln in den Wurzelzellen nachweisbar, wenn auch in geringerem 
Maße als im Arabidopsis-Wildtyp (Abb. 3. 25 D und E). Durch den direkten und indirekten 
Kontakt mit dem Pilz kommt es aber nur im Wildtyp, vor allem im Leitgewebe, zu einer 
Zunahme von längsgerichteten Aktinsträngen -ein Hinweis auf einen intensiven 
Stofftransport (Thomas et al., 2009). In der Rhizodermis sind ebenfalls Aktinbündel 
nachweisbar. In den rop1-und rop6-Mutanten waren in den Kontrollen und in infizierten 
Wurzeln weitaus weniger Aktinbündel (Abb. 3. 25 D und E) und Aktinstränge in der 
Rhizodermis und im Leitgewebe nachweisbar. Einige Wurzeln wiesen auch bei direktem 
Kontakt mit dem Pilz keine Aktinbündel auf (Abb. 3. 25 F). Zu diesem Zeitpunkt der 
Interaktion sind Chlamydosporen äußerst selten zu beobachten und das Hyphensystem des 
Pilzes umgibt die Wurzel von außen. Ein einzelner Kontaktpunkt, der z. B. bei der 
Sporenkeimung und Appressorienbildung von B. graminis auf Gerste beobachtet werden 
kann, tritt in der Beziehung zwischen Arabidopsis und P. indica vermutlich sehr selten auf. In 
den rop1rop6-Mutanten findet man auch bei direktem Kontakt mit dem Pilz keine 
Aktinbündel. Die Mutante rop1rop6 bildete weder in den Wurzelzellen noch in den 


Diskussion 

Wurzelhaaren Aktinbündel oder Aktinstränge aus (Abb. 3. 24 E-H, Abb. 3. 25 G und H). 
Kortikales, d. h. membranständiges F-Aktin, war in der Mutante rop1rop6 in weitaus 
größerem Maße als im Wildtyp und in den Mutanten rop1 und rop6 nachweisbar. In 
wachsenden Pflanzenzellen findet sich vor allem das fein-verzweigte, dynamische F-Aktin. 
Es vermittelt wahrscheinlich die Akkumulation von Vesikeln mit Zellmaterial und fördert das 
Wachstum. In ausgewachsenen Zellen findet man hingegen eine ausgedehnte Bildung von 
Aktinbündeln (Thomas et al., 2009). Da alle Aufnahmen die Wurzelhaarzone betreffen, 
sollten die Zellen ihr Streckungswachstum beendet haben und wie die Wildtypzellen 
Aktinfilamentbündel aufweisen. Da sich die Position der Wurzelhaare in der Doppelmutante 
rop1rop6 nicht verändert, kann ausgeschlossen werden, dass sich die Zellen weiter im 
Streckungswachstum befinden. Vermutlich ist die Ursache der ausbleibenden Aktinbündel- 
und Aktinkabelbildung auf ROPs zurückzuführen, die an der Regulation verschiedener 
Protein- und Proteinkomplexe teilnehmen, welche Einfluss auf das Aktinzytoskelett haben. 
So aktivieren ROPs den WAVE-Komplex, wodurch der ARP2/3-Komplex (s. 1. 8. 3) 
aktiviert wird, der die Polymerisation von monomeren G-Aktin an bereits existierende 
Aktinfilamente induziert (Berken und Hülskamp, 2006). Mutationen, die den SCAR/WAVEoder 
den ARP2/3-Komplex betreffen, beeinflussen die Organisation des Aktinzytoskeletts 
und die Morphologie von Trichomen, es kommt zur Auflösung von Aktinbündeln und zur 
Reduktion von Aktinfilamenten in Abhängigkeit vom Stadium des Trichomwachstums (Basu 
et al., 2004; 2005). Welche ROPs die Aktivierung des ARP2/3-Komplexes auslösen ist noch 
unklar (Basu et al., 2008). ROP-Proteine regulieren außerdem die Polymerisation des F-
Aktins durch die Interaktion mit RIC4 und die Ca2+-abhängige Depolymerisation des F-
Aktins durch die Interaktion mit RIC3. Die Überexpression von RIC4 in Pollenschläuchen 
führt zur Bildung eines stabilen F-Aktinnetzwerks, über eine verstärkte Bildung von 
Aktinbündeln wurde jedoch keine Aussage getroffen (Gu et al., 2005). ROPs regulieren 
möglicherweise auch Phosphoinositide. Phosphoinositide vermitteln Veränderungen des 
zytosolischen Ca2+-Spiegels, wodurch sie ebenfalls die Aktivität von verschiedenen Aktinbindenden 
Proteinen, z. B. ADFs und von Aktin-bündelnden Proteinen beeinflussen können 
(Lee und Yang, 2008; Nibau et al., 2006). Zu den Aktin-bündelnden Proteinen, die Ca2+abhängige 
Funktionen haben, gehören einige Villin-iso-formen wie z. B. ABP29, das in 
wachsenden Pollenschläuchen nachgewiesen wurde. Eine Aktivierung durch ROPs wurde 
bisher nicht festgestellt (Lee und Yang, 2008). 
ROPs regulieren die Aktivität von ADFs wahrscheinlich durch die Vermittlung von 
Phosphorylierung bzw. Dephosphorylierung. Die Überexpression von NtRac1, einem AtROPhomologen 
Protein von Tabak, vermindert die Bindung von NtADF1 an Aktin und 
Aktinkabel bzw. -bündel werden nicht aufgelöst. Das aktivierte NtRac1 ist vermutlich an der 
Phosphorylierung von NtADF1 an der Ser-6 Position beteiligt, wodurch dieses Protein 
inaktiviert wird (Chen et al., 2003). In Vertebraten wurde die verantwortliche Kinase, die 
diese Phosphorylierung durchführt, bereits 1998 von Neng Yang und seinen Mitarbeitern 


Diskussion 

gefunden. Es handelt sich dabei um eine LIM-Kinase, die durch RACs, eine Untergruppe der 
RHO-Familie der Vertebraten, aktiviert wird. 
In Arabidopsis führt die Überexpression von ADF1 zum Verschwinden dicker Aktinkabel 
und zur Abnahme der Wurzelhaarlänge. Wird die Expression von AtADF1 hingegen 
reduziert, kommt es zur verstärkten Bildung von Aktinkabeln wodurch eine Zunahme der 
Wurzelhaarlänge verursacht wird (Dong et al., 2001). Eine deutliche Zunahme der 
Wurzelhaarlänge konnte für die rop6-Überexpressionsmutante (Abb. 3. 14 B) beobachtet 
werden. Eine Abnahme der Wurzelhaarlänge wurde für die Doppelmutante rop1rop6 
nachgewiesen (Abb. 3. 14 B). Lemichez et al. hat 2001 nachgewiesen, dass die 
Überexpression bzw. verminderte Expression von rop6 in Schließzellen von Arabidopsis zu 
einer verstärkten Bildung bzw. zum Auflösen von Aktinbündeln und Aktinkabeln führt. Die 
Überexpression von ROP1 in Pollenschläuchen führt ebenfalls zu einer vermehrten Bildung 
von Aktinkabeln und beeinflusst deren Wachstum (Fu et al., 2001; Gu et al., 2005). Die hier 
untersuchten rop-FABD2-Mutanten zeigen, dass ROP1 und ROP6 in die Bildung von 
Aktinkabeln und Aktinbündeln in Wurzeln involviert sind. Nimmt man an, dass ROP1 und 
ROP6 für die Inaktivierung von AtADF1 durch Phosphorylierung verantwortlich sind, 
würden in knock-out-Mutanten auf Grund der übermäßigen Aktivität von AtADF1 wenige 
oder keine Aktinkabel zu finden sein, so wie es bei den hier untersuchten rop1-, rop6-und 
rop1rop6-knock-out-Mutanten der Fall war. Möglicherweise sind ROP1 und ROP6 auch an 
der Aktivierung aktinbindender Proteine wie Fimbrin, Villin, Formin oder LIM-Proteinen 
beteiligt (s. 1. 8. 1 und 1. 8. 2). In Pollenschläuchen von Tabak wurde nachgewiesen, dass das 
Formin AtFH3 an der Ausbildung von Aktinkabeln und damit für die Zytoplasmaströmung 
und das polare Wachstum mit verantwortlich ist (Ye et al., 2009). In Drosophila diaphanous, 
Säugern und S. cerevisiae wurden Formine als Effektoren von RHO-Proteinen identifiziert 
(Takai et al., 2001). In Pflanzen konnte eine Interaktion mit ROPs noch nicht nachgewiesen 
werden. Die untersuchten ROPs müssten wahrscheinlich mit verschiedenen Aktin-bündelnden 
Proteinen interagieren, um den in der rop1rop6-Mutante beobachteten Aktin-Phänotyp 
auszulösen, denn die bisherige Untersuchung von knock-out-Mutanten von nur einem Aktinbündelnden 
Protein hatte keinen Aktin-Phänotyp zur Folge (Thomas et al., 2009). Es ist 
wahrscheinlicher, dass ROP1 und ROP6 an der Regulation von ADFs und/oder des ARP2/3Komplexes 
beteiligt sind und die Bildung von Aktinfilamenten in einer Weise beeinflussen, 
die dazu führt, dass die Voraussetzungen zur Bildung von Aktinbündeln und -kabeln 
beeinträchtigt sind. ROP2 konnte eine Beteiligung an der Regulation des feinen F-Aktins an 
der Wurzelhaarspitze zugeordnet werden (Jones et al., 2002), so dass die Hypothese 
aufgestellt werden kann, dass verschiedene ROPs in die Regulation der Dynamik des 
Aktinzytoskeletts involviert sind und diese mit unterschiedlichen Proteinen wechselwirken 
und sich so die knock-out-Mutation von zwei ROPs stärker auf den Aktin-Phänotyp auswirkt. 
Trotz der starken Veränderungen des Aktinzytoskeletts in der Doppelmutante fiel auf, dass 
die Pflanzen im Wachstum nicht beeinträchtigt waren. Ein Grund dafür könnte sein, dass auch 


Diskussion 

der vollständige Verlust des F-Aktins oder die Mutation mehrerer Untereinheiten des 
ARP2/3-Komplexes in Pflanzen weit weniger dramatische Auswirkungen hat als in tierischen 
Zellen oder Hefe (Hussey et al., 2006; Berken und Hülskamp, 2006). Auch ohne F-Aktin sind 
Pflanzenzellen zur Zellteilung, postembryonalen Entwicklung und Morphogenese fähig. Die 
Zellelongation ist allerdings stark F-Aktin-abhängig, so dass der Verlust des F-Aktins zu 
Zwergwuchs in Arabidopsis führt (Baluška et al., 2001). Das F-Aktin ist in der 
Doppelmutante jedoch vorhanden und die fehlende Ausbildung von Aktinbündeln in der 
Doppelmutante ist weder für das Pflanzenwachstum (Abb. 3. 17 A-C und Abb. 3. 19) noch 
für die Aufnahme von P. indica-Sporen (Abb. 3. 23 B) essentiell. 
ROP-GTPasen sind für die pathogene Interaktion zwischen Gerste und dem biotrophen Pilz 
Blumeria graminis von Bedeutung. So fördert z. B. das konstitutiv exprimierte ROP-Homolog 
HvRAC1 die Anfälligkeit gegen B. graminis, unterstützt jedoch während der Penetration die 
Resistenz gegen den hemibiotrophen Pilz Magnaporthe oryzae in Gerste (Pathuri et al., 
2008), so dass in Abhängigkeit von der Lebensweise eines Organismus eine veränderte 
Signaltransduktion zu unterschiedlichen Reaktionen führt. Einige RACs haben keinen 
Einfluss auf die Anfälligkeit. Der transiente knock down von RACB erhöht jedoch die 
Penetrationsresistenz gegen B. graminis (Schultheiss et al., 2002). RACB beeinflusst die 
Umordnung von Aktinfilamenten während des Befalls von Gerste durch B. graminis (Opalski 
et al., 2005). Das RACB-Protein der Gerste wird derselben phylogenetischen Untergruppe 
wie die Proteine ROP1 bis ROP6 von Arabidopsis zugeordnet (Schultheiss et al., 2003). 

4. 7 ROP1 und ROP6 sind nicht in den Ca2+-Einstrom in das Zytoplasma involviert, der 
durch den Zellwandextrakt von P. indica ausgelöst wird 
Pflanzen haben in der Rhizosphere Kontakt zu einer Vielzahl von Mikroorganismen. Senden 
diese Mikroorganismen Botenstoffe aus, die an einen spezifischen Rezeptor der Pflanze 
binden, kommt es zur Aktivierung von Signalwegen. Die Aktivierung des Rezeptors führt zu 
einem vorübergehenden Anstieg des zytosolischen Ca2+-Spiegels und zu einer Aktivierung 
nachfolgender Signalwege (Navazio und Mariani, 2008). Calcium induziert in der Zelle als 
second messenger zahlreiche Signalwege, die durch abiotische und biotische Stimuli 
ausgelöst werden (Knight et al., 1991; Kiegle et al., 2000; Blume et al., 2000). Für die 
spezifische Aktivierung von Signalwegen ist daher der Raum-zeitliche Verlauf des Ca2+Einstroms, 
die Signalstärke und der anschließende Abbau des erhöhten Ca2+-Spiegels von 
Bedeutung. So kommt es z. B. in der Symbiose zwischen Leguminosen und Rhizobien durch 
die Bindung des Nod-Faktors an den vermutlichen Rezeptor NFP zu einer typischen Ca2+Signatur, 
d. h. einem definierten Muster von Schwankungen des Ca2+-Spiegels im Zellkern 
und im perinuklearen Zytoplasma der Wurzelhaare von M. truncatula (Oldroyd und Downie, 
2006). 
Durch die Behandlung mit einem aus P. indica isolierten Zellwandextrakt kommt es zu einem 
schnellen Anstieg des zytosolischen Ca2+-Spiegels in Arabidopsis-Wurzeln. Die Reaktion auf 


Diskussion 

den Zellwandextrakt ist vermutlich Rezeptor-vermittelt und führt zu Protein-
Phosphorylierungen, wahrscheinlich auf der Rezeptor-Ebene (Vadassery et al., 2009a). ROPs 
können mit Rezeptoren in Verbindung stehen (Trotochaud et al., 1999; Kaothien et al., 2005) 
und befinden sich im aktivierten Zustand in der Plasmamembran (Sorek et al., 2007), so dass 
sie auf Grund ihrer Lokalisation an der Bildung eines Ca2+-Gradienten, ausgelöst durch den 
Zellwandextrakt, beteiligt sein könnten. 
Ein Ca2+-Gradient konnte auch in wachsenden Pollenschläuchen und Wurzelhaaren 
festgestellt werden (Li et al., 1999; Gu et al., 2005; Molendijk et al., 2001). ROP1 reguliert 
vermutlich die Bildung eines Ca2+-Gradienten an der Spitze des Pollenschlauches durch das 
Effektorprotein RIC3. RIC3 fördert vermutlich die Ca2+-Akkumulation durch den 
lokalisierten Ca2+-Influx durch Ca2+-permeable Plasmamembrankanäle (Li et al., 1999; Gu et 
al., 2005). ROP1 reguliert wahrscheinlich auch die Lokalisation des Proteins CNGC18, das an 
post-Golgi-Vesikeln und an der Plasmamembran nachweisbar ist. CNGCs (cyclic nucleotidegated 
channels) sind „nicht- selektive Kationenkanäle“, die u. a. für Calcium durchlässig sind. 
Durch die Aktivität von ROP1 ist das pollenspezifische Protein CNGC18 hauptsächlich an 
der Spitze des Pollenschlauches in der Plasmamembran nachweisbar und dort vermutlich für 
die Ca2+-Leitfähigkeit verantwortlich, wobei die Ca2+-Leitfähigkeit anscheinend nicht durch 
ROP1 reguliert wird (Chang et al., 2007). ROPs könnten demzufolge indirekt in die Bildung 
von Ca2+-Gradienten involviert sein, indem sie die Lokalisation von CNGCs regulieren. 
Durch die Behandlung mit dem ZWE von P. indica konnte die differentielle Regulation 
verschiedener cngc-mRNAs nachgewiesen werden (Vadassery et al., 2009a). Durch die 
Transformation von Arabidopsis mit dem Ca2+-Sensorprotein Apoaequorin (Knight et al., 
1991) wurde untersucht, ob die knock-out-Mutationen von rop1, rop6 und rop1rop6 zu 
Veränderungen der Ca2+-Signatur führen und die daraus resultierende Aktivierung von 
Signalwegen von ROP1 und ROP6 beeinflusst wird. Es konnte jedoch nachgewiesen werden, 
dass ROP1 und ROP6 keine Rolle für den Ca2+-Einstrom in das Zytoplasma und für den 
anschließenden Abbau des Ca2+-Gradienten in den Wurzelzellen von Arabidopsis spielen. 
Auch die knock-out-Mutation beider Gene hatte keinen Einfluss auf die Ca2+-Signatur. Es 
kann daher ausgeschlossen werden, dass eine funktionelle Redundanz von ROP1 und ROP6 
Einfluss auf den Ca2+-Gradienten hatte. Die veränderte Genexpression von cpb60g zeigte 
allerdings, dass ROP1 und ROP6 in P. indica induzierte Ca2+-Signalwege involviert sind 
(Abb. 3. 27 A und B). 


Diskussion 

4. 8 Modell für die Rolle von ROP1 und ROP6 in der Interaktion von Arabidopsis mit 
P. indica 
Pflanzen erkennen pathogene und symbiotische Organismen, indem sie sogenannte Pathogenassoziierte 
molekulare Muster (PAMPs) durch extrazelluläre Rezeptor-ähnliche Kinasen 
(RLKs) wahrnehmen (Zhao und Qi, 2008). RopGEFs (Guaninnucleotid exchange factors) 
aktivieren ROPs, sie stellen wahrscheinlich die Verknüpfung von Rezeptorkinasen und ROP-
GTPasen dar. So wurde in Tomate ein RopGEF-Homolog als Interaktionspartner der 
pollenspezifischen Rezeptorkinasen LePRK1 und LePRK2 identifiziert (Kaothien et al., 
2005). Ein weiterer Hinweis für eine Interaktion zwischen ROPs und Rezeptorkinasen wurde 
in Arabidopsis entdeckt. Dort wurden die Rezeptor-ähnlichen Kinasen CLAVATA1, 
CLAVATA3, eine Proteinphosphatase und ein ROP-Protein in einem gemeinsamen 
Signalkomplex gefunden (Trotochaud et al., 1999). Als ROP-Interaktionspartner wurden auch 
die Rezeptorkinase NCRK und die zytosolischen Kinasen RBK1 und RBK2 identifiziert 
(Molendijk et al., 2008). 
Welche ROP-GTPasen in symbiotischen Beziehungen von Bedeutung sind, wurde bisher 
kaum untersucht. Die Informationen beschränken sich auf die differentielle Expression von 
ROPs in der Ektomykorrhiza von Betula pendula mit Paxillus involutus und den 
Wurzelknöllchen von Medicago sativa mit Sinorhizobium meliloti (Berken, 2006). ROPs 
spielen jedoch in zahlreichen Pathogen-assoziierten Signalwegen eine Rolle. So wurde z. B. 
OsRAC1 (in Reis und Gerste werden ROPs im Allgemeinen als RACs bezeichnet) als 
positiver Regulator der NADPH-Oxidase identifiziert. Durch die Aktivierung der NADPH-
Oxidase kommt es zu einer vermehrten Bildung von ROS verbunden mit einer Zunahme der 
Resistenz (Kawasaki et al., 1999; Ono et al., 2001). Für die ROP-induzierte Bildung von ROS 
genügte nicht die konstitutive Expression oder Überexpression von ROP2. Ein zusätzlicher 
Stimulus, wie die exogene Zugabe von Phosphorsäure ist notwendig, um den Signalweg zu 
aktivieren (Park et al., 2004). Ein aus P. indica isolierter ZWE führte in den Wurzeln von 
Arabidopsis nicht zu einer verstärkten Bildung von H2O2 (Vadassery et. al., 2009a), das auch 
während der Entwicklung in Wurzeln (Dunand et al., 2007) und Wurzelhaaren (Jones et al., 
2007) gebildet wird. In den hier untersuchten knock-out- und Überexpressionsmutanten 
konnten ebenfalls keine Unterschiede bezüglich der Bildung von H2O2 und extrazellulärem 
Superoxid durch die Kultivierung mit P. indica festgestellt werden. Auch scheint P. indica 
nicht wie Epichloë festucae, ein Symbiont von Lolium perenne, selbst nachweisbare ROS-
Konzentrationen zu bilden, um sich in der Pflanze zu etablieren. In diesem Fall reguliert die 
pilzliche GTPase RacA die Bildung von ROS durch die Aktivierung der NADPH-Oxidase 
NoxA von Epichloë festucae (Tanaka et al., 2008). 
Durch den Umbau der pflanzlichen Zellwandstruktur kann das Eindringen von Pathogenen 
verhindert werden. ROPs können diese Prozesse beeinflussen, so aktiviert OsRAC1 eine 
Cinnamoyl-CoA Reduktase, welche an der Lignin-Biosynthese beteiligt ist (Kawasaki et al., 
2006). OsRAC1 ist vermutlich auch an der Elicitor-induzierten Auslösung eines MAPK



Diskussion 

Signalweges beteiligt (Lieberherr et al., 2005). MAPK-Signalwege sind in der 
Signaltransduktion biotischer und abiotischer Stressfaktoren von Bedeutung. 
Auf Grund dieser und weiterer Informationen (s. 4. 6 und 4. 7) wurde das folgende Modell 
unter besonderer Berücksichtigung von ROP1 und ROP6 für die Erkennung von P. indica 
durch Arabidopsis erstellt. Die Abb. 4. 1 zeigt, dass ROPs in ihrer aktiven, d. h. GTP-
gebundenen Form in lipid rafts vorhanden sind. ROPs weisen in lipid rafts neben einem 
Prenylierungsmotiv (schwarz) eine Acylierung auf (rot). Möglicherweise werden ROPs nur in 
lipid rafts aktiviert und stabilisieren sich selbst durch Acylierung wie Sorek und Mitarbeiter 
(2007) für ROP6 festgestellt haben. 
Die Erkennung des pilzlichen Signals wird vermutlich durch extrazelluläre Rezeptor-ähnliche 
Kinasen (RLKs) vermittelt. Die Rezeptorkinase LRR1 wurde in lipid rafts nachgewiesen und 
die mRNA von LRR1 wurde durch die Interaktion mit dem Pilz hochreguliert (Shahollari et 
al., 2005). Ein MATH-Domänen aufweisendes Protein, das sich wahrscheinlich ebenfalls in 
lipid rafts befindet, wird durch den Pilz verstärkt exprimiert und transient modifiziert, ob es 
eine Rolle bei der Erkennung des Pilzes spielt, ist bisher unklar (Peskan-Berghöfer et al., 
2004; Oelmüller et al., 2005). Das am Rezeptor eingehende Signal von P. indica führt zur 
Aktivierung von RopGEFs. Diese aktivieren ROPs, indem sie den Austausch von GDP mit 
GTP fördern. Der ZWE von P. indica löst einen Ca2+-Einstrom in das Zytoplasma aus. ROP1 
und ROP6 sind an diesem Ca2+-Einstrom nicht beteiligt. ROPs sind vermutlich an der 
Elicitor-induzierten Auslösung von MAPK-Signalwegen beteiligt (Lieberherr et al., 2005). 
MAPK-Signalwege werden auch durch den Zellwandextrakt des Pilzes aktiviert (Vadassery et 
al., 2009a). Möglicherweise aktivieren ROP-GTPasen MAPKs und/oder regulieren die 
Genexpression MAPK-abhängiger und unabhängiger Signalwege. In den rop-knock-out-
Mutanten konnte eine veränderte Regulation der Genexpression festgestellt werden. 
Durch den Kontakt mit P. indica kommt es zu Veränderungen der Struktur des 
Aktinzytoskeletts im Arabidopsis-Wildtyp, an deren Regulation ROP1 und ROP6 beteiligt 
sind. Die Dynamik des Aktinzytoskeletts ist für die Ausbildung der symbiotischen Beziehung 
verbunden mit der Wachstumsförderung von Arabidopsis durch P. indica von großer 
Bedeutung, wie durch die Untersuchung der rop-Mutanten nachgewiesen werden konnte. 
ROP-GTPasen aktivieren die NADPH-Oxidase, was zur Bildung von reaktiven Sauerstoff-
Spezies führt. Da aber eine verstärkte Bildung von ROS weder durch den ZWE (Vadassery et 
al., 2009a) noch durch den Pilz in den rop-Mutanten nachgewiesen werden konnte, scheint 
dieser Signalweg bei der freundlichen Interaktion der beiden untersuchten Symbiosepartner 
keine Rolle zu spielen (Abb. 4. 1). 


Diskussion 

SignalNROP1/6GTPMAHRegulation derAktinzytoskelett-
DynamikGenexpressionMAPK3/6 ?
Ca2+-EinstromSignalSignal 
P. indica 
NROP1/6GTPMAHRegulation derAktinzytoskelett-
DynamikGenexpressionMAPK3/6 ?
Ca2+-EinstromN 
lipid raftPM 
ROP1/6 
GTP 
GEF 
LRR 
Kinase 
MAHMATH 
Regulation der 
Aktinzytoskelett-
Dynamik 
NADPH-
Oxidase 
Genexpression 
MAPK3/6 ? 
Ca2+-Einstrom 
MATH 
Wa
WaWaWac
ccch
hhhs
ssst
tttu
uuum 
mmm 

Abb. 4. 1: Modell der Signalwege, die durch ROPs in Arabidopsis-Wurzeln als Reaktion auf 

P. indica reguliert bzw. nicht reguliert werden. PM: Plasmamembran 

Zusammenfassung 

5 Zusammenfassung 

Die Interaktion des endophytisch lebenden Pilzes Piriformospora indica mit Arabidopsis 
thaliana führt zu einer Zunahme der Biomasse und der Samenproduktion von Arabidopsis. 
Über die Erkennung des pilzlichen Signals und die anschließende Signaltransduktion in 
Arabidopsis ist bisher wenig bekannt. 
Die kleinen G-Proteine (Guanine nucleotide-binding proteins) der ROP-Familie (RHO of 
plants) kontrollieren eine Vielzahl von lebenswichtigen Signalwegen im Lebenszyklus einer 
Pflanze. Sie sind an Wachstumsprozessen, der Ausbildung der Zellpolarität, der Regulation 
des Aktinzytoskeletts, der Weiterleitung von Hormonsignalen sowie an pathogenen und nichtpathogenen 
Interaktionen beteiligt. 
Das Ziel dieser Arbeit war es festzustellen, ob die kleinen GTP-bindenden Proteine ROP1 und 
ROP6 von Arabidopsis für die Erkennung und Ausbildung einer symbiotischen Beziehung 
mit P. indica von Bedeutung sind. Daher wurden homozygote rop1- und rop6-knock-out-
Mutanten sowie rop1-und rop6-Überexpressionsmutanten erzeugt. Die erstmalige Erzeugung 
einer rop-Doppelmutante (rop1rop6) sollte Auskunft über redundante Funktionen von ROP1 
und ROP6 geben. Die Herstellung einer homozygoten ric4-knock-out-Mutante (ROPinteractive 
CRIB motif-containing protein) sollte eine mögliche Beteiligung dieses ROP-
interagierenden Proteins an der Interaktion mit P. indica nachweisen. 
In den Wurzeln von Arabidopsis konnten alle 11 rop-mRNAs nachgewiesen werden, so dass 
rop1 nicht länger als Blüten-spezifisches Gen betrachtet werden kann. Da ROP1 und ROP6 
an der Regulation von Wachstumsprozessen und Hormonsignalwegen beteiligt sein können, 
wurden die Mutanten zunächst phänotypisch charakterisiert, insbesondere die Wurzel als das 
Pilz interagierende Organ. Die knock-out-Mutanten rop1 und rop1rop6, aber auch die 
Überexpressionsmutanten zeigten eine deutliche Zunahme der Primärwurzellänge. Die 
Anzahl der Seitenwurzeln wies in den Mutanten keine Veränderungen im Vergleich zum 
Wildtyp auf, so dass ROP1 und ROP6 nicht an der Auxin-regulierten Ausbildung von 
Seitenwurzeln beteiligt sind. Die Zunahme der Primärwurzellänge ist wahrscheinlich auf eine 
frühere Samenkeimung zurückzuführen. Sowohl die Inaktivierung von rop1, rop6 oder von 
ric4, aber auch die Überexpression von rop6 fördern die Samenkeimung. Vermutlich sind 
ROP1 und ROP6 neben weiteren bekannten ROPs an der Regulation der ABA-gesteuerten 
Dormanz beteiligt. Da P. indica häufig über die Wurzelhaare in die Pflanze eindringt und 
ROP-Proteine am Wurzelhaarwachstum beteiligt sind, wurde ihre Morphologie untersucht. 
Die Wurzelhaarlänge nimmt bei den rop6-Überexpressionsmutanten zu und bei der 
Doppelmutante ab. Die Überexpression von rop1 und rop6 aber auch die knock-out-Mutation 
von rop1 verursachen die Ausbildung verzweigter Wurzelhaare. Dies zeigt, dass ROP1 und 
ROP6 am polaren Wachstum der Wurzelhaare beteiligt sind. 
Im Anschluß an die phänotypische Charakterisierung der Mutanten wurden 
Kokultivierungsversuche mit P. indica durchgeführt, um den Einfluss der Mutationen auf die 


Zusammenfassung 

Wachstumsförderung zu charakterisieren. Es konnte festgestellt werden, dass die Zunahme 
des Frischgewichts von Wurzel und Spross in allen Mutanten wesentlich geringer ausgeprägt 
war. In der Doppelmutante konnte sogar eine Hemmung des Spross- und Wurzelwachstums 
durch den Pilz beobachtet werden. Eine Ursache dafür könnte die größere Wurzelmasse der 
Mutanten insbesondere der Doppelmutante sein, was möglicherweise zur Auslösung einer 
anhaltenden Abwehrreaktion führt. Der Nachweis von P. indica-Sporen in den Wurzeln der 
Mutanten und des Wildtyps zeigte, dass das Maß der Besiedelung durch die Mutationen nicht 
verhindert oder stark gefördert wird. Die Besiedelung durch Sporen und die 
Wachstumsförderung sind offenbar voneinander unabhängig. 
Die Analyse von Arabidopsis-microarrays lieferte Hinweise, dass die P. indica induzierte 
Expression von Genen in der Doppelmutante verzögert ist. Mit real-time PCR wurde 
nachgewiesen, dass Gene der Pathogenabwehr durch P. indica in den knock-out-Mutanten 
rop1, rop6 und rop1rop6 verändert reguliert werden. 
Während der Infektion mit Pathogenen kommt es zur Umstrukturierung des 
Aktinzytoskeletts. Mit Hilfe der erzeugten GFP-FABD2-rop1-, rop6-und rop1rop6-knockout-
Mutanten wurde die Struktur des Aktinzytoskeletts in Wurzeln während der Kultivierung 
mit P. indica untersucht. Es konnte nachgewiesen werden, dass P. indica nur im Wildtyp eine 
verstärkte Bildung von Aktinbündeln und -strängen auslöst, was einen Hinweis auf einen 
intensiven Stofftransport darstellt, der in den Mutanten ausbleibt. 
In den rop1- und rop6-knock-out-Mutanten kommt es zur Reduktion von Aktinbündeln und 
Aktinsträngen. In der Doppelmutante konnte das vollständige Verschwinden dieser 
Aktinstrukturen beobachtet werden. ROP1 und ROP6 sind demzufolge an der Regulation der 
Aktinzytoskelett-Dynamik beteiligt, vermutlich durch Inaktivierung oder Aktivierung von 
Aktin-bindenden Proteinen und Proteinkomplexen. Das völlige Verschwinden von 
Aktinbündeln und -strängen in der Doppelmutante weist auf redundante Funktionen von 
ROP1 und ROP6 hin. 
Zahlreiche abiotische und biotische Stimuli verursachen einen Ca2+-Einstrom in das 
Zytoplasma, wodurch die Aktivierung nachfolgender Signalwege ausgelöst wird. Ein 
Zellwandextrakt von P. indica verursacht in den Wurzeln von Arabidopsis einen Rezeptorvermittelten 
transienten Ca2+-Einstrom in das Zytoplasma. ROP-Proteine stehen zwar mit 
Rezeptorkinasen und der Regulation von Ca2+-Gradienten in Verbindung, für den Ca2+Einstrom 
durch P. indica haben sie jedoch keine Bedeutung. 
Anhand der vorliegenden Ergebnisse konnte festgestellt werden, dass die kleinen GTP-
bindenden Proteine ROP1 und ROP6 redundante Funktionen haben. Die Ausbildung einer 
symbiotischen Beziehung zwischen Arabidopsis und P. indica wird wesentlich von ROP1 und 
ROP6 beeinflusst, insbesondere durch die Regulation des Aktinzytoskeletts. 


Summary 

6 Summary 

The endophytic mycorrhizal fungus Piriformospora indica interacts with Arabidopsis 
thaliana and promotes plant growth and seed production. Less information is known about the 
fungal recognition signal in Arabidopsis and the subsequent signal transduction in the plant. 
Small GTP-binding proteins of the ROP-family (RHO of plants) are involved in a variety of 
pivotal signaling processes, such as developmental processes, establishment of cell polarity, 
regulation of the actin cytoskeleton, transfer of hormone signals, and in pathogenic and nonpathogenic 
interactions. The aim of this work was to identify the role of the small 
Arabidopsis-GTPases ROP1 and ROP6 in recognition and formation of the symbiotic 
interaction with P. indica. 
In a first step, homozygous rop1 and rop6 knock-out mutants and over-expressors were 
generated. For the first time a rop-double knock-out mutant (rop1rop6) could be created to 
check for redundant functions of the two GTPases. The homozygous knock-out mutant ric4 
(ROP-interactive CRIB motif-containing protein) was produced to determine the involvement 
of that ROP-interacting protein in the P. indica interaction. 
In the roots of Arabidopsis, all known 11 rop genes were detectable, which implies that rop1 
is not specific for flower development. Given that ROP1 and ROP6 could be involved in the 
regulation of growth processes and hormone signaling pathways, mutants were 
phenotypically characterized, with special emphasis on roots as the fungus interacting organ. 
The knock-out mutants rop1 and rop1rop6 exhibited an increasing length of the primary 
roots. The number of lateral roots was not altered, therefore ROP1 and ROP6 might not be 
involved in auxin-induced development of lateral roots. The increase of the primary root 
length is probably a consequence of premature seed germination. The inactivation of rop1, 
rop6 and ric4 as well as the over-expression of rop6 stimulated the germination of seeds. 
Presumably ROP1 and ROP6 are participating in addition to other ROPs in the regulation of 
ABA-controlled dormancy. Because P. indica often invade roots via root hairs and ROPs 
affect the development of the latter, the morphology of root hairs was checked. The rop6 
over-expressor displayed longer root hairs while the double mutant exhibited shorter root 
hairs. The over-expression of rop1 and rop6 as well as the knock-out of rop1 resulted in an 
increased number of branched root hairs. This indicates, that ROP1 and ROP6 are involved in 
polar growth of root hairs. 
Further, co-cultivation experiments with P. indica were performed to distinguish between the 
influence of the mutation and growth promotion. All mutants displayed a lower increase in 
root and shoot growth. In the double mutant even a growth inhibition could be observed. A 
reason for that effect might be the higher root weight, especially in the double mutant that 
exhibited a continuing defense reaction. Analysis of P. indica spores in the roots of wildtype 
and mutants demonstrated, that the extent of colonization is not inhibited or stimulated by the 


Summary 

mutations. Thus colonization with spores and growth promotion appear to be independent 
from each other. 
The analysis of Arabidopsis microarrays provided indications for a delayed gene expression 
in the double mutant caused by P. indica. Real-time PCR experiments verified, that 
Arabidopsis defense genes were differentially regulated in rop1-, rop6- and rop1rop6-mutants 
under influence of P. indica. 
During infection with pathogens there occurs a reorganization of the actin cytoskeleton. By 
means of GFP-FABD2-rop1-, rop6- and rop1rop6- knock out mutants, which were generated, 
the actin cytoskeleton in roots was analyzed when cultivated with P. indica. It could be 
demonstrated, that an enhanced formation of actin bundles und actin cables was present only 
in the wildtype. This points to an increased transport of substances, which fails in mutants. 
In the knock-out mutants rop1 and rop6 a reduction of actin bundles and actin cables was 
observed. In the double mutant these actin structures were missing. Therefore, the results 
indicate that ROP1 and ROP6 are involved in the regulation of the actin cytoskeleton, 
presumably by activation and inactivation of actin-binding proteins and protein-complexes. 
The absence of actin bundles and actin cables in the double mutant is an indication for 
redundant functions of ROP1 and ROP6. 
Numerous abiotic and biotic stimuli cause an influx of calcium ions in the cytosol followed 
by the activation of signaling pathways. A cell wall-extract of P. indica was shown to trigger 
a transient receptor-mediated calcium influx into the cytoplasm of Arabidopsis roots. ROP 
proteins are likely associated with such receptors and the regulation of calcium gradients, but 
for P. indica cell wall-extract induced calcium influx seems not necessary. 
The presented results indicate, that the small GTPases ROP1 and ROP6 possess redundant 
functions and have a fundamental influence on the symbiotic interaction between Arabidopsis 
and P. indica especially by acting on the regulation of the actin cytoskeleton. 


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Vadassery J., S. Tripathi, R. Prasad, A. Varma, R. Oelmüller (2009b): 
Monodehydroascorbate reductase 2 and dehydroascorbate reductase 5 are crucial for a 
mutualistic interaction between Piriformospora indica and Arabidopsis. Journal of Plant 
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multigene family encoding germin-like proteins of barley. Regulation and function in basal 
host resistance. Plant Physiology 142 (1): 181-192. 


Danksagung 

Danksagung 

An erster Stelle möchte ich mich bei meinem Doktorvater Prof. Dr. Ralf Oelmüller für die 
Vergabe des interessanten Themas, die fachliche Betreuung und die gewährte Freiheit bei der 
Durchführung und Erstellung dieser Arbeit sowie das Verständnis für häufige 
Kinderkrankheiten bedanken. 
Ganz besonders dankbar bin ich Frau Dr. Bationa Shahollari für die Einarbeitung, fachliche 
Betreuung und andauernde Freundschaft. Mein herzlichster Dank gilt auch Heide Becker für 
ihre Hilfe im Labor, Pflege der Pflanzen mit anschließender Entsorgung und ihre 
motivierenden Gespräche. Iris Camehl möchte ich für ihre große Hilfsbereitschaft im 
Laboralltag und kritische Durchsicht des Manuskripts danken. Frau Dr. Birgit Perner danke 
ich für die Hilfe bei der Einarbeitung am ApoTome-Mikroskop und bei der Auswertung der 
Bilder. Bei Frau Dr. Katrin Boywitz und Kai-Uwe Schmidtke möchte ich mich für die 
Einarbeitung in die real-time-PCR bedanken. Kristin Schüffler danke ich für die 
Unterstützung bei der RNA-Isolation. Bei PD Dr. Thomas Pfannschmidt möchte ich mich für 
seinen fachlichen Rat bedanken. Dr. Jyothi Vadassery, Joy M. Johnson und Eileen Seebald 
danke ich für ihre Hilfe bei der Arbeit am Luminometer und der Auswertung der Daten. 
Unseren technischen Assistentinnen Sarah und Claudia möchte ich für zahlreiche 
unterstützende Tätigkeiten im Laboralltag danken. Bedanken möchte ich mich auch bei Dr. 
Boris Voigt und Dr. Stefanie Ranf für die Bereitstellung des GFP-FABD2- bzw. pMAQ- 
transformierten Saatgutes. Dr. Jeannette Pfalz und Dr. Harald Kellner möchte ich für die 
Durchsicht des Manuskripts und Dr. Lars Dietzel für die freundliche Beantwortung 
zahlreicher Fragen danken. Allen derzeitigen und ehemaligen Mitarbeitern des Instituts danke 
ich für die freundliche Atmosphäre und Hilfsbereitschaft. 

Mein ganz besonderer Dank gilt meinen Eltern. Ohne ihre Unterstützung wäre diese Arbeit 
nicht zustande gekommen. Meinem Lebensgefährten Sebastian Miethbauer danke ich für 
seine Geduld und die Manuskriptdurchsicht. Unserem Sohn Johannes danke ich dafür, dass er 
mich allen Arbeits-Stress vergessen lässt. 


Publikationen 

Publikationen 

Oelmüller R., B. Shahollari, T. Peskan-Berghöfer, A. Trebicka, P.H. Giong, I. 
Sherameti, M. Oudhoff, Y. Venus, L. Altschmied, A. Varma (2004): Molecular analyses 
of the interaction between Arabidopsis roots and the growth-promoting fungus 
Piriformospora indica. Endocytobiosis and Cell Research 15 (2): 504-517. 

Sherameti I., B. Shahollari, Y. Venus, L. Altschmied, A. Varma, R. Oelmüller (2005): 
The endophytic fungus Piriformospora indica stimulates the expression of nitrate reductase 
and the starch-degrading enzyme glucan-water dikinase in tobacco and Arabidopsis roots 
through a homeodomain transcription factor that binds to a conserved motif in their 
promoters. Journal of Biological Chemistry 280 (28): 26241-26247. 

Wissemann V., H. Baumbach, S. Müller, Y. Venus, F. H. Hellwig (2007): Small scale 
analysis of population structure in the woody cornelian cherry Cornus mas L. (Cornaceae) 
by AFLP accentuates the need for a population based conservation strategy. Journal of 
Applied Botany and Food Quality 81 (2): 175-177. 

Sherameti I., Y. Venus, C. Drzewiecki, S. Tripathi, V. M. Dan, I. Nitz, A. Varma, F. M. 
Grundler, R. Oelmüller (2008): PYK10, a beta-glucosidase located in the endoplasmatic 
reticulum, is crucial for the beneficial interaction between Arabidopsis thaliana and the 
endophytic fungus Piriformospora indica. Plant Journal 54 (3): 428-439. 

Vadassery J., C. Ritter, Y. Venus, I. Camehl, A. Varma, B. Shahollari, O. Novak, M. 
Strnad, J. Ludwig-Muller, R. Oelmüller (2008): The role of auxins and cytokinins in the 
mutualistic interaction between Arabidopsis and Piriformospora indica. Molecular Plant-
Microbe Interactions 21 (10): 1371-1383. 

Camehl I., I. Sherameti, Y. Venus, G. Bethke, A. Varma, J. Lee, R. Oelmüller (2010): 
Ethylene signalling and ethylene-targeted transcription factors are required to balance 
beneficial and nonbeneficial traits in the symbiosis between the endophytic fungus 
Piriformospora indica and Arabidopsis thaliana (p). New Phytologist 185 (4): 1062-1073. 

Venus Y. und R. Oelmüller (2010): The small GTPases ROP1 and ROP6 regulate the 
reorganization of the actin cytoskeleton and the gene expression during the beneficial 
interaction between the endophytic fungus Piriformospora indica and Arabidopsis thaliana. 
(in Vorbereitung). 


Tagungsbeiträge 

Tagungsbeiträge 

Vortrag: 

Venus Y. (2006): Are small GTPases involved in the recognition of Piriformospora indica by 
Arabidopsis thaliana ? 4. Mitteldeutsche Pflanzenphysiologie-Tagung, Dresden, 20.-21. 
Januar. 

Poster: 

Venus Y., F. Hellwig, V. Wissemann (2003): The influence of cleistogamous and 
chasmogamous seed set on genetic variability of violet populations (Viola, Violaceae). 16th 
International Symposium Biodiversity and Evolutionary Biology of the German Botanical 
society -Botanikertagung, Frankfurt a. M., 21.-27. September. 

Shahollari B., Y. Venus, C. Drzewiecki, R. Oelmüller (2005): Recognition of the growth


3th

promoting fungus Piriformospora indica by Arabidopsis thaliana roots. Biannual 
Symposium of the IMPRS: The Exploration of Ecological Interactions with Molecular and 
Chemical Techniques, Jena, 4.-5. November. 

Sherameti I., Y. Venus, G. Bethke, J. Lee, A. Varma, R. Oelmüller (2007): Promotion of 
growth and seed yield in Arabidopsis induced by the endophytic fungus Piriformospora 
indica require the ethylene signalling components EIN2 and EIN3/EIL1, but no jasmonic 
acid. 10th International Colloquium on Endocytobiology and Symbiosis, Gmunden 
(Österreich), 10.-13. September. 


Ehrenwörtliche Erklärung 

Ehrenwörtliche Erklärung 

Die vorliegende Arbeit wurde am Institut für Allgemeine Botanik und Pflanzenphysiologie 
der Biologisch-Pharmazeutischen Fakultät (Friedrich-Schiller-Universität Jena) unter 
Anleitung von Herrn Prof. Dr. Ralf Oelmüller angefertigt. 

Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbstständig und nur unter Verwendung 
der angegebenen Hilfsmittel und Literatur angefertigt habe, wobei mir die in der Danksagung 
erwähnten Personen unterstützend bei den aufgeführten Untersuchungen geholfen haben. Mir 
ist die geltende Promotionsordnung der Biologisch-Pharmazeutischen Fakultät der FriedrichSchiller-
Universität Jena bekannt. Weiterhin versichere ich, dass diese Arbeit noch an keiner 
anderen Hochschule als Dissertation oder Prüfungsleistung vorgelegt wurde. Die Hilfe eines 
Promotionsberaters wurde von mir nicht in Anspruch genommen. Dritte haben von mir weder 
unmittelbar noch mittelbar geldwerte Leistungen für Arbeiten erhalten, die im 
Zusammenhang mit der vorgelegten Dissertation stehen. 

Jena, 10. Juni 2010 Yvonne Venus 


