Isoform-spezifische Funktion und Regulation der
Proteinkinase-Aktivität G-Protein-regulierter
Phosphatidylinositol-3-Kinasen
Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)
vorgelegt dem Rat der Biologisch-Pharmazeutischen Fakultät der
Friedrich-Schiller-Universität Jena
von Cornelia Czupalla
geboren am 27. August 1970 in Erfurt
1. Gutachter: Prof. Dr. A.G. Beck-Sickinger (Leipzig)
2. Gutachter: Prof. Dr. Dr. B. Nürnberg (Düsseldorf)
3. Gutachter: Prof. Dr. R. Wetzker (Jena)
Tag der Disputation: 01.07.2002
Inhaltsverzeichnis I
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG 1
1.1 Allgemeine Prinzipien der zellulären Kommunikation 1
1.2 G-Protein-abhängige Signaltransduktion 4
1.2.1 Aufbau und Funktion von G-Proteinen 4
1.2.1.1 G?-Untereinheit 4
1.2.1.2 G?- und G?-Untereinheit 6
1.2.2 G??-regulierte Effektoren 8
1.3 PI-3-Kinasen 10
1.3.1 Die Familie der PI-3-Kinasen 10
1.3.2 Struktur und Regulation von Klasse I PI-3-Kinasen 11
1.3.3 Zelluläre Effekte der Lipidprodukte von Klasse I PI-3-Kinasen 16
1.3.4 Proteinkinase-Aktivität von Klasse I PI-3-Kinasen 19
2 FRAGESTELLUNG 21
3 MATERIALIEN 22
3.1 Hersteller und Lieferanten 22
3.2 Chemikalien 22
3.3 Enzyme, Proteine, Peptide und andere biologisch aktive Substanzen 24
3.4 Radioaktiv markierte Substanzen 25
3.5 Zellen 25
3.6 Zellkulturmedien und Zusätze 25
3.7 Vektoren 25
3.8 DNA- und Proteinstandards 26
3.9 Reinigungs- und Trennmaterialien 26
3.10 Membranen/Filter 26
3.11 Filmmaterial 26
4 METHODEN 27
4.1 Molekularbiologische Methoden 27
4.1.1 Medien für die Bakterienkultur 27
4.1.2 Herstellung des Baculovirus-Transferplasmids für die Hexahistidin-markierte
p110?-Untereinheit 28
4.1.3 Ortsgerichtete Mutagenese 28
Inhaltsverzeichnis II
4.2 Expression rekombinanter Proteine in Insektenzellen 29
4.2.1 Transposition und Isolation rekombinanter Bacmid-DNA 31
4.2.2 Kultivierung von Sf9-Zellen 31
4.2.3 Transfektion von Sf9-Zellen mit rekombinanter Bacmid-DNA 32
4.2.4 Amplifikation rekombinanter Viren 32
4.2.5 Titerbestimmung von Viruslösungen 32
4.2.6 Infektion von Sf9-Zellen 33
4.3 Säugerzellkultur und transiente Transfektion 33
4.3.1 HL-60-Zellkultur 33
4.3.2 HEK293-Zellkultur und transiente Transfektion 34
4.4 Bestimmung der O2
--Produktion in HL-60-Zellen 34
4.5 Reinigung rekombinanter Proteine 35
4.5.1 Präparation von Cytosol und Zellmembranen 35
4.5.2 Affinitätschromatographie 35
4.5.2.1 Reinigung rekombinanter Hexahistidin-markierter G?1?2-Komplexe 35
4.5.2.2 Reinigung rekombinanter Hexahistidin-markierter PI-3-Kinasen 36
4.5.2.3 Reinigung rekombinanter GST-fusionierter PI-3-Kinasen 36
4.5.3 Anionenaustausch-Chromatographie 36
4.6 Immunpräzipitation 36
4.7 Proteinbiochemische Analyse-Methoden 37
4.7.1 Proteinbestimmung 37
4.7.2 SDS-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) 37
4.7.3 Coomassie-Färbung von SDS-Polyacrylamidgelen 38
4.7.4 Immunoblot 39
4.8 PI-3-Kinase-Funktionsbestimmung 39
4.8.1 Herstellung der Phospholipid-Vesikel 40
4.8.2 Bestimmung der Lipidkinase-Aktivität 40
4.8.3 Bestimmung der Proteinkinase-Aktivität 41
4.9 Phosphoaminosäure-Analyse 41
4.10 Massenspektrometrische Methoden 42
4.10.1 Spaltung der Gel-fixierten Proteine 42
4.10.2 Aufreinigung der peptidhaltigen Lösung mittels ZipTip 42
4.10.3 Reversed phase-HPLC 43
4.10.4 MALDI-MS 43
4.10.5 Massenspektrometrische Peptidsequenzierung 43
Inhaltsverzeichnis III
5 ERGEBNISSE 44
5.1 Charakterisierung der Autophosphorylierung der PI-3-Kinase ??44
5.1.1 G??-Sensitivität der Autophosphorylierung 44
5.1.2 Stöchiometrie der Autophosphorylierung 46
5.1.3 Einfluß der Autophosphorylierung der p110?-Untereinheit auf die Lipid-
kinase-Aktivität der PI-3-Kinase ??48
5.2 Identifizierung der Phosphorylierungsstelle der p110?-Untereinheit 49
5.2.1 Phosphoaminosäure-Analyse 49
5.2.2 Identifizierung des phosphorylierten Serin-Restes 50
5.2.2.1 Analyse verschiedener proteolytischer Spaltungen der phosphorylierten
p110?-Untereinheit 50
5.2.2.1.1 Proteolytisches Abbaumuster der phoshorylierten p110?-Untereinheit 51
5.2.2.1.2 MALDI-MS-Analyse der Protease-Spaltungen 52
5.2.2.2 Isolierung und MALDI-MS-Analyse von Phosphopeptiden 55
5.2.2.2.1 Effektivität der Gewinnung von Phosphopeptiden nach proteolytischer
Spaltung der Gel-fixierten phosphorylierten p110?-Untereinheit 56
5.2.2.2.2 Isolierung von Phosphopeptiden durch reversed phase-HPLC 58
5.2.2.3 Massenspektrometrische Sequenzierung eines C-terminalen Phospho-
peptids der p110?-Untereinheit 61
5.2.3 Lipid- und Proteinkinase-Aktivität von PI-3-Kinase ?-Mutanten 62
5.3 Proteinkinase-Aktivität der PI-3-Kinase ??64
5.3.1 Charakterisierung der Autophosphorylierung der PI-3-Kinase ??64
5.3.2 Identifizierung der Phosphorylierungsstelle der p110?-Untereinheit 67
5.3.3 Lipid- und Proteinkinase-Aktivität von PI-3-Kinase ?-Mutanten 70
5.4 Mechanismus der Autophosphorylierung G????????-sensitiver PI-3-Kinasen 72
5.5 In vivo-Autophosphorylierung der PI-3-Kinase ??74
5.5.1 Nachweis der PI-3-Kinase ??in HL-60-Zellen 74
5.5.2 Biochemische Charakterisierung der in HL-60-Zellen enthaltenen PI-3-Kinase ??76
5.5.3 In vivo-Proteinkinase-Aktivität der PI-3-Kinase ??77
6 DISKUSSION 81
6.1 Mechanismen der Spezifität PI-3-Kinase-abhängiger Signalwege 81
6.2 In vitro-Proteinkinase-Aktivität von Klasse I PI-3-Kinasen 84
6.3 Mechanismus der Autophosphorylierung 90
6.4 Zellbiologisch-funktionelle Konsequenzen der Proteinkinase-
Aktivität von Klasse I PI-3-Kinasen 92
Inhaltsverzeichnis IV
7 ZUSAMMENFASSUNG 98
8 LITERATURVERZEICHNIS 100
EIGENE PUBLIKATIONEN 122
LEBENSLAUF 124
DANKSAGUNG 125
Abkürzungen, Begriffe
V
ABKÜRZUNGEN, BEGRIFFE
Abb. Abbildung
AC Adenylylcyclase
APS Ammoniumperoxodisulfat
ATP Adenosin-5’-triphosphat
?-ME ?-Mercaptoethanol
BSA (engl.) bovine serum albumin; Rinderserumalbumin
cAMP cyclisches Adenosin-3’:5’-monophosphat
cGMP cyclisches Guanosin-3’:5’-monophosphat
Ci Curie
cpm (engl.) counts per minute; gemessene radioaktive Zerfälle pro Minute
CTX Choleratoxin, Exotoxin von Vibrio cholerae
DAG Diacylglycerol
dbt-cAMP N6,2’-O-Dibutyryl-3’:5’-adenosinmonophosphat
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonukleinsäure
DTT Dithiothreitol
EC50 Konzentration eines Wirkstoffs, bei der die Hälfte des maximal
möglichen Effektes erreicht wird
E. coli Escherichia coli, Bakterienzellen
EDTA Ethylendiamin-N,N,N’,N’-tetraessigsäure
EGTA Bis(aminoethyl)-glycolether-N,N,N’,N’-tetraessigsäure
engl. englisch; Bezeichnung im Englischen
(x) g Erdbeschleunigung (9,81 m/s2)
GABA ?-Aminobuttersäure
GDP Guanosin-5’-diphosphat
G-Protein heterotrimeres Guaninnukleotid-bindendes Protein
GST Glutathion-S-Transferase
GTP Guanosin-5’-triphosphat
h (engl.) hours; Stunden
HEK293-Zellen humane embryonale Nieren-Zellinie
HEPES N-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N’-2-ethansulfonsäure
HL-60-Zellen humane Promyelozytenleukämie-Zellinie
HPLC (engl.) high pressure liquid chromatography; Hochdruck-Flüssigkeits-
Chromatographie
IP3 Inositol-1,4,5-trisphosphat
kDa Kilodalton
LB-Medium Luria-Bertani-Medium
Lubrol PX Polyoxyethylen-(9)-laurylether
M mol pro Liter
MALDI (engl.) matrix-assisted laser desorption/ionization
min Minuten
MOI (engl.) multiplicity of infection; Virus/Zellverhältnis
MS Massenspektrometrie
nESI-MS/MS Nanoelektrospray-Tandem-Massenspektrometrie
Ni2+-NTA Nickel-Nitrilotetraacetat
Abkürzungen, Begriffe
VI
p85 Prototyp der nicht-katalytischen Untereinheit der Klasse IA
PI-3-Kinasen ?, ??und ?
p101 nicht-katalytische Untereinheit der Klasse IB PI-3-Kinase ?
p110 katalytische Untereinheit der Klasse I PI-3-Kinasen
PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese
PBS (engl.) phosphate-buffered saline; NaCl/Phosphatpuffer
PCR (engl.) polymerase chain reaction; Polymerase-Kettenreaktion
pfu Anzahl der Viren, die zur Bildung von Plaques führen (plaque forming
unit)
pH negativer dekadischer Logarithmus der H3O+-Konzentration in
wäßriger Lösung
PLC Phospholipase C
PI-3-Kinase Phosphatidylinositol-3-Kinase
PSD (engl.) post-source decay; metastabile Fragmentierung von Ionen in
der feldfreien Driftstrecke eines MALDI-TOF-Massenspektrometers
PTX Pertussistoxin, Exotoxin von Bordetella pertussis
PVDF Polyvinylidendifluorid
s Sekunden
S.D. (engl.) standard deviation; Standardabweichung
SDS (engl.) sodium dodecyl sulfate; Natriumdodecylsulfat
Sf9-Zellen Ovarialzellinie des Insekts Spodoptera frugiperda
Tab. Tabelle
TEMED N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin
TOF (engl.) time of flight; Flugzeit-Massenanalysator
Tris 2-Amino-2-hydroxymethyl-1,3-propandiol
TPCK N-Tosyl-L-phenylalanin-chloromethylketon
Tween 20 Polyoxyethylen-(20)-monolaurat
Tyr-P-Peptid aus der p85-Bindungsregion des PDGF-Rezeptors abgeleitetes,
zweifach Tyrosin-phosphoryliertes Peptid
UV Ultraviolett
vgl. vergleiche
% (v/v) Volumenprozent
% (w/v) Gewichtsprozent (Gewicht/Volumen)
Aminosäuren sind im Text im Dreibuchstaben-Code abgekürzt; in Tabellen und Abbildungen
wird auch der Einbuchstaben-Code verwendet:
A Ala Alanin C Cys Cystein D Asp Asparaginsäure
E Glu Glutaminsäure F Phe Phenylalanin G Gly Glycin
H His Histidin I Ile Isoleucin K Lys Lysin
L Leu Leucin M Met Methionin N Asn Asparagin
P Pro Prolin Q Gln Glutamin R Arg Arginin
S Ser Serin T Thr Threonin V Val Valin
W Trp Tryptophan Y Tyr Tyrosin
Einleitung 1
1 EINLEITUNG
1.1 Allgemeine Prinzipien der zellulären Kommunikation
Die Basis für die Funktion vielzelliger Organismen bildet deren Fähigkeit zur Wahrnehmung
von Signalen ihrer Umwelt und zum Informationsaustausch zwischen den Zellen des
Organismus. Als Informationsträger für die interzelluläre Kommunikation dienen elektrische
Signale sowie Hunderte verschiedener Signalmoleküle wie z.B. Proteine, Peptide,
Aminosäuren, Zucker, Nukleotide, Steroide, Fettsäurederivate und lösliche Gase wie
Stickstoffmonoxid. Diese Signalmoleküle verlassen die signalisierende Zelle über Exocytose
bzw. Diffusion durch die Plasmamembran oder bleiben an der Zelloberfläche gebunden und
geben das Signal über direkten Kontakt zwischen den Zellen weiter.
Die Signalmoleküle werden durch spezifische Rezeptoren, die sich an der Zelloberfläche
oder im Inneren der Zielzelle befinden, gebunden. So sind die Rezeptoren für
Schilddrüsen- und Steroidhormone, die aufgrund ihrer lipophilen Eigenschaften die Zellmembran
leicht überwinden können, intrazellulär lokalisiert (Evans, 1988, Parker, 1993). Die
meisten Signalmoleküle sind jedoch hydrophiler Natur und können daher die Zellmembran
nicht überwinden. Die Rezeptoren für diese Liganden sind plasmamembranständig und
generieren nach Bindung des Signalmoleküls an den extrazellulären Bereich des Rezeptors
u.a. einen sekundären Botenstoff im Inneren der Zelle. Je nach Mechanismus dieser
Umwandlung eines extrazellulären in ein intrazelluläres Signal kann man verschiedene
Klassen von membranständigen Rezeptoren unterscheiden (Abb. 1).
Liganden-gesteuerte Ionenkanäle sind am schnellen synaptischen Signalprozeß
zwischen elektrisch erregbaren Zellen beteiligt (siehe Abb. 1C). Sie weisen eine multimere
Struktur auf und binden an ihren extrazellulären Bereichen sog. Neurotransmitter, was zu
einer kurzzeitigen Veränderung der Permeabilität der Kanalpore für bestimmte Ionen führt.
So sind nikotinerge Acetylcholin-Rezeptoren, ionotrope Glutamat-Rezeptoren oder ein
Serotonin-Rezeptor (5-HT3-R) im aktivierten Zustand für Kationen durchlässig, während die
Pore des ?-Aminobuttersäure- (GABAA) und des Glycin-Rezeptors nur für Anionen passierbar
ist (Kotzyba-Hilbert et al., 1999, MacDermott et al., 1999, Whiting et al., 1999). Die
zelluläre Antwort wird durch das veränderte Membranpotential der entsprechenden Ionen
ausgelöst.
Enzym-gekoppelte Rezeptoren durchspannen die Zellmembran nur einmal (siehe
Abb. 1B) und weisen im intrazellulären Bereich eine Domäne auf, die selbst eine Enzymaktivität
besitzt oder lösliche Enzyme rekrutieren kann. Zu dieser Klasse gehören neben
Rezeptor-Guanylyl-Cyclasen (Garbers et al., 1994), Rezeptor-Serin/Threonin-Kinasen (ten
Dijke et al., 1996) und Rezeptor-Tyrosin-Phosphatasen (Streuli, 1996) auch Rezeptor-
Tyrosin-Kinasen, zu denen die meisten Wachstumsfaktor-Rezeptoren wie der Insulin-, der
EGF (epidermal growth factor)- oder der PDGF (platelet derived growth factor)-Rezeptor zu
Einleitung 2
rechnen sind (Songyang und Cantley, 1995). Die Signalweiterleitung erfolgt bei diesen
Rezeptoren durch Tyrosin-Phosphorylierung spezifischer Proteinsubstrate bzw. durch
Bindung von Adaptorproteinen an die phosphorylierten Domänen des Rezeptors. Bei anderen
Rezeptoren, wie z.B. dem TNF (tumor necrosis factor)-Rezeptor, dessen Rezeptordomäne
mit einer intrazellulär lokalisierten Tyrosin-Kinase assoziiert ist (Taniguchi et al., 1995),
werden Rezeptor- und Effektorfunktion von zwei verschiedenen Proteinen übernommen.
Abb. 1: Ausgewählte Prinzipien der Signaltransduktion durch Zelloberflächen-Rezeptoren
Extrazelluläre Stimuli können über verschiedene Rezeptorklassen intrazelluläre Effekte auslösen. Die Klasse der
G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (A) benötigt zur Weiterleitung des Signals an Effektoren ein zusätzliches
Schaltermolekül, das sog. G-Protein. Die modulierten Effektoren können ihrerseits membranständig oder
cytosolisch lokalisiert sein. Enzym-gekoppelte Rezeptoren (B) besitzen entweder selbst eine katalytische
Aktivität oder sind mit Enzymen assoziiert. Bei Liganden-gesteuerten Ionenkanälen (C) bilden die extrazelluläre
Rezeptordomäne und die Kanalpore, die durch den Liganden gesteuert wird, prinzipiell eine molekulare Einheit.
G-Protein-gekoppelte Rezeptoren bilden die größte Familie integraler Membranproteine, die
in die Signaltransduktion involviert ist, und können eine Vielzahl von strukturell sehr
divergenten Liganden binden. Diese umfassen neben biogenen Aminen (z.B. Histamin),
Aminosäuren (z.B. Glutaminsäure), Peptiden (z.B. fMLP), Nukleotiden (z.B. ADP), Fettsäurederivaten
(z.B. Thromboxan A2) oder Phospholipidderivaten (z.B. Lysophosphatidsäure)
auch externe sensorische Stimuli wie Lichtquanten, die über das am Rhodopsin-Rezeptor
Einleitung 3
gebundene Retinal aktivierend wirken, sowie Geschmacks- (z.B. Glucose) und Geruchsstoffe
(Ji et al., 1998).
Die Vertreter dieser Rezeptorfamilie weisen charakteristische gemeinsame Strukturmerkmale
auf. Sie durchspannen die Cytoplasmamembran siebenfach durch ?-helikale
Transmembrandomänen und werden daher auch als heptahelikale Rezeptoren bezeichnet. Die
dreidimensionale Struktur konnte im Rahmen von Röntgenstruktur-Analysen des
kristallisierten Rhodopsins in jüngster Zeit aufgeklärt werden (Palczewski et al., 2000). Der
strukturell sehr variable N-terminale Abschnitt trägt zur Bildung der extrazellulären
Liganden-Bindungsdomäne bei, während der C-Terminus cytosolisch lokalisiert ist (Unger
et al., 1997). Im Gegensatz zu Vertretern anderer Rezeptorklassen besitzen G-Proteingekoppelte
Rezeptoren keine Effektordomäne. Sie aktivieren stattdessen ein trimeres Guaninnukleotid-
bindendes Regulatorprotein (G-Protein), das seinerseits in der Lage ist, die
Aktivität von Effektoren zu modulieren (Gudermann et al., 1995, Wess, 1997). Diese können
sowohl membranständig, wie z.B. Ionenkanäle und Adenylyl-Cyclasen, als auch cytosolisch
lokalisiert sein, wie z.B. Phospholipase C- (PLC) oder Phosphatidylinositol-3-Kinase- (PI3K)
Isoformen (siehe Abb. 1A und Hamm, 1998). Die Modulation dieser Effektorproteine bewirkt
eine Konzentrationsänderung der von ihnen gebildeten intrazellulären Botenstoffe, die, wie
z.B. Ca2+, cyclisches AMP (cAMP) oder Inositoltrisphosphat (IP3), ins Cytoplasma diffundieren
oder, wie z.B. Diacylglycerol (DAG) oder Phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphat
(PI-3,4,5-P3), in der Membran verbleiben.
Darüber hinaus kann über die Stimulation G-Protein-gekoppelter Rezeptoren in andere
Rezeptor-vermittelte Signalwege eingegriffen werden („cross-talk“). So erfolgt z.B. eine
Liganden-unabhängige Transaktivierung von Rezeptor-Tyrosin-Kinasen und damit eine
Aktivierung mitogener Signalwege (Liebmann, 2001a). Die Tyrosin-Phosphorylierung und
damit Aktivierung der Rezeptor-Tyrosin-Kinasen kann sowohl über G?q-Untereinheiten als
auch über aus Gi freigesetzte G??-Untereinheiten vermittelt werden (Daub et al., 1997,
Herrlich et al., 1998). Mögliche weitere Mediatoren der Rezeptor-Transaktivierung sind die
Nicht-Rezeptor-Tyrosinkinasen Src (Luttrell et al., 1997) und Pyk2 (Dikic et al., 1996).
Weiterhin konnte nach Aktivierung G-Protein-gekoppelter Rezeptoren eine Metalloproteinase-
abhängige Spaltung von proHB-EGF gezeigt werden (Prenzel et al., 1999), die
über die Freisetzung von HB-EGF, einem Mitglied der EGF-Familie, zur Aktivierung von
EGF-Rezeptoren benachbarter Zellen führte. Somit können die verschiedenen Familien
membranständiger Rezeptoren nicht unabhängig voneinander betrachtet werden, da die von
ihnen aktivierten Signalwege ein Netzwerk vielfacher Wechselwirkungen ausbilden.
Einleitung 4
1.2 G-Protein-abhängige Signaltransduktion
1.2.1 Aufbau und Funktion von G-Proteinen
G-Proteine leiten die Signale von heptahelikalen Rezeptoren an Effektoren im Zellinneren
weiter und sind an der Innenseite der Cytoplasmamembran lokalisiert. Sie bestehen aus einer
G?-Untereinheit, die Guaninnukleotide bindet und eine intrinsische GTPase-Aktivität aufweist,
und aus einem G??-Dimer, das unter physiologischen Bedingungen nicht dissoziiert
(Sondek et al., 1996, Clapham und Neer, 1997, Sunahara et al., 1997). Im inaktiven,
GDP-gebundenen Zustand liegt das G-Protein als Heterotrimer vor und ist mit dem
heptahelikalen Rezeptor assoziiert. Nach der Ligandenbindung an den Rezeptor kommt es
infolge einer Konformationsänderung des Rezeptors und des assoziierten G-Proteins zur
Öffnung der Guaninnukleotid-Bindungstasche und damit zum Austausch von GDP gegen
GTP. Dies bewirkt eine verringerte Affinität von G??zu G???und damit die Dissoziation des
heterotrimeren G-Proteins in zwei funktionelle Einheiten, die GTP-gebundene
G?-Untereinheit und ein G??-Dimer (Gilman, 1987). Beide Untereinheiten können nun
unabhängig voneinander mit Effektoren wechselwirken und diese modulieren. Eine
Modifikation dieses Modells besagt, dass die G-Protein-Untereinheiten auch nach der
Aktivierung assoziiert bleiben, aber eine offenere Konformation einnehmen, die Effektorbindungs-
Domänen freigibt und damit die Wechselwirkung der G?-Untereinheit und des
G??-Dimers mit Effektoren ermöglicht (Rebois et al., 1997). Die Terminierung der Signalweitergabe
erfolgt durch die Hydrolyse des GTP zu GDP durch die GTPase-Aktivität der
G?-Untereinheit, die durch verschiedene Effektoren sowie RGS (regulators of G protein
signaling)-Proteine beschleunigt werden kann (Ross und Wilkie, 2000). Die G?-Untereinheit
nimmt ihre ursprüngliche, inaktive Konformation ein, wodurch die Affinität zu den
Effektoren sinkt und zu G???steigt. G??und G???reassoziieren zum Heterotrimer. Nach
Bindung an den Rezeptor können nun weitere Zyklen durchlaufen werden. Dabei kann ein
Agonist-besetzter Rezeptor mehrere G-Proteine aktivieren, wodurch es zu einer Signalverstärkung
kommt (Nürnberg et al., 1995). Die Regulation der Aktivität des Liganden-besetzten
Rezeptors kann über eine Phosphorylierung des Rezeptors durch eine G-Protein-gekoppelte
Rezeptorkinase (GRK) erfolgen, in die G??-Dimere involviert sind (Pitcher et al., 1992).
1.2.1.1 G ?-Untereinheit
Die Klassifizierung von G-Proteinen erfolgt anhand von DNA-Sequenzhomologien der
G?-Untereinheit des jeweiligen G-Proteins (Simon et al., 1991, Wilkie et al., 1992). Es
werden vier Familien unterschieden, die als Gs, Gi, Gq und G12 bezeichnet werden (Tab. 1).
G?-Untereinheiten unterscheiden sich sowohl in ihrer molaren Masse (39-52 kDa) als auch in
Einleitung 5
ihrer Rezeptor- und Effektorspezifität sowie in ihrer Sensitivität gegenüber bakteriellen
Toxinen.
G-Proteine der Gs-Familie stimulieren die Adenylylcyclase (Jones und Reed, 1989,
Sunahara et al., 1996, Belluscio et al., 1998) und zeigen eine für diese Familie typische
CTX-Sensitivität. Die Familie der Gi-Proteine ist im wesentlichen PTX-sensitiv und umfaßt
neben Gi- und Go-Isoformen auch Gz, Transduzin-Isoformen und Gustduzin (Kaziro et al.,
1991, Exner et al., 1999).
Tab. 1: Klassifizierung der heterotrimeren G-Proteine nach ihren G?-Untereinheiten
Familie Subtyp1 Vorkommen Effektoren2 PTX-/CTXSensitivität3
Gs Gs(s),s(l) ubiquitär AC ! CTX
Ca2+-Kanal !
Gs(xl) ? AC ! CTX
Golf olfaktorisches Epithel AC ! CTX
Gi Gt(r,c)
4 Retina cGMP-PDE ! CTX, PTX
Ggust Geschmacksknospen cGMP-PDE !? CTX, PTX
Gi1 überwiegend neuronal AC " PTX, (CTX)
K+-Kanal !
Gi2, i2(l) ubiquitär AC ", PI3K ! PTX5, (CTX)
K+-Kanal !
Gi3 überwiegend nicht-neuronal AC ", PI3K ! PTX, (CTX)
K+-Kanal !
Go1, o2, o3 neuronal, endokrin Ca2+-Kanal " PTX, (CTX)
rap1GAP !
Gz neuronal, endokrin, Thrombozyten AC "?
rap1GAP (?)
Gq Gq ubiquitär PLC-??!
G11 nicht-hämatopoetische Zellen PLC-??!
G14 Hoden, Milz, Nieren PLC-??!
G15/16
6 hämatopoetische Zellen PLC-??!
G12 G12 ubiquitär Rho-GEF !
G13 ubiquitär Rho-GEF !
1 (s) und (l) bezeichnen kurze bzw. lange Spleißvarianten der entsprechenden G?-Untereinheit, (xl) bezeichnet
eine Variante von G?s mit 74 kDa.
2 AC: Adenylylcyclase; cGMP-PDE: cGMP-spaltende Phosphodiesterase; PLC-?: Phospholipase C-?; PI3K:
Phosphatidylinositol-3-Kinase; Rho-GEF: Guaninnukleotid-Austausch-Faktor der monomeren GTPase Rho;
! = Stimulation; " = Hemmung.
3 PTX = Pertussistoxin-sensitiv; CTX = Choleratoxin-sensitiv; (CTX) = CTX-sensitiv nur in Anwesenheit Agonistbesetzter
Rezeptoren.
4 Gt(r) und Gt(c) bezeichnen Transduzine in Stäbchen- (engl.: „rod“) und Zapfenzellen (engl. „cone“) der Retina.
5 Gi2(l) zeigt keine Pertussistoxin-Sensitivität.
6 G?15/16 sind Speziesvarianten von Maus bzw. Mensch.
Einleitung 6
Während Gi- und möglicherweise auch Gz-Proteine die Adenylylcyclase hemmen (Taussig
und Gilman, 1995), spielt die Go-Subfamilie eine Rolle bei der Hemmung spannungsabhängiger
Ca2+-Kanäle und des vesikulären Amintransporters (Kalkbrenner et al., 1996,
Ahnert-Hilger et al., 1998) sowie bei der Regulation der monomeren GTPase Rap durch
direkte Interaktion mit Rap1GAP (Jordan et al., 1999). Transduzin, das von Licht-aktiviertem
Rhodopsin stimuliert wird, aktiviert seinerseits eine cGMP-abhängige Phosphodiesterase
(Kaupp und Koch, 1992). Das nahe verwandte Gustduzin vermittelt in olfaktorischen
Sinneszellen die Geschmacksqualitäten bitter und süß (Wong et al., 1996). Proteine der Gq-
Familie stimulieren Phospholipasen vom C-?-Typ. Daher wird angenommen, dass diese
G-Protein-Familie für die PTX-insensitive, durch IP3-vermittelte Ca2+-Freisetzung aus
intrazellulären Speichern verantwortlich ist (Blank et al., 1991, Smrcka et al., 1991, Kozasa
et al., 1993, Lee und Rhee, 1995). Beide Mitglieder der G12-Familie sind ebenfalls PTXinsensitiv
und werden zwar ubiquitär, aber nur in geringen Mengen exprimiert (Strathmann
und Simon, 1991, Spicher et al., 1994). Funktionell bedeutend für diese G-Protein-Familie
sind u.a. die Stimulation des Na+/H+-Austauschers (Dhanasekaran et al., 1994), die
Regulation von c-Jun-N-terminalen Kinasen (Prasad et al., 1995) und die Aktivierung von
Rho-Proteinen (Gohla et al., 1997, 1998). Direkte Effektoren sind Guaninnukleotid-
Austauschfaktoren des Rho, z.B. p115RhoGEF (Chen et al., 2001, Wells et al., 2001). Die
aufgeführten Befunde werden auch durch Studien an Gen-deletierten Mäusen bestätigt
(Offermanns, 2001).
1.2.1.2 G ?- und G ?-Untereinheit
G??-Komplexe besitzen im Gegensatz zu G?-Untereinheiten keine intrinsische Enzymaktivität
und sind wesentlich lipophiler. Wie bei den G?-Untereinheiten werden auch bei den
G?- und G?-Untereinheiten verschiedene Isoformen unterschieden, die anhand von DNASequenzhomologien
einzelnen Subfamilien zugeordnet werden (Tab. 2). G?-Untereinheiten
weisen eine Molmasse von 35-39 kDa auf, während G?-Untereinheiten mit 6-8 kDa deutlich
kleiner sind. Die G?-Familie umfaßt einschließlich Spleißvarianten mittlerweile 7 Mitglieder,
während bislang 12 verschiedene G?-Untereinheiten bekannt sind, deren jüngster Vertreter,
G?13, erst kürzlich kloniert und charakterisiert wurde (Sondek et al., 1996, Huang et al., 1999,
Schwindinger und Robishaw, 2001).
Die G?-Isoformen 1-4 weisen eine Aminosäureidentität von 78-88 % auf. Dieser hohe
strukturelle Verwandtschaftsgrad äußert sich auch in der Einheitlichkeit ihrer funktionellen
Eigenschaften. Bisher konnten keine signifikanten Unterschiede in der Wechselwirkung mit
Effektoren, G?-Untereinheiten oder Rezeptoren festgestellt werden (Gautam et al., 1998).
Hingegen zeigt G?5 nur 51-53 % Aminosäureidentität zu den übrigen G?-Isoformen und
weist ein restriktiveres Expressionsmuster auf (Watson et al., 1994, Jones et al., 1998, Brunk
et al., 1999). Im Vergleich mit den anderen G?-Untereinheiten ist die Assoziation von G?5
Einleitung 7
mit G?-Untereinheiten verändert, was sich in einer erhöhten Detergenz-Labilität von
G?5?-Dimeren äußert (Jones et al., 1999). In manchen Geweben ist G?5 auch cytosolisch
lokalisiert (Watson et al., 1996). G?5 ist in der Lage, mit bestimmten RGS-Proteinen
heterodimere Komplexe zu bilden, wobei die Wechselwirkung über eine sog. GGL-Domäne
(G protein ??subunit like) des RGS-Proteins erfolgt (Snow et al., 1998, Levay et al., 1999).
Derartige G?5-RGS-Komplexe können die Kinetik der G??-vermittelten Stimulation von
K+-Kanälen (GIRKs) modulieren (Kovoor et al., 2000). Daneben werden durch
G?5?-Komplexe bekannte G??-Effektoren, wie die PLC-?, moduliert (Watson et al., 1994,
Lindorfer et al., 1998).
Tab. 2: Bisher bekannte G?- und G?-Untereinheiten heterotrimerer G-Proteine
G?-Untereinheiten G?-Untereinheiten
Subtyp1 Vorkommen Subtyp3 Vorkommen
Familie I: G?1 ubiquitär Familie I: G?1 Retina (Stäbchen)
G?2 ubiquitär G?9 Retina (Zäpfchen)
G?3 ubiquitär G?11 nicht-neuronal
G?3(s) ?
G?4 neuronal, Lunge Familie II: G?5 Plazenta, Leber
G?10 ubiquitär
Familie II: G?5 neuronal, Pankreas,
Herz, Leber, Niere2 Familie III: G?2 ubiquitär
G?5(l) Retina G?3 neuronal, Hoden
G?4 verbreitet
G?7 weit verbreitet
G?8 neuronal, olf. Zilien
G?12 ubiquitär
Familie IV? G?13 Geschmacksknospen
Die Einteilung in einzelne G?- und G?-Familien beruht auf DNA-Sequenzhomologie-Untersuchungen.
1 (s) und (l) bezeichnen kurze („short“) bzw. lange („long“) Spleißvarianten der entsprechenden G?-Untereinheit.
2 Die Expression von G?5 ist bei der Maus auf neuronales Gewebe beschränkt (Jones et al., 1998).
3 Bei der Benennung der G?-Untereinheiten ist die Bezeichnung G?6 ausgenommen.
G?-Untereinheiten zeigen mit nur 27-76 % Aminosäureidentität eine höhere Strukturdiversität
als G?- und G?-Untereinheiten (Ray et al., 1995, Gautam et al., 1998). Die Klassifizierung
erfolgt anhand von Aminosäurehomologien und von Unterschieden in der posttranslationalen
Modifikation in derzeit drei Gruppen. Allerdings zeigt das erst Ende 1999 entdeckte G?13 nur
eine 24-32 %ige Aminosäureidentität zu allen anderen bekannten Formen, so dass dies der
Prototyp einer vierten Subfamilie sein könnte (Huang et al., 1999, siehe Tab. 2).
G?-Untereinheiten werden durch Isoprenylierung eines Cystein-Restes innerhalb des sog.
CAAX-Motivs im C-Terminus des Proteins posttranslational modifiziert (Fukada et al., 1990,
Casey und Seabra, 1996). Die meisten G?-Untereinheiten besitzen ein Leucin als C-terminale
Einleitung 8
Aminosäure des CAAX-Motivs, daher wird das innerhalb des Motivs liegende Cystein mit
einem C20-Geranylgeranyl-Rest modifiziert. Ist die letzte Aminosäure ein Serin, wie es bei
den G?1-, G?9- und G?11-Isoformen der Fall ist, wird die G?-Untereinheit C15-farnesyliert
(Chen et al., 1991, Ray et al., 1995). Nach der Isoprenylierung der G?-Untereinheit erfolgen
die proteolytische Abspaltung des AAX-Restes und die Methylierung des nun C-terminalen
Cysteins (Cook et al., 1998). Der Isoprenyl-Rest ist für die Verankerung des G??-Dimers in
der Cytoplasmamembran verantwortlich. Weiterhin scheint die Isoprenylierung der
G?-Untereinheit, obwohl sie für die Assoziation mit G??nicht erforderlich ist, eine Rolle bei
der Interaktion des G??-Dimers mit Rezeptoren und Effektoren zu spielen (Kisselev et al.,
1994, 1995, Yasuda et al., 1996, Myung et al., 1999).
1.2.2 G ?????-regulierte Effektoren
Lange Zeit wurde angenommen, dass G??-Komplexe lediglich die G?-Untereinheit im GDPgebundenen,
inaktiven Zustand stabilisieren und an der Zellmembran verankern (Sternweis,
1986). So führte die Entdeckung, dass aus Gi freigesetzte G??-Dimere den stimulierenden
Effekt von G?s auf die Adenylylcyclase inhibieren können, zu der Annahme, dass die nach
Rezeptoraktivierung aus Gi freigesetzten G??-Komplexe mit G?s das heterotrimere und damit
inaktive Gs bilden (Gilman, 1987). Erste Hinweise auf eine eigenständige Effektor-
Modulation durch G??-Komplexe ergaben sich durch den Befund, dass ein K+-Kanal (IKACh)
in atrialen Myozyten durch muskarinerge Agonisten aktiviert wird (Breitwieser und Szabo,
1985, Kurachi et al., 1986). Die Rezeptor-vermittelte Stimulation des Kanals konnte durch
gereinigte G??-Dimere eindeutig nachgewiesen werden (Logothetis et al., 1987). Seitdem
wurde für eine Vielzahl weiterer Effektoren eine Modulation durch G??- Dimere beschrieben
(Tab. 3).
So sind bestimmte Phospholipase C-Isoformen sensitiv gegenüber G??-Untereinheiten.
Diese Enzym-Familie katalysiert die Spaltung von PI-4,5-P2 in IP3 und DAG
(Rebecchi und Pentyala, 2000). Während IP3 eine Erhöhung der intrazellulären Ca2+-
Konzentration durch dessen Freisetzung aus intrazellulären Speichern bewirkt, werden durch
DAG Proteinkinase C-Isoformen aktiviert (Bootman und Berridge, 1995). Nur die Phospholipase
C-?-Familie wird durch heterotrimere G-Proteine und hierbei sowohl durch G?q-
Untereinheiten als auch durch G??-Komplexe reguliert (Exton, 1997). Durch G?q-
Untereinheiten werden alle Phospholipase C-?-Isoformen mit Ausnahme einer PLC-?4-
Spleißvariante stimuliert (Smrcka und Sternweis, 1993, Kim et al., 1998). Die
PTX-Sensitivität der G??-vermittelten Stimulation deutet darauf hin, daß die G??-Komplexe
aus Gi-Proteinen freigesetzt werden. Während die PLC-?2 und PLC-?3 eine hohe Sensitivität
gegenüber G??-Komplexen aufweisen, wird die PLC-?1 nur schwach aktiviert (Camps et al.,
1992, Park et al., 1993). Für die PLC-?4-Isoform konnte bislang keine Aktivierung durch
G??-Dimere nachgewiesen werden (Jiang et al., 1994). Die Sensitivität der Phospho-
Einleitung 9
lipase C-?-Isoformen gegenüber G?q bzw. G???wird bestimmten Enzym-Strukturen
zugeordnet. So sind in erster Linie C-terminale Bereiche der Phospholipase C-??in die
Wechselwirkung mit G?q-Untereinheiten involviert (Wang et al., 1999a). Für die Bindung
von G??-Komplexen sollen sowohl größere N-terminale Bereiche, insbesondere die PHDomäne,
als auch Regionen am Beginn der sog. Y-Domäne verantwortlich sein (Kuang et al.,
1996, Sankaran et al., 1998, Wang et al., 1999b).
Tab. 3: G????????-regulierte Effektoren
# = Stimulation; $ = Hemmung
1 Es wurden nur Effektoren berücksichtigt, die direkt mit G???interagieren sollen.
2 G???inhibiert die G?s–aktivierten Adenylylcyclase-Isoformen I, V und VI.
3 G???stimuliert die G?s-aktivierten Adenylylcyclase-Isoformen II und IV.
4 Zu den ?-adrenergen Rezeptorkinasen gehören die G-Protein gekoppelten Rezeptorkinasen (GRK) 2 und 3.
5 GIRK: (engl.) G protein-gated inwardly rectifying K+-channel; G-Protein-regulierter einwärts gleichrichtender
K+-Kanal
Spannungsabhängige Ca2+-Kanäle vom N- sowie P/Q-Typ bilden eine weitere Klasse
G-Protein-abhängiger Effektoren. Während auch hier zunächst angenommen wurde, dass der
hemmende Effekt durch G?-Untereinheiten vermittelt wird, konnten Ikeda (1996) sowie
Herlitze und Mitarbeiter (1996) zeigen, dass primär G??-Komplexe die Hemmung der
spannungsabhängigen Ca2+-Kanäle bewirken. Die Interaktion der G??-Dimere mit der
porenbildenden ?1-Untereinheit des Ca2+-Kanals soll sowohl innerhalb der intrazellulären
Schleife zwischen den Transmembran-Segmenten I und II als auch im C-Terminus der
?1-Untereinheit des Ca2+-Kanals erfolgen (Zhang et al., 1996, De Waard et al., 1997).
Effektor1 Modulation Referenz
Adenylylcyclase2,3 $,# Sunahara et al., 1996
Phosphatidylinositol-3-Kinase # Dekker und Segal, 2000
Phospholipase C-??# Exton, 1997
Phospholipase A2 # Jelsema und Axelrod, 1987
?-adrenerge Rezeptorkinasen4 # Pitcher et al., 1998
spannungsabhängige Ca2+-Kanäle $ Hofmann et al., 1997
K+-Kanäle (GIRKs)5 # Jan und Jan, 1997
Raf-1-Protein-Kinase # Pumiglia et al., 1995
Ras-Austauschfaktor (p140Ras-GRF) # Mattingly und Macara, 1996
Bruton-Tyrosinkinase (Btk) # Tsukada et al., 1995
Tsk-Tyrosinkinase # Langhans-Rajasekaran et al., 1995
Einleitung 10
1.3 PI-3-Kinasen
1.3.1 Die Familie der PI-3-Kinasen
Seit langem ist bekannt, dass Phosphoinositide als Vorläufer sekundärer Botenstoffe dienen
und damit in die Signalwege von Zelloberflächen-Rezeptoren involviert sind. So wird
PI-4,5-P2 von verschiedenen Phospholipase C-Isoformen in IP3 und DAG gespalten (siehe
1.2.2). Phosphatidylinositol-3-Kinasen katalysieren die Übertragung eines Phosphatrestes auf
die 3’-Position des Inositolrings von Phosphoinositiden und generieren damit PI-3-P,
PI-3,4-P2 und PI-3,4,5-P3. Aufgrund ihrer in vitro-Spezifität für bestimmte Phosphoinositid-
Substrate können PI-3-Kinasen in verschiedene Klassen unterteilt werden (Tab. 4).
Tab. 4: Klassifizierung von PI-3-Kinasen und Strukturmerkmale ihrer katalytischen
Untereinheiten
Untereinheiten Lipid-Substrate
Klasse strukturelle Merkmale der
katalytischen Untereinheit katalytisch nicht-katalytisch in vitro in vivo
IA
p110?
p110?
p110?
p50?
p55???
p85????PI-4,5-P2
IB p110??p101
PI
PI-4-P
PI-4,5-P2
II
PI3K-II?
PI3K-II?
PI3K-II?
PI3K68D
Cpk
?
PI
PI-4-P
?
III Vps34p p150 PI PI
p85-Bindung Ras-Bindung PIK Kinase-Domäne C2
nach Vanhaesebroeck und Waterfield, 1999, modifiziert
Die heterodimeren Klasse I PI-3-Kinasen bestehen aus einer 110-120 kDa schweren
katalytischen Untereinheit (p110) und aus einer 50-101 kDa schweren nicht-katalytischen
Untereinheit (p50, p55, p85, p101). In vitro katalysieren sie die Phosphorylierung von PI,
PI-4-P und PI-4,5-P2, während in vivo PI-4,5-P2 das bevorzugte Substrat darstellt (Hawkins
et al., 1992).
Einleitung 11
Klasse II PI-3-Kinasen sind 170-210 kDa schwere Enzyme, die eine charakteristische
C-terminale C2-Domäne aufweisen. Sowohl PI als auch PI-4-P dienen als in vitro-Substrate
dieser PI-3-Kinase-Familie. Im Gegensatz zu den hauptsächlich cytosolisch lokalisierten
Klasse I PI-3-Kinasen konnten Klasse II PI-3-Kinasen in partikulären Fraktionen nachgewiesen
werden (Arcaro et al., 1998). Obwohl gezeigt werden konnte, dass sowohl Insulin
und verschiedene Wachstumsfaktoren als auch das Chemokin MCP-1 (moncyte chemotactic
peptide 1) die Aktivität von Klasse II PI-3-Kinasen stimulieren können, sind die
Mechanismen dieser Aktivierung und die zellulären Funktionen dieser PI-3-Kinase-Familie
ungeklärt (Turner et al., 1998, Brown et al., 1999, Arcaro et al., 2000).
Der Prototyp der Klasse III PI-3-Kinasen, das Protein Vps34p, wurde zuerst in
Saccharomyces cerevisiae identifiziert (Schu et al., 1993). Ein homologes Protein konnte
auch in Säugern nachgewiesen werden (Volinia et al., 1995). Die katalytische Untereinheit
der Klasse III PI-3-Kinasen ist mit einer Serin/Threonin-Proteinkinase, Vps15p bzw. p150,
assoziiert, die für die Membran-Assoziation von Klasse III PI-3-Kinasen wichtig ist
(Panaretou et al., 1997). Vertreter der Klasse III PI-3-Kinasen phosphorylieren ausschließlich
PI und spielen eine Rolle bei intrazellulären Transportprozessen und der Phagosomen-
Reifung (Wurmser et al., 1999, Vieira et al., 2001).
1.3.2 Struktur und Regulation von Klasse I PI-3-Kinasen
Alle Klasse I PI-3-Kinasen weisen gemeinsame Strukturmerkmale auf (siehe Tab. 4). Dazu
gehören die katalytische Domäne, die sog. PIK-Domäne, die C2-Domäne sowie die Ras-
Bindungsdomäne (Zvelebil et al., 1996). Anhand der Kristallstruktur der katalytischen p110?-
Untereinheit konnte gezeigt werden, dass die Teilstrukturen des Enzyms um die als Rückgrat
dienende helikale bzw. PIK-Domäne angeordnet sind (Walker et al., 1999, Abb. 2).
Am höchsten konserviert ist die katalytische Domäne der PI-3-Kinasen, die auch als
Homologie-Region 1 bezeichnet wird. Im Fall der p110?-Untereinheit besteht sie aus einem
kleineren N-terminalen Bereich, der die Aminosäuren 726-883 umfaßt, sowie aus einem
größeren C-terminalen Bereich (Aminosäuren 884-1092). Obwohl die Sequenz-Homologie
der PI-3-Kinasen zu den Proteinkinasen gering ist, weist die katalytische Domäne der PI-3-
Kinasen Strukturmerkmale auf, wie sie auch in Proteinkinasen zu finden sind (Taylor et al.,
1993, Hunter, 1995, Zvelebil et al., 1996). So entspricht ein mit der Sequenz 946DRHNDN951
der p110?-Untereinheit korrespondierendes Motiv der Subdomäne VIB der Proteinkinasen.
Der zu Asp946 homologe Rest dient in Proteinkinasen als Base, die die Hydroxyl-Gruppe des
Substrats deprotoniert und damit ein Nucleophil generiert, das den ?-Phosphat-Rest des ATP
angreift. Aufgrund der Kristallstruktur der p110?-Untereinheit muß geschlossen werden, daß
Asp946 zu dieser Interaktion jedoch nicht in der Lage ist. Daher wird angenommen, dass
entweder eine andere Aminosäure die Funktion der Base übernimmt oder aber ein in erster
Einleitung 12
Linie dissoziativer Mechanismus, der einen Metaphosphat-Übergangszustand einschließt, bei
der enzymatischen Aktivität der PI-3-Kinasen eine Rolle spielt (Walker et al., 1999).
Abb. 2: Struktur der katalytischen p110?-Untereinheit
Die katalytische Domäne, die C2-Domäne sowie die Ras-Bindungsdomäne sind um die als Rückgrat dienende
helikale Domäne angeordnet (aus Walker et al., 1999).
Ein zweites Motiv mit der Sequenz 964DFG966 der p110?-Untereinheit ist ebenfalls in der
Subdomäne VII der Proteinkinasen zu finden. Der entsprechende Asparaginsäure-Rest der
Proteinkinasen cheliert Mg2+-Ionen und bestimmt die Positionierung des ?-Phosphat-Restes
des ATP mit (Hiles et al., 1992). Auch für die p110?-Untereinheit konnten zwei Metall-
Bindungsstellen postuliert werden, neben Asp964 werden Asn951 sowie Asp836 als
Bindungspartner diskutiert (Walker et al., 1999). Auffallend ist, dass bei den PI-3-Kinasen
das in Proteinkinasen vorhandene Glycin-reiche GXGXXG-Motiv fehlt, das für die
Koordination des ?-Phosphat-Restes des ATP verantwortlich ist. Stattdessen interagiert
Ser806 der p110?-Untereinheit mit dem ?-Phosphat-Rest des ATP, während Lys833 in
Wechselwirkung mit dem ?-Phosphat-Rest des ATP tritt. Lys833 ist auch der Angriffsort des
aus Penicillium wortmanni gewonnenen PI-3-Kinase-Inhibitors Wortmannin, der kovalent an
diesen in allen Klasse I PI-3-Kinasen konservierten Lysin-Rest bindet (Walker et al., 2000).
Durch Interaktion des Lysin-Restes mit dem Furanring des Wortmannins kommt es zur Ringöffnung
unter Bildung eines Enamins, das im tautomeren Gleichgewicht zu einer Schiff’schen
Base steht. Das führt zur Hemmung der katalytischen Aktivität der PI-3-Kinasen (Arcaro und
Wymann, 1993, Thelen et al., 1994, Wymann et al., 1996, Stoyanova et al., 1997). Weiterhin
konnte durch Mutation von Klasse I PI-3-Kinasen gezeigt werden, dass die beiden zu den
Proteinkinasen homologen Sequenzmotive sowie der Wortmannin-bindende Lysin-Rest in
Einleitung 13
den Phosphat-Transfer involviert sind (Dhand et al., 1994, Wymann et al., 1996). Im
C-terminalen Bereich der katalytischen Domäne von Klasse I PI-3-Kinasen findet sich ein
Sequenzmotiv (Aminosäuren 964-988 der p110?-Untereinheit), das der Aktivierungsschleife
der Proteinkinasen entspricht und für die Substratspezifität der PI-3-Kinasen verantwortlich
ist (Bondeva et al., 1998, Pirola et al., 2001). Walker und Mitarbeiter (1999) postulierten
aufgrund der Kristallstruktur der p110?-Untereinheit, dass die Aktivierungsschleife, die
katalytische Schleife sowie die C-terminale k?12-Helix des Enzyms eine Tasche bilden, die
bei der Bindung der Kopfgruppe des Phosphoinositids eine Rolle spielt.
Die sog. PIK-Domäne bzw. Homologie-Region 2 wurde zuerst in PI-4-Kinasen
gefunden und ist in allen funktionellen Lipidkinasen konserviert (Flanagan et al., 1993). Bei
der p110?-Untereinheit umfasst diese Domäne die Aminosäuren 545-725. Die Funktion der
PIK-Domäne konnte bisher nicht bestimmt werden, obwohl gezeigt wurde, dass durch
Deletion der Domäne die Lipidkinase-Aktivität von PI-3-Kinasen verloren geht (Molendijk
und Irvine, 1998). Möglicherweise ist die PIK-Domäne für die Interaktion mit anderen
Proteinen verantwortlich.
Ein weiteres Strukturmotiv der PI-3-Kinasen ist die C2-Domäne bzw. Homologie-
Region 3, die die Aminosäuren 357-522 der p110?-Untereinheit umfasst. Die Faltung der
Domäne entspricht der Typ II C2-Domäne der Phospholipase C-?1 (Essen et al., 1997).
C2-Domänen sind häufig in die Ca2+-abhängige oder Ca2+-unabhängige Bindung von
Proteinen an Phospholipid-Membranen involviert. So konnte für die isolierte C2-Domäne der
p110?-Untereinheit eine Ca2+-unabhängige Interaktion mit Phospholipid-Vesikeln gezeigt
werden (Walker et al., 1999).
Die Ras-Bindungsdomäne (Aminosäuren 220-311 der p110?-Untereinheit) findet sich
nur in Klasse I PI-3-Kinasen und zeigt die gleiche Faltung wie die Ras-Bindungsdomänen der
Ras-Effektoren Raf und RalGDS (Nassar et al., 1995, Huang et al., 1998, Pacold et al., 2000).
Der Kontakt der Ras-Bindungsdomäne zur katalytischen Domäne erfolgt in erster Linie im
N-terminalen Bereich und in geringerem Ausmaß im C-terminalen Bereich der katalytischen
Domäne. Die Strukturanalyse eines p110?-H-Ras-Kristalls zeigte interessanterweise, dass die
p110?-Untereinheit mit zwei Regionen von Ras interagiert, die als „switch I“ und „switch II“
bezeichnet werden. Dieser Kontakt wird sowohl über die Ras-Bindungsdomäne als auch über
die katalytische Domäne der p110?-Untereinheit vermittelt (Pacold et al., 2000). Es sind zwei
mögliche Mechanismen der Ras-Aktivierung von PI-3-Kinasen denkbar. Zum einen könnte
durch Membran-Translokation der PI-3-Kinase durch Ras die enzymatische Aktivität der PI-
3-Kinase erhöht werden. Andererseits könnte eine allosterische Wirkung auf die katalytische
Domäne durch Ras-Bindung erfolgen (Walker et al., 1999, Pacold et al., 2000). Die
physiologische Bedeutung der Interaktion von Ras und Klasse I PI-3-Kinasen ist jedoch noch
weitgehend unklar (Rubio et al., 1999, Vanhaesebroeck und Waterfield, 1999).
Drei der vier Klasse I PI-3-Kinasen besitzen als weiteres Strukturmerkmal eine sog.
p85-Bindungsdomäne, über die sie mit einem 50-85 kDa schweren Adaptorprotein konstitutiv
Einleitung 14
assoziieren. Aufgrund dieses strukturellen Merkmals werden die PI-3-Kinase-Isoformen ?, ?
und ??zur Klasse IA der PI-3-Kinasen zusammengefasst. Im Gegensatz hierzu besitzt die
katalytische p110?-Untereinheit keine p85-Bindungsdomäne und assoziiert stattdessen mit
einem 101 kDa schweren regulatorischen Protein, das als p101 bezeichnet wird und keine
Homologie zu bekannten Proteinen zeigt (Stephens et al., 1997). Damit bildet die PI-3-
Kinase ??als bisher einziges Mitglied die Klasse IB der PI-3-Kinasen.
Die Aktivierung von Klasse I PI-3-Kinasen schließt die Translokation des Enzyms an
Phospholipid-Membranen ein, wodurch die PI-3-Kinase in die Nähe ihres Substrats, in erster
Linie PI-4,5-P2, gelangt. Dies kann sowohl über die Stimulation von Rezeptor-Tyrosin-
Kinasen (RTK) als auch über die Aktivierung G-Protein-gekoppelter Rezeptoren erfolgen
(Abb. 3).
Abb. 3: Rezeptor-vermittelte Aktivierung von Klasse I PI-3-Kinasen
Klasse I PI-3-Kinasen können durch verschiedene Rezeptorklassen aktiviert werden. Die Isoformen ?, ??und ?
werden durch RTKs direkt aktiviert, wobei dies über die p85-Adaptor-Untereinheit vermittelt wird. Die
PI-3-Kinase ??kann zusätzlich durch G??-Dimere stimuliert werden, die an der katalytischen Untereinheit
angreifen. Wirken beide Signale gleichzeitig, führt dies zu einer synergistischen Aktivierung. Die PI-3-Kinase ?
zeigt nur eine Sensitivität gegenüber G??. Der Angriff erfolgt ebenfalls an der katalytischen Untereinheit, während
die p101-Untereinheit regulatorisch in die Aktivierung eingreift.
Klasse IA PI-3-Kinasen sind sensitiv gegenüber RTK und anderen Tyrosin-Kinasen, wobei
die Aktivierung der PI-3-Kinasen über die Adaptor-Untereinheit vermittelt wird. In Säugern
werden mindestens sieben verschiedene, 50-85 kDa schwere Adaptor-Untereinheiten
exprimiert (siehe Tab. 4), die von drei unterschiedlichen Genen kodiert werden und deren
Prototyp die p85-Untereinheit ist (Escobedo et al., 1991, Otsu et al., 1991, Hörsch und Kahn,
1999). Diese bestehen unter anderem aus zwei sog. SH2 (src homology 2)-Domänen, die
durch eine inter-SH2-Domäne verbunden sind, welche für die Bindung der Adaptor-
Einleitung 15
Untereinheit an die katalytische p110-Untereinheit verantwortlich ist. Die SH2-Domänen sind
in der Lage, spezifisch mit Proteinen zu interagieren, die über ein Tyrosin-phosphoryliertes
pYXXM-Motiv verfügen (Nolte et al., 1996, Breeze et al., 1996). Zusätzlich besitzen die
p85?- und p85?-Untereinheit eine SH3 (src homology 3)-Domäne, zwei Prolin-reiche
Domänen sowie eine BH (breakpoint cluster region homology)-Domäne, über die Wechselwirkungen
mit weiteren Proteinen vermittelt werden. Durch Stimulation von RTK erfolgt eine
Phosphorylierung von spezifischen Tyrosin-Resten innerhalb eines YXXM-Motivs in intrazellulären
Domänen des Rezeptors (z.B. bei Rezeptoren für Wachstumsfaktoren) oder eines
Rezeptor-Substrats (z.B. IRS-1/2 im Falle des Insulin-Rezeptors). Diese Tyrosin-phosphorylierten
Bereiche dienen als Bindungsstelle für die SH2-Domänen der p85-Untereinheit. Die
Aktivierung der PI-3-Kinase erfolgt nun wahrscheinlich über zwei verschiedene
Mechanismen. Einerseits wird durch die Rezeptor-Bindung der p85-Untereinheit eine Konformationsänderung
bewirkt, welche die vorherige Hemmung der katalytischen Untereinheit
durch p85 aufhebt (Yu et al., 1998a, b). Zum anderen gelangt die katalytische Untereinheit
durch die p85-vermittelte Assoziation mit dem aktivierten Rezeptor an die Membran und
somit in die Nähe ihres Substrats (Klippel et al., 1996).
Zusätzlich zur Aktivierung durch RTK konnte für die PI-3-Kinase ??eine direkte
Stimulation durch G??-Komplexe gezeigt werden (Kurosu et al., 1997, Maier et al., 1999).
Die G??-Stimulation der PI-3-Kinase ??erfolgt im Gegensatz zur RTK-Stimulation unabhängig
von der p85-Untereinheit (Maier et al., 1999, Macrez et al., 2001). Darüber hinaus
können Klasse IA PI-3-Kinasen auch durch nicht unmittelbar Rezeptor-abhängige
Mechanismen stimuliert werden. So kann die monomere GTPase Ras im GTP-gebundenen
Zustand die PI-3-Kinase ??durch direkte Interaktion mit der p110?-Untereinheit stimulieren
(Rodriguez-Viciana et al., 1994, 1996). Weiterhin führt die Interaktion der BH-Domäne der
p85-Untereinheit mit monomeren GTPasen der Rho-Familie, z.B. Rac und Cdc42, zur
Stimulation der Enzym-Aktivität von Klasse IA PI-3-Kinasen (Zheng et al., 1994, Tolias
et al., 1995).
In neutrophilen Granulozyten wurde nach Stimulation des G-Protein-gekoppelten
fMLP (N-formyl-Met-Leu-Phe)-Rezeptors die rasche und Pertussistoxin-sensitive Bildung
von PI-3,4,5-P3 beobachtet (Traynor-Kaplan et al., 1988). Hierfür ist die Klasse IB PI-3-
Kinase ??verantwortlich, deren katalytische p110?-Untereinheit von Stoyanov und
Mitarbeitern (1995) erstmals kloniert wurde. Die p110?-Untereinheit verfügt nicht über eine
p85-Bindungsdomäne sondern assoziiert mit der regulatorischen p101-Untereinheit (Stephens
et al., 1997). Die Aktivierung der PI-3-Kinase ??erfolgt durch verschiedene extrazelluläre
Stimuli, die an heptahelikale Rezeptoren binden. Vor allem Liganden Gi- und Gq-gekoppelter
Rezeptoren, wie z.B. muskarinerge Rezeptoren vom M1- und M2-Typ, scheinen eine
Stimulation der PI-3-Kinase ??zu bewirken (Murga et al., 1998). Dieser Effekt wird in erster
Linie über die freigesetzten G??-Komplexe vermittelt, während die Aktivierung der PI-3-
Kinase ??durch G?i-Untereinheiten - wenn überhaupt physiologisch relevant - gering ist
Einleitung 16
(Stoyanov et al., 1995, Leopoldt et al., 1998). Der Mechanismus der G??-vermittelten
Stimulation der PI-3-Kinase ??wurde zunächst kontrovers diskutiert. So betrachten Stephens
und Mitarbeiter (1997) die p101-Untereinheit als essentiell für die G??-Stimulation der PI-3-
Kinase ??(Krugmann et al., 1999). Andere Arbeitsgruppen fanden hingegen eine direkte
Aktivierung der p110?-Untereinheit durch G??-Komplexe (Stoyanov et al., 1995, Tang und
Downes, 1997, Leopoldt et al., 1998). Leopoldt und Mitarbeiter (1998) konnten durch
Deletionsstudien zeigen, dass G??-Komplexe sowohl an N-terminale als auch an C-terminale
Bereiche der p110?-Untereinheit binden können. Weiterhin wurde nachgewiesen, dass die
p101-Untereinheit die Substratselektivität der G??-stimulierten PI-3-Kinase ??für PI-4,5-P2
erhöht, während in Abwesenheit von G???kein Einfluß der p101-Untereinheit auf die
Substratselektivität beobachtet wurde (Maier et al., 1999, Pacold et al., 2000). Für die G??-
vermittelte Aktivierung der PI-3-Kinase ??ist sowohl ein allosterischer Effekt als auch die
bloße Membran-Translokation des Enzyms vorstellbar. Die zweite Annahme wird unterstützt
von dem Befund, dass eine überexprimierte, konstitutiv Membran-assoziierte p110?-Untereinheit
bereits enzymatisch aktiv ist (Bondeva et al., 1998).
In einer in vitro-Untersuchung unter Verwendung von Plasmamembranen neutrophiler
Granulozyten als Substrat konnte gezeigt werden, dass die monomere GTPase Ras im GTPgebundenen
Zustand die p110?-Untereinheit aktivieren kann (Pacold et al., 2000). Weiterhin
konnten Pacold und Mitarbeiter (2000) nach Transfektion in COS-7-Zellen eine PI-3-
Kinase ?-Aktivierung durch Ras nachweisen. Daneben wird auch eine Beeinflussung der Ras-
Aktivierung durch die PI-3-Kinase ??diskutiert (Rubio et al., 1999, Rubio und Wetzker, 2000).
1.3.3 Zelluläre Effekte der Lipidprodukte von Klasse I PI-3-Kinasen
Infolge der Aktivierung von Klasse I PI-3-Kinasen werden die Phosphoinositide PI-3,4,5-P3
und PI-3,4-P2, letzteres in erster Linie durch Abbau von PI-3,4,5-P3 mittels 5’-Inositol-Phosphatasen
wie SHIP (SH2 domain-containing inositol 5-phosphatase), gebildet (Woscholski
und Parker, 1997). Diese Lipidprodukte sind in der Lage, Effektoren wie z.B. Tyrosin-
Kinasen, Serin/Threonin-Kinasen, Guaninnukleotid-Austauschfaktoren und Phospholipasen
zu modulieren. Das führt zu vielfältigen zellulären Antworten, die u.a. eine Hemmung der
Apoptose, eine Förderung des Zellwachstums, die Steuerung cytoskelettaler Veränderungen
und der Zellmigration sowie die Vesikel-Bildung beeinhalten (Abb. 4).
Anhand von Studien an transgenen und Gen-deletierten sog. „Knockout“-Mäusen
können einige dieser Effekte bestimmten PI-3-Kinase-Isoformen zugeordnet werden. So führt
die Ausschaltung des p85?-Gens zu einer Beeinträchtigung der B-Zell-Entwicklung, einer
verringerten Antikörper-Produktion sowie weiteren Defekten, die dem Phänotyp der
immundefizienten Xid (X-linked immunodeficiency)-Mäuse gleichen (Fruman et al., 1999b,
2000, Suzuki et al., 1999, Terauchi et al., 1999). Nach Ausschaltung des in geringerer Menge
exprimierten p85?-Gens weisen die Tiere eine erhöhte Sensitivität gegenüber Insulin auf, sind
Einleitung 17
jedoch lebensfähig (Ueki et al., 2002). Nach Gen-Deletion der katalytischen p110?-
Untereinheit zeigen die Tiere starke proliferative Defekte, die eine embryonale Letalität
bewirken. Hingegen ist keine verstärkte Apoptose zu beobachten (Bi et al., 1999). Da die
entsprechenden Mäuse gleichzeitig eine massive Überexpression der p85-Untereinheit zeigen
und nicht ausgeschlossen werden kann, dass eine trunkierte p110?-Untereinheit mit
veränderten Eigenschaften exprimiert wird, bleibt unklar, ob der Phänotyp der Mäuse
ausschließlich auf die Deletion des p110?-Gens zurückzuführen ist. Ungeachtet dessen kann
aus den Befunden auf eine wichtige Rolle von Klasse IA PI-3-Kinasen bei der Regulation des
Zellwachstums und der Embryonalentwicklung geschlossen werden. Weiterhin konnte
gezeigt werden, dass die Expression einer konstitutiv aktiven bzw. dominant-negativen
p110?-Untereinheit in Herzmuskelzellen zu erhöhter bzw. verringerter Herzgröße führt, die
auf eine veränderte Größe der einzelnen Myozyten zurückzuführen ist, was die Rolle der PI-
3-Kinase ??bei Wachstumsprozessen unterstreicht (Shioi et al., 2000). Nach Ausschaltung des
Klasse IB p110?-Gens sind die Mäuse lebensfähig, weisen jedoch Defekte in der
Immunabwehr auf. So ist nach Stimulation mit Chemokinen eine verringerte Migration von
neutrophilen Granulozyten und Makrophagen zu beobachten. Weitere inflammatorische
Prozesse und die O2--Produktion sind gestört (Hirsch et al., 2000, Li et al., 2000, Sasaki et al.,
2000a). Sasaki und Mitarbeiter (2000b) beobachteten das Auftreten kolorektaler Karzinome
in p110?-/--Mäusen, was sich aber in den durch andere Strategien erzeugten p110?-/--Mäusen
nicht bestätigte (Barbier et al., 2001). Weiterhin sind die ADP-vermittelte Plättchen-
Aggregation und die Fibrinogenrezeptor-Aktivierung in p110?-/--Thrombozyten gehemmt,
was ein vermindertes Auftreten ADP-induzierter thromboembolischer Ereignisse in p110?-/--
Mäusen zur Folge hat. Hingegen bleiben die Thrombin-induzierte Plättchen-Aggregation und
die Blutungszeit unbeeinflusst (Hirsch et al., 2001).
Die Wechselwirkung der PI-3-Kinase-Lipidprodukte mit Effektoren erfolgt über PH
(pleckstrin homology)-Domänen, die eine Bindungsspezifität für PI-3,4-P2 und PI-3,4,5-P3
aufweisen (Fruman et al., 1999a, siehe Abb. 4). So ist nach einer Stimulation der PI-3,4-P2/
PI-3,4,5-P3–Bildung eine Translokation der PH-Domänen-haltigen Serin/Threonin-Kinase
PKB/Akt, eines zellulären Homologs des viralen Onkoproteins v-Akt, an die Cytoplasmamembran
zu beobachten. Dort erfolgt die weitere Aktivierung der PKB durch eine PDK1-
vermittelte Phosphorylierung an Threonin308 sowie eine Phosphorylierung an Serin473,
eventuell über einen Komplex aus PDK1 und PRK2 (PKC related kinase 2). PDK1
(phosphoinositide-dependent kinase1) weist ebenfalls eine PH-Domäne auf, die PI-3,4,5-P3
mit hoher Affinität bindet (Stokoe et al., 1997, Stephens et al., 1998). Durch PKBAktivierung
werden verschiedene Prozesse ausgelöst, die das Überleben der Zelle garantieren.
So erfolgen die Phosphorylierung und damit Inaktivierung der proapoptotischen Kinase Bad
(Bcl-2 antagonist, causing cell death) sowie von GSK3 (glycogen synthase kinase 3), was
eine erhöhte Glykogen- und Proteinsynthese zur Folge hat. Durch eNOS (endothelial nitric
Einleitung 18
oxide synthase)-Aktivierung wird die Bildung von NO induziert, was unter anderem einen
antiapoptotischen Effekt durch Caspase-Inaktivierung bewirkt (Dimmeler et al., 1999).
Abb. 4: Zelluläre Effekte der Lipidprodukte von Klasse I PI-3-Kinasen
PI-3,4-P2 und PI-3,4,5-P3 können an zahlreiche Effektoren binden und diese modulieren. Die Bindung erfolgt
dabei häufig über spezifische Phosphoinositid-Bindungsdomänen (PH). Die modulierten Effektoren können
ihrerseits entweder direkt oder über weitere Proteine bestimmte Zellantworten auslösen. Im einzelnen sind: PKB
(Proteinkinase B), PDK (phosphoinositide-dependent kinase), PKC (Proteinkinase C), Btk (bruton’s tyrosine
kinase), PLC (Phospholipase C), Vav (Guaninnukleotid-Austauschfaktor; Protoonkogen der Vav-Familie), Grp
(general receptor for phosphoinositides), Rac (monomere GTPase), Arf (ADP-ribosylation factor). (nach Rameh
und Cantley, 1999)
Durch PDK1 können weitere Serin/Threonin-Kinasen der AGC-Familie, z.B. PKC-Isoformen
und p70 S6-Kinasen, phosphoryliert und aktiviert werden, was ein proliferatives Signal für
die Zelle darstellt (Dutil et al., 1998, Williams et al., 2000). Auch Btk (Bruton’s tyrosine
kinase) und weitere Tyrosin-Kinasen der TEC-Familie binden über eine N-terminale PHDomäne
PI-3,4,5-P3, wodurch eine Translokation dieser Kinasen an die Cytoplasmamembran
eingeleitet wird. Dort erfolgt nach Assoziation mit Src-Kinasen eine Phosphorylierung und
damit Aktivierung. Btk ist in die Kontrolle der Aktivität von Phospholipase C-?-Isoformen
und somit in Ca2+- und PKC-Signalwege involviert (Scharenberg et al., 1998, Schaeffer und
Schwartzberg, 2000). Weitere PI-3,4,5-P3–vermittelte zelluläre Effekte wie cytoskelettale
Veränderungen und die Steuerung der Vesikel-Bildung werden durch die Aktivierung
monomerer GTPasen wie Rac, Rho und Arf ausgelöst (Reif et al., 1996, Arrieumerlou et al.,
1998). Hierbei erfolgt eine Wechselwirkung von PI-3,4,5-P3 mit PH-Domänen von
Guaninnukleotid-Austauschfaktoren (GEF). So konnte gezeigt werden, dass PI-3,4,5-P3 in
vitro PH-Domänen des Rac-GEF Vav1 bindet, was eine Verstärkung der Src-Kinasevermittelten
Aktivierung von Vav1 und eine nachfolgende Rac-Aktivierung bewirkte (Han
et al., 1998).
Einleitung 19
1.3.4 Proteinkinase-Aktivität von Klasse I PI-3-Kinasen
Neben ihrer Lipidkinase-Aktivität weisen Klasse I PI-3-Kinasen auch eine intrinsische Serin/
Threonin-Proteinkinase-Aktivität auf (Carpenter et al., 1993, Hunter, 1995). Für die PI-3-
Kinase ??konnte in vitro eine Mn2+-abhängige Autophosphorylierung der regulatorischen
p85-Untereinheit an Serin608 nachgewiesen werden, die eine Hemmung der durch RTK
stimulierten Lipidkinase-Aktivität zur Folge haben soll (Dhand et al., 1994). Im Gegensatz
hierzu erfolgt die Mn2+-abhängige in vitro-Autophosphorylierung der PI-3-Kinase ??an der
katalytischen p110?-Untereinheit an Serin1039, während die regulatorische p85-Untereinheit
nicht phosphoryliert werden soll (Vanhaesebroeck et al., 1997, 1999a). Die Autophosphorylierung
der PI-3-Kinase ??soll ebenfalls zur autoregulatorischen Hemmung der Stimulierbarkeit
ihrer Lipidkinase-Aktivität führen. Für die PI-3-Kinase ??wurde eine Mg2+-abhängige
Autophosphorylierung der katalytischen p110?-Untereinheit gezeigt, die jedoch nicht zur
Beeinflussung der Lipidkinase-Aktivität führen soll (Stoyanova et al., 1997, Maier et al.,
1999). Die zunächst überraschende Bifunktionalität der Klasse I PI-3-Kinasen als Lipid- und
Proteinkinasen wurde für weitere Vertreter der Phosphatidylinositol-Kinasen beschrieben. So
zeigen sowohl Klasse III PI-3-Kinasen als auch PI-4-Kinasen und Typ I Phosphatidylinositolphosphat-
Kinasen eine in vitro-Autophosphorylierung (Stack und Emr, 1994, Zhao
et al., 2000, Itoh et al., 2000). Hingegen besitzen Klasse II PI-3-Kinasen keine intrinsische
Proteinkinase-Aktivität. Weiterhin wird die TOR (target of rapamycin)-Familie, die ausschließlich
eine Serin/Threonin-Proteinkinase-Aktivität aufweist, aufgrund ihrer Homologie
zur Kinase-Domäne von PI-3-Kinasen auch als Klasse IV der PI-3-Kinasen bezeichnet
(Vanhaesebroeck und Waterfield, 1999). Neben TOR und FRAP (FKBP rapamycin-
associated protein) gehören eine DNA-abhängige Proteinkinase (DNA-PK) sowie ATM
(ataxia telangiectasia mutated) zu dieser Proteinkinase-Familie, die keine Lipidkinase-
Aktivität besitzt (Hartley et al., 1995). Schließlich wurde auch für die Phosphatase
PTEN/MMAC1 anhand ihrer Homologie zu Tyrosin-Phoshatasen eine duale Spezifität für
Lipid-und Proteinsubstrate postuliert (Li et al., 1997, Maehama und Dixon, 1998).
Zusätzlich zur Autophosphorylierung wurde für Klasse I PI-3-Kinasen auch die
Phosphorylierung exogener Substrate gezeigt. So konnte sowohl nach Stimulation von
Adipozyten mit Insulin als auch nach Behandlung lymphoider Zellen mit Interferon-??eine
PI-3-Kinase ?-abhängige Phosphorylierung von IRS-1 (insulin receptor substrate 1) nachgewiesen
werden (Lam et al., 1994, Tanti et al., 1994, Uddin et al., 1997). Weiterhin wurden
durch Austausch C-terminal des DFG-Motivs (siehe 1.3.2) gelegener basischer Motive der
p110?-Untereinheit durch die homologen Regionen von Klasse II bzw. Klasse III PI-3-
Kinasen p110?-Hybride erzeugt, die trotz Verlust der Fähigkeit zur Phosphorylierung von
PI-4,5-P2 eine erhöhte Phosphorylierung von IRS-1 zeigten (Pirola et al., 2001). Rondinone
und Mitarbeiter (2000) beschrieben nach Stimulation von Adipozyten mit Insulin auch eine
PI-3-Kinase-abhängige Phosphorylierung der Phosphodiesterase PDE3B. Schließlich gibt es
Einleitung 20
Hinweise, dass die Proteinkinase-Aktivität von Klasse I PI-3-kinasen auch in vivo eine Rolle
spielt. So konnten Vanhaesebroeck und Mitarbeiter (1999a) in Jurkat-T-Zellen eine
Wortmannin-sensitive Phosphorylierung der p110?-Untereinheit nachweisen, die durch CD28
stimulierbar war. Weiterhin scheint die Proteinkinase-Aktivität für die Beeinflussung des
MAPK-Signalwegs durch die PI-3-Kinase ??verantwortlich zu sein, da eine Lipidkinasedefiziente
p110?-Mutante keine Aktivierung von PKB/Akt (siehe 1.3.3), jedoch eine
Stimulation von ERK (extracellular signal-regulated kinase) bewirkte. Die Lipidkinasedefiziente
Mutante wurde hierbei durch Austausch der C-terminal des DFG-Motivs gelegenen
basischen Region durch eine homologe Region der Klasse IV PI-3-Kinase FRAP erzeugt
(Bondeva et al., 1998). Das direkte Substrat dieser Protein-Phosphorylierung ist nicht
bekannt. Da die Proteinkinase-Aktivität der einzelnen Klasse I PI-3-Kinase-Isoformen
Unterschiede zeigt, könnte diese Enzymqualität zur Isoform-Spezifität PI-3-Kinaseabhängiger
Signalwege beitragen.
Materialien
21
2 FRAGESTELLUNG
Klasse I PI-3-Kinasen sind bifunktionelle Enzyme, die neben der Lipidkinase- auch eine
Serin/Threonin-Proteinkinase-Aktivität besitzen. Für die Rezeptor-Tyrosinkinase-regulierten
PI-3-Kinase-Isoformen ??und ??wurde gezeigt, dass durch die Autophosphorylierung der
regulatorischen p85-Untereinheit an Serin608 (PI-3-Kinase ?) bzw. der katalytischen p110-
Untereinheit an Serin1039 (PI-3-Kinase ?) die Lipidkinase-Aktivität der Enzyme abgeschaltet
wird (Dhand et al., 1994, Vanhaesebroeck et al., 1999a). Vergleichbare Untersuchungen zu
den G??-sensitiven PI-3-Kinase-Isoformen ??und ?, die ebenfalls autophosphoryliert werden,
fehlen. Daher war es das Ziel der vorliegenden Arbeit, die Proteinkinase-Aktivität dieser PI-3-
Kinase-Isoformen biochemisch zu charakterisieren, die Phosphorylierungsstellen zu identifizieren
sowie mögliche funktionelle Konsequenzen zu beschreiben.
Materialien
22
3 MATERIALIEN
3.1 Hersteller und Lieferanten
(1) American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, USA
(2) Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg
(3) Biochrom, Berlin
(4) Bio-Rad, München
(5) BioVectra, Charlottetown, Canada
(6) Biozym Diagnostik, Hameln
(7) Calbiochem, Frankfurt/Main
(8) Difco, via Otto Norwald KG, Hamburg
(9) Gibco BRL, Eggenstein
(10) ICN Biomedicals, Aurora, USA
(11) Kodak, Rochester, USA
(12) Merck, Darmstadt
(13) Millipore, Eschborn
(14) New England Biolabs, Schwalbach
(15) NEN, Zaventem, Belgien
(16) Pierce, Rockford, USA
(17) Polaroid, Berlin
(18) Promega, Mannheim
(19) Qiagen, Hilden
(20) Raytest, Straubenhardt
(21) Roche Diagnostics, Mannheim
(22) Roth, Karlsruhe
(23) Santa Cruz, Heidelberg
(24) Schering, Berlin
(25) Serva, Heidelberg
(26) Sigma-Ark, Darmstadt
(27) Sigma, Deisenhofen
(28) Stratagene, Heidelberg
(29) Vydac, Hesperia, USA
(30) Whatman, Maidstone, UK
3.2 Chemikalien
Acetonitril (27)
Acrylamid (22),(25)
Adenosin-5’-triphosphat (ATP) (21)
Agar-Agar (10)
Agarose (6)
Ameisensäure (27)
Ammoniumhydrogencarbonat (27)
Ammoniumperoxodisulfat (4)
Pierce BCA Protein Assay (16)
Materialien
23
Bromcyan (27)
5-Bromo-3-indolyl-?-D-galactopyranosid (Bluo-Gal) (5)
Bromphenolblau (25)
Cellfectin (9)
Coomassie Brilliant Blue G-250 (18)
?-Cyano-4-hydroxyzimtsäure (27)
Cytochalasin B (27)
Cytochrom c (Typ III, aus Pferdeherz) (27)
N6,2’-O-Dibutyryl-3’:5’-adenosinmonophosphat (dbt-cAMP) (21)
Dimethylsulfoxid (DMSO) (12)
3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) (27)
Dinatriumhydrogenphosphat (12)
Dithiothreitol (DTT) (27)
ECL Western Blotting Detection System (2)
Essigsäure (12)
EDTA (25)
EGTA (25)
Ethidiumbromid (12)
Folin-Ciocalteau-Phenolreagenz (12)
FuGene 6 (21)
Glutathion (27)
Glycerin (12)
?-Glycerophosphat (27)
Glycin (25)
Guanosin-5’-diphosphat (GDP) (21)
Hefeextrakt (7)
HEPES (12),(27)
Imidazol (27)
Iodacetamid (27)
Isopropylthio-?-D-galactosid (IPTG) (22)
Kaliumdihydrogenphosphat (12)
Lithiumchlorid (27)
„low-melting“ Agarose (2)
Lubrol PX (27)
Magnesiumchlorid (27)
Manganchlorid (27)
2-Mercaptoethanol (27)
N, N’-Methylenbisacrylamid (Bisacrylamid) (22),(25)
Natriumcholat (27)
Natriumdodecylsulfat (SDS) (27)
Natriumfluorid (27)
Natriumorthovanadat (27)
Natriumpyrophosphat (27)
Ninhydrin (27)
Nonidet P40 (21)
Oligonukleotide (26)
Phosphatidylinositol (27)
Materialien
24
Phosphatidylinositol-4-phosphat (27)
Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (27)
L-?-Phosphatidylcholin (27)
L-?-Phosphatidylethanolamin (27)
L-?-Phosphatidylserin (27)
Ponceau S (12)
n-Propanol (22)
Pyridin (27)
Pyronin Y (27)
Rinderserum-Albumin (BSA) (27)
Roti-Block (22)
Sphingomyelin (27)
N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamid (TEMED) (4)
N-Tosyl-L-phenylalanin-chloromethylketon (TPCK) (27)
Trifluoressigsäure (27)
Tris (12),(25)
Triton X-100 (25),(27)
Trypton (7)
Tween 20 (27)
3.3 Enzyme, Proteine, Peptide und andere biologisch aktive
Substanzen
anti-p110?-Antikörper (23)
anti-p85-Antikörper (23)
AspN (21)
Benzamidin (27)
Chymotrypsin (21)
N-Formyl-methionyl-leucyl-phenylalanin (fMLP) (27)
GluC (21)
Leupeptin (27)
LY294002 (24)
LysC (21)
Meerrettichperoxidase gekoppelt an Anti-Kaninchen-IgG (27)
Meerrettichperoxidase gekoppelt an Anti-Maus-IgG (27)
20-Methylwortmannin (24)
Pefabloc SC (21)
Pertussistoxin (aus Bordetella pertussis) (7)
PfuTurbo-DNA-Polymerase (28)
phosphoryliertes PDGFR-Peptid (CGGY(P)MDMSKDESVDY(P)VPMLDM) (24)
Restriktionsendonukleasen (14)
T4-DNA-Ligase (18)
Trypsin (21)
Trypsin-Inhibitor (21)
Wortmannin (24)
Materialien
25
Die C-terminalen Peptide der p110?- und p110?-Untereinheit wurden freundlicherweise von
Dr. Michael Beyermann (Forschungsinstitut für Molekulare Pharmakologie, Berlin) zur
Verfügung gestellt.
3.4 Radioaktiv markierte Substanzen
[?-32P]ATP (15)
32P-Phosphorsäure (15)
3.5 Zellen
DH10Bac kompetente E. coli-Zellen (9)
Epicurian Coli XL1-Blue kompetente E. coli-Zellen (28)
HEK293 / humane embryonale Nieren-Zellen (1)
HL-60 / humane Leukämie-Zellen (1)
Sf9 / Ovarialzellen von Spodoptera frugiperda (9)
Zellen zur Produktion der monoklonalen Antikörper gegen p110??wurden freundlicherweise
von Prof. Dr. R. Wetzker (Friedrich-Schiller-Universität, Jena) zur Verfügung gestellt.
3.6 Zellkulturmedien und Zusätze
Ampicillin (27)
Folsäure (27)
fötales Kälberserum (3),(9)
Gentamicin (10)
Glutamin (Konz.) (3)
Grace-Insektenmedium (9)
Kanamycin (27)
Lipid Medium Supplement (3)
MEM-Earle Medium (9)
nichtessentielle Aminosäuren (3)
Penicillin/Streptomycin (je 10 000 U/ml) (3)
RPMI-1640 Medium (3)
Tetracyclin (27)
TNM-FH Medium (27)
Trypsin/EDTA-Lösung (3)
3.7 Vektoren
pFastBacHTa (9)
Materialien
26
3.8 DNA- und Proteinstandards
1kb-DNA-Standard (9)
LMW Electrophoresis Calibration Kit (2)
3.9 Reinigungs- und Trennmaterialien
Dünnschichtplatten mit Kieselgel 60 (ohne Fluoreszenzindikator) (30)
Glutathion Sepharose 4B (2)
Ni2+-NTA-Agarose (19)
ProteinA-Sepharose CL-4B (2)
Qiagen Plasmid Purification Kit (19)
SourceQ 15 (2)
Tris-HCl Ready Gel (4)
Vydac C18-Säule 218 TP 5115 (29)
ZipTip C18 (13)
3.10 Membranen/Filter
Hybond C-extra (Nitrocellulose-Membran) (2)
Immobilon P (PVDF-Membran) (13)
Centrikon Ultrazentrifugationsröhrchen 10, 30 (13)
3.11 Filmmaterial
Röntgenfilm (CRT7, R, X-OMAT) (11)
Polaroid-Filmkassetten Nummer 553 (17)
Fuji-Imaging-Patten (20)
Alle hier nicht aufgeführten Substanzen wurden von den Firmen Merck (Darmstadt) bzw.
Sigma (Deisenhofen) im Reinheitsgrad pro analysi bezogen.
Verschiedene im Rahmen dieser Arbeit eingesetzte rekombinante Baculoviren erhielten wir
von Dr. T. Hanck, Magdeburg, Prof. Dr. M. Lohse, Würzburg, Dr. K. Spicher, Berlin, Dr. B.
Vanhaesebroeck, London, und Prof. Dr. R. Wetzker, Jena.
Methoden
27
4 METHODEN
4.1 Molekularbiologische Methoden
Im Rahmen dieser Arbeit eingesetzte molekularbiologische Standardmethoden sind in
folgenden Quellen ausführlich beschrieben.
Restriktionsanalyse Sambrook und Russell, 2001
Agarosegelelektrophorese Aaij und Borst, 1972
Herstellung kompetenter Zellen Inoue et al., 1990
Ligation von DNA-Fragmenten Sambrook und Russell, 2001
Transformation kompetenter E. coli-Zellen Cohen et al., 1972
Plasmidpräparation aus Bakterienzellen Sambrook und Russell, 2001; Qiagen, 1993
DNA-Sequenzierung Sanger et al., 1977; Amersham, 1994
Phenol-Chloroform-Extraktion von DNA Sambrook und Russell, 2001
PCR Sambrook und Russell, 2001
4.1.1 Medien für die Bakterienkultur
LB-Flüssigmedium pH 7,4 SOB-Flüssigmedium pH 7,0
Trypton 10 g/l Trypton 20 g/l
Hefeextrakt 5 g/l Hefeextrakt 5 g/l
NaCl 5 g/l NaCl 0,5 g/l
KCl 0,2 g/l
LB-Agarplatten SOC-Medium
Agar-Agar 1,5 % (w/v) nach Hitzesterilisation wurden zu 500 ml
in LB-Flüssigmedium SOB-Flüssigmedium zugesetzt:
5 ml 2 M MgCl2, steril, in H2O
10 ml 1 M Glucose, steril, in H2O
Den hitzesterilisierten Medien wurde Ampicillin in einer Endkonzentration von 100 µg/ml
zugesetzt.
Methoden
28
4.1.2 Herstellung des Baculovirus-Transferplasmids für die Hexahistidinmarkierte
p110 ?-Untereinheit
Das Expressionsplasmid p110?-pEYFP-C1 stellte freundlicherweise Carsten Brock aus
unserer Arbeitsgruppe zur Verfügung. Aufgrund ungünstiger Restriktionsschnittstellen wurde
folgende Klonierungsstrategie gewählt: Die für den C-terminalen Bereich der p110?-
Untereinheit kodierende Sequenz wurde mit den Restriktionsendonukleasen BstXI und SalI
aus dem pEYFP-C1-Vektor ausgeschnitten. Zur Erzeugung der für den N-Terminus
kodierenden Sequenz bis zur BstXI-Schnittstelle wurde ein Adaptor verwendet, der aus den
Oligonukleotiden p110?Ada-for und p110?Ada-rev hybridisiert wurde und zusätzlich eine
NcoI-Schnittstelle enthielt. Beide DNA-Fragmente wurden über die NcoI- und die SalISchnittstelle
in den Baculovirus-Transfervektor pFastBacHTa eingefügt, der bereits eine die
Hexahistidin-Markierung kodierende Sequenz enthielt.
Tab. 5: Oligonukleotide zur Generierung des N-terminalen Adaptors
Primer Sequenz 5’-3’
p110?Ada-for CATGTGCTTCAGTTTCATAATGCCTCCTGCTATGGCAGAC
ATCCTTGACATCTGGGCGGTGGATTCACAGATAGCATCTG
ATGGCTCCATACCT
p110?Ada-rev ATGGAGCCATCAGATGCTATCTGTGAATCCACCGCCCAGA
TGTCAAGGATGTCTGCCATAGCAGGAGGCATTATGAAACT
GAAGCA
4.1.3 Ortsgerichtete Mutagenese
Das Einfügen von Mutationen in die katalytischen Untereinheiten der PI-3-Kinasen erfolgte
durch ortsgerichtete Mutagenese. Als Matrize für die Mutations-PCR dienten Baculovirus-
Transferplasmide, welche die Sequenz für die Hexahistidin-markierte p110?-Untereinheit
(4.1.2) bzw. p110?-Untereinheit enthielten. Das letztgenannte Plasmid wurde freundlicherweise
von Andreas Schulz aus unserer Arbeitsgruppe zur Verfügung gestellt. Für die PCR
wurden zwei die gewünschte Mutation enthaltende, komplementäre Primer verwendet. Die
Verlängerung dieser Primer erfolgte mit Hilfe der aus Pyrococcus furiosus klonierten DNAPolymerase
PfuTurbo, welche eine hohe Präzision der DNA-Synthese gewährleistete. Da das
die Mutation enthaltende PCR-Produkt im Gegensatz zur parentalen DNA nicht methyliert
war, konnte im Anschluß an die PCR mit der Methylierungs-spezifischen Restriktionsendonuklease
DpnI das Ausgangsplasmid abgebaut werden.
Methoden
29
Tab. 6: Mutationsprimer
Primer Sequenz 5’-3’
p110?Ala-for GGAAAGACTACAGAGCTTAAGCTGCAGTCG
p110?Ala-rev CGACTGCAGCTTAAGCTCTGTAGTCTTTCC
p110?Asp-for GGAAAGACTACAGAGATTAAGCTGCAGTCG
p110?Asp-rev CGACTGCAGCTTAATCTCTGTAGTCTTTCC
p110?Glu-for GGAAAGACTACAGAGAGTAAGCTGCAGTCG
p110?Glu-rev CGACTGCAGCTTACTCTCTGTAGTCTTTCC
p110?Ala-for GGCATCAAACAAGGAGAGAAACATGCAGCCTAATACTTTAGG
CTAGAATC
p110?Ala-rev GATTCTAGCCTAAAGTATTAGGCTGCATGTTTCTCTCCTTGT
TTGATGCC
p110?Asp-for GGCATCAAACAAGGAGAGAAACATGACGCCTAATACTTTAGG
CTAGAATC
p110?Asp-rev GATTCTAGCCTAAAGTATTAGGCGTCATGTTTCTCTCCTTGT
TTGATGCC
p110?Glu-for GGCATCAAACAAGGAGAGAAACATGAAGCCTAATACTTTAGG
CTAGAATC
p110?Glu-rev GATTCTAGCCTAAAGTATTAGGCTTCATGTTTCTCTCCTTGT
TTGATGCC
Fett markierte Buchstaben in der Primersequenz stellen die eingeführten Mutationen dar.
4.2 Expression rekombinanter Proteine in Insektenzellen
Eine der am häufigsten verwendeten Insektenzellinien zur Expression rekombinanter Säuger-
Proteine sind Sf9-Zellen. Dabei handelt es sich um Ovarienzellen von Spodoptera frugiperda.
Für die Expression rekombinanter Proteine werden diese Zellen mit lytischen Baculoviren
wie dem AcNPV (Autographa californica nuclear polyhedrosis virus) infiziert. Dies sind
doppelsträngige zirkuläre DNA-Viren, die bevorzugt Insektenzellen befallen.
Da das Baculovirus-Genom sehr groß ist (AcNPV: ca. 130 kb) und Restriktionsendonukleasen
Mehrfachschnittstellen aufweisen, werden rekombinante Baculoviren in Mehrschritt-
Verfahren konstruiert. Bei der hier verwendeten Methode wird das zu exprimierende
Gen zunächst in einen Baculovirus-Transfervektor innerhalb eines mini-Tn7-Elements hinter
einen Baculovirus-Promotor, üblicherweise den Polyhedrin-Promotor, eingefügt (4.1 und
Abb. 5).
Methoden
30
pFastBac
Gentamicin-
Resistenz
Ampicillin-
Resistenz
Ori
Tn7R
Tn7L
SV40
poly A
MCS
Abb. 5: Der Baculovirus-Transfervektor pFastBac
Das mini-Tn7-Element enthält eine Expressionskassette, die aus einem Gentamicin-Resistenzgen, dem
Baculovirus-spezifischen Polyhedrin-Promotor, einem multiplen Klonierungsbereich und dem SV40-poly(A)-Signal
besteht. Weiterhin weist der pFastBac-Vektor ein Ampicillin-Resistenzgen auf. Der Replikationsstartpunkt („origin
of replication“, Ori) erlaubt die Vermehrung des klonierten Plasmids in E. coli-Zellen.
Dann erfolgt eine ortsspezifische Transposition in das Baculovirus-Genom (Bacmid), welches
in E. coli-Zellen vermehrbar ist. Das Bacmid enthält unter anderem einen Kanamycin-
Resistenz-Marker sowie ein DNA-Segment, das für das lacZ?-Peptid kodiert. Im N-terminalen
Bereich des lacZ?-Gens ist ein kurzes Segment eingefügt, welches eine Bindungsregion
für das bakterielle Transposon Tn7 (mini-attTn7) aufweist. Rekombinante Viren entstehen
nun durch Transposition des mini-Tn7-Elements aus dem Baculovirus-Transferplasmid in die
mini-attTn7-Bindungsregion des Bacmids unter Zuhilfenahme eines Helferplasmids, welches
für eine Transposase kodiert und eine Tetracyclin-Resistenz enthält. Ist das mini-Tn7-Element
in die mini-attTn7-Bindungsregion des Bacmids eingebaut, kann keine Expression des lacZ?-
Peptids erfolgen. Somit bleiben E. coli-Kolonien, die das rekombinante Bacmid enthalten, in
Gegenwart eines chromogenen Substrats (z.B. Bluo-Gal) und des Induktors IPTG weiß,
während Kolonien mit dem unveränderten Bacmid blau erscheinen. Aus ausgewählten
Kolonien erfolgt die Isolation rekombinanter Bacmid-DNA, welche zur Transfektion von Sf9-
Zellen verwendet wird.
Der Vorteil der Expression von Proteinen in Sf9-Zellen gegenüber Bakterienzellen ist
die korrekte posttranslationale Prozessierung und Faltung der exprimierten Proteine, was für
Funktionsuntersuchen von Säugerproteinen wichtig ist. Gegenüber Säuger-Transfektions-
Systemen haben Sf9-Zellen den Vorzug, daß man in ihnen leicht auch präparative Mengen an
rekombinanten Proteinen exprimieren kann, da sie Verdopplungszeiten von weniger als einem
Tag aufweisen und darüber hinaus große Volumina in Suspension kultiviert werden können.
Die hier beschriebene Expression rekombinanter Proteine in Insektenzellen wurde in
Anlehnung an Methoden der Laborhandbücher von King und Possee (1992) bzw. O’Reilly
und Mitarbeiter (1992) durchgeführt.
Methoden
31
4.2.1 Transposition und Isolation rekombinanter Bacmid-DNA
Kompetente DH10Bac-Zellen (100 µl) wurden auf Eis aufgetaut, mit etwa 1 ng Baculovirus-
Transferplasmid gemischt und 30 min auf Eis inkubiert. Anschließend wurde der Ansatz für
45 s auf 42 °C erwärmt. Nach dem Abkühlen erfolgten die Zugabe von 900 µl SOC-Medium
und eine vierstündige Inkubation bei 37 °C unter Schütteln. Verschiedene Mengen des Transpositionsansatzes
wurden auf LB-Agarplatten mit Zusatz von 7 µg/ml Gentamicin, 50 µg/ml
Kanamycin, 10 µg/ml Tetracyclin, 100 µg/ml Bluo-Gal und 40 µg/ml IPTG ausgestrichen und
24 h bei 37 °C im Brutschrank inkubiert. Weiße Kolonien wurden zur Bestätigung ihres
Phänotyps erneut auf Agarplatten ausgestrichen und über Nacht bei 37 °C inkubiert. 3 ml LBMedium
(mit 7 µg/ml Gentamicin, 50 µg/ml Kanamycin und 10 µg/ml Tetracyclin) wurden
mit einer Einzelkolonie angeimpft und über Nacht bei 37 °C geschüttelt. Nach Zentrifugation
der Bakteriensuspension bei 14.000 x g für 5 min wurde der Überstand entfernt und das
Bakteriensediment in 300 µl Resuspensionspuffer (15 mM Tris/HCl, pH 8,0, 10 mM EDTA,
100 µg/ml RNase A) aufgenommen. Nach Zugabe von 300 µl Lysispuffer (0,2 N NaOH, 1 %
SDS) erfolgte eine fünfminütige Inkubation bei Raumtemperatur. Anschließend wurden
300 µl Neutralisationspuffer (3 M K-Acetat, pH 5,5) zugegeben. Nach zehnminütiger
Inkubation auf Eis wurde die Probe für 15 min bei 14.000 x g zentrifugiert. Der Überstand
wurde in ein mit 800 µl Isopropanol gefülltes Eppendorfgefäß überführt, gemischt und 10 min
auf Eis inkubiert. Nach 15minütiger Zentrifugation bei 14.000 x g wurde der Überstand
entfernt, die präzipitierte Bacmid-DNA mit 70 %igem Ethanol gewaschen und für 5 min bei
14.000 x g zentrifugiert. Nach Entfernen des Überstands wurde die DNA in 50 µl H2O gelöst
und konnte bei 4 °C gelagert werden.
4.2.2 Kultivierung von Sf9-Zellen
Sf9-Zellen wurden sowohl adhärent als auch in Suspension bei 27 °C ohne CO2-Begasung
kultiviert. Für die adhärente Aufzucht in Zellkulturschalen (175 cm2) wurde TNM-FHMedium
mit 10 % fötalem Kälberserum und 1 % Antibiotika-Zusätzen (Penicillin/Streptomycin)
verwendet. Die Zellen in Suspensionskultur wurden im gleichen Medium gehalten,
das jedoch mit 1 % Lipid Medium Supplement ergänzt wurde, um die Zellmembranen gegen
die Scherkräfte in der Schüttelkultur zu schützen.
Zellen in adhärenter Kultur wurden abhängig von der Zelldichte alle zwei bis drei
Tage im Verhältnis 1:2 bis 1:4 umgesetzt. Schüttelkulturen wurden in einer Zelldichte von
0,5 x 106 Zellen/ml angesetzt und durch regelmäßiges Verdünnen mit frischem Medium bis
zu einer Zelldichte von 2,5 x 106 Zellen/ml gehalten. Unter diesen Bedingungen sollte sich
die Zahl der Sf9-Zellen innerhalb von 18-24 Stunden verdoppeln.
Methoden
32
4.2.3 Transfektion von Sf9-Zellen mit rekombinanter Bacmid-DNA
Es wurden 0,9 x 105 Zellen in Zellkulturschalen (10 cm2) ausgesetzt und eine Stunde
inkubiert, damit die Zellen adhärieren konnten. Inzwischen wurden für jeden Transfektionsansatz
5 µl Bacmid-DNA in 100 µl Grace-Insektenmedium (ohne Antibiotikazusatz) sowie
5 µl Cellfectin in 100 µl Grace-Insektenmedium gelöst. Nach dem Mischen beider Lösungen
erfolgte eine 30minütige Inkubation bei Raumtemperatur. Die adhärenten Zellen wurden mit
1 ml Grace-Insektenmedium gewaschen, mit dem Transfektionsgemisch sowie 800 µl Grace-
Insektenmedium überschichtet und für 5 h bei 27 °C inkubiert. Nach dem Ersetzen des Transfektionsgemisches
durch 2 ml Medium mit Antibiotikazusätzen folgte eine Inkubation bei
27 °C für 72 h. Der virushaltige Überstand wurde abgenommen, zur Abtrennung von Zelltrümmern
für 5 min bei 500 x g zentrifugiert und in ein steriles Eppendorfgefäß überführt.
Üblicherweise wies dieser Virusurstock einen Titer von 2-4 x 107 pfu/ml auf (4.2.5) und
konnte bei 4 °C unter Lichtschutz aufbewahrt werden.
Zur Identifizierung rekombinanter Baculoviren wurde eine Zellrasenanalyse durchgeführt.
Dazu wurden die Zellen nach dem Abnehmen des virushaltigen Überstands in 400 µl
Probenpuffer nach Lämmli (4.7.2) resuspendiert und eine Probe gelelektrophoretisch
aufgetrennt (4.7.2). Als Negativkontrolle dienten nicht-transfizierte Sf9-Zellen. Durch
Immunoblot-Analyse (4.7.4) mit spezifischen Antiseren konnten rekombinante Proteine in
den Zellhomogenaten nachgewiesen werden. Die rekombinanten Viren wurden durch
Schüttelamplifikation vermehrt.
4.2.4 Amplifikation rekombinanter Viren
Für die Amplifikation rekombinanter Viren wurden Sf9-Zellen in einer Dichte von
1,5 x 106 Zellen/ml mit entsprechenden rekombinanten Baculoviren (MOI = 0,1) versetzt und
48 h inkubiert. Anschließend wurden Zellen und Zellfragmente bei 7500 x g (4 °C, 20 min)
abzentrifugiert. Der virushaltige Überstand diente nach Titerbestimmung zur Infektion von
Sf9-Zellen für die Gewinnung rekombinanter Proteine.
4.2.5 Titerbestimmung von Viruslösungen
Es wurden 2 x 106 Zellen in Zellkulturschalen (10 cm2) ausgesetzt und 1 h bis zur Adhärenz
inkubiert. In der Zwischenzeit wurden Verdünnungen (10-3-10-8) der virushaltigen Überstände
(4.2.4) hergestellt. Nachdem nicht-adhärente Zellen abgesaugt waren, wurden die
adhärenten Zellen mit 1 ml der jeweiligen Virusverdünnung überschichtet und eine Stunde bei
27 °C inkubiert. Eine sterile Agarose-Lösung mit niedrigem Schmelzpunkt (2,5 % (w/v)
“low-melting agarose” in Wasser) wurde durch Erwärmen verflüssigt und nach Temperieren
auf 37 °C mit Medium im Verhältnis 1:2 gemischt. Der virushaltige Überstand wurde abge-
Methoden
33
saugt und die Zellen mit 2 ml der Agarose/Medium-Mischung überschichtet. Um ein
Austrocknen während der folgenden vier- bis zehntägigen Inkubationszeit bei 27 °C zu
verhindern, wurden die Ansätze mit 2 ml Medium überschichtet. Während dieser Zeit
vermehrten sich die Viren und bildeten - im Falle einer ausreichend großen Verdünnung des
Virusüberstandes - gegeneinander abgrenzbare Plaques, die nach dem Anfärben mit MTT
sichtbar waren. Diese Plaques wurden nun für die Bestimmung des Virustiters herangezogen.
Dieser wird als “plaque forming units” (pfu/ml) angegeben und entspricht der Konzentration
der Viren in der entsprechenden Lösung. Er berechnet sich wie folgt:
Anzahl der Plaques x Verdünnungsfaktor
pfu/ml =
eingesetztes Volumen der Virusverdünnung (ml)
Durch Kenntnis des Titers war es möglich, die Infektion der Sf9-Zellen in einem bestimmten
Virus/Zell-Verhältnis, der “multiplicity of infection” (MOI) durchzuführen.
4.2.6 Infektion von Sf9-Zellen
Zur Gewinnung präparativer Mengen rekombinanter Proteine wurden Sf9-Zellen in Schüttelkultur
bei einer Dichte von 1,5 x 106 Zellen/ml mit den berechneten Virusmengen infiziert.
Bei Koinfektionen von mehreren G-Protein- bzw. PI-3-Kinase-Untereinheiten wurde jeder
einzelne Virus mit einer MOI von 1,0 - 5,0 zugegeben. Nach einer für das jeweilige Protein
optimierten Infektionszeit (36-60 h) wurden die Zellen abzentrifugiert und mit eiskaltem PBS
(12 mM Na2HPO4, 4 mM KH2PO4, 120 mM NaCl, pH 7,4) gewaschen. Die so erhaltenen
Zellsedimente wurden entweder sofort weiter verarbeitet oder in flüssigem Stickstoff
schockgefroren und bis zur Verwendung bei -70 °C gelagert.
4.3 Säugerzellkultur und transiente Transfektion
4.3.1 HL-60-Zellkultur
Für die Kultur von HL-60-Zellen bei 37 °C und 7 % CO2 wurde RPMI-1640 Medium mit
10 % fötalem Kälberserum, 1 % nichtessentiellen Aminosäuren, 2 mM L-Glutamin, 40 µg/ml
Folsäure, 100 U/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin verwendet. Alle 2-3 Tage wurden
die Zellen durch Zugabe von frischem Medium auf eine Dichte von 0,5 x 106 Zellen/ml
verdünnt. Unter diesen Bedingungen sollte sich die Zahl der HL-60-Zellen innerhalb von 24-
36 Stunden verdoppeln. Zur Differenzierung in Richtung Granulozyt wurden die HL-60-
Zellen in einer Dichte von 1,0 x 106 Zellen/ml mit 0,2 mM dbt-cAMP versetzt (Chaplinski
und Niedel, 1982) und für 48 h kultiviert. Die Behandlung der HL-60-Zellen mit Pertussis-
Methoden
34
toxin erfolgte für 24 h bei einer Toxinkonzentration von 200 ng/ml (Wenzel-Seifert und
Seifert, 1990). Zur Markierung mit 32P-Phosphat wurden differenzierte HL-60-Zellen durch
Zentrifugation vom Medium abgetrennt, in 1 ml Markierungspuffer (2,7 mM HEPES, pH 7,4,
137 mM NaCl, 1 mM MgCl2) aufgenommen und für 2 h bei 37 °C mit 1 mCi 32P-Phosphat
inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mit Markierungspuffer gewaschen.
4.3.2 HEK293-Zellkultur und transiente Transfektion
HEK293-Zellen wurden in MEM-Earle Medium mit 10 % fötalem Kälberserum, 100 U/ml
Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin bei 37 °C und 5 % CO2 kultiviert und alle 3-4 Tage
nach Ablösen mit Trypsin/EDTA-Lösung im Verhältnis 1:10 mit Medium verdünnt und in
neue Zellkulturflaschen überführt. Zur transienten Expression von PI-3-Kinasen wurden die
HEK293-Zellen in 6 cm-Kulturschalen ausgesetzt und am nächsten Tag mit jeweils 4 µg
Plasmid-DNA transfiziert. Die Tranfektion erfolgte mittels des Transfektions-Reagenz
FuGene 6 (Roche) nach Angaben des Herstellers. Nach 48 h wurden die Zellen geerntet.
4.4 Bestimmung der O2--Produktion in HL-60-Zellen
Die Bestimmung der O2
--Produktion in dbt-cAMP-differenzierten HL-60-Zellen wurde nach
der von Markert und Mitarbeitern (1984) beschriebenen Methode durchgeführt. Dabei wird
Ferricytochrom c durch O2
- zu Ferrocytochrom c reduziert, das monochromatisches Licht bei
550 nm absorbiert. Anhand der gemessenen Absorptionszunahme bei 550 nm kann die O2
--
Bildung quantifiziert werden.
Differenzierte HL-60-Zellen wurden durch zehnminütige Zentrifugation bei 250 x g
vom Medium abgetrennt und in einer Dichte von 2-4 x 107 Zellen/ml in O2
--Puffer (20 mM
HEPES, pH 7,4, 138 mM NaCl, 6 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM Na2HPO4, 5 mM NaHCO3,
5,5 mM Glucose) aufgenommen. Für Inhibitionsmessungen mit Wortmannin bzw. LY294002
wurden die Zellen für 30 min bei Raumtemperatur mit den Inhibitoren inkubiert. Zur
Messung der O2
--Produktion wurden 5 x 106 Zellen verwendet, die in einer Küvette mit
100 µM Cytochrom c, 1 mM CaCl2 und 1 µg/ml Cytochalasin B (zur Potenzierung der
rezeptorvermittelten O2
--Produktion, Jesaitis et al., 1986) in 1 ml O2
--Puffer gemischt
wurden. Nach einer dreiminütigen Präinkubation bei 37 °C erfolgte die Zugabe von fMLP.
Nun wurde die Zunahme der Absorption bei 550 nm (?A) im Doppelstrahlphotometer (Uvikon
810, Kontron, Eching) für 15 min gemessen, als Referenzwert diente die Absorption bei
550 nm vor Zugabe von fMLP. Zur Quantifizierung des gebildeten O2
- diente folgende
Formel:
O2
- (nmol) = 47,7 x ?A
Methoden
35
4.5 Reinigung rekombinanter Proteine
4.5.1 Präparation von Cytosol und Zellmembranen
Sf9-Zellsedimente (4.2.6) wurden in eiskaltem Bombenpuffer (50 mM HEPES, pH 8,0 (für
G??-Komplexe) bzw. 20 mM Tris/HCl, pH 8,0 (für PI-3-Kinasen) sowie 150 mM NaCl,
10 mM ?-ME, 0,2 mM Pefabloc SC, 50 µg/ml Benzamidin, 10 µg/ml Trypsin-Inhibitor,
10 µg/ml TPCK) resuspendiert und durch N2-Überdruck in einer Parr-Bombe (25 bar, 4 °C,
30 min) aufgeschlossen. Zur Abtrennung der Zellkerne wurde das so erhaltene Zellysat bei
800 x g für 2 min zentrifugiert, anschließend folgte ein Ultrazentrifugationsschritt
(100.000 x g, 4 °C, 40 min) zur Gewinnung von Zellmembranen und Cytosol. Das Membransediment
wurde in Waschpuffer (50 mM HEPES, pH 8,0, 50 mM NaCl, 10 mM ?-ME,
0,2 mM Pefabloc SC, 50 µg/ml Benzamidin, 10 µg/ml Trypsin-Inhibitor, 10 µg/ml TPCK)
resuspendiert.
4.5.2 Affinitätschromatographie
Rekombinante Proteine können mit bestimmten zusätzlichen Peptidmotiven, den Affinitätsmarkierungen,
versehen werden, die eine reversible Bindung an spezielle chromatographische
Medien (Affinitätsmatrix) und damit eine schnelle und effiziente Reinigung ermöglichen.
Hier wurden Hexahistidin-markierte und Glutathion-S-Transferase-(GST)-fusionierte rekombinante
Proteine verwendet.
4.5.2.1 Reinigung rekombinanter Hexahistidin-markierter G ?1 ?2-Komplexe
Die membranständigen Proteine wurden mit 0,5 % Natriumcholat solubilisiert. Der entstandene
Extrakt wurde durch Ultrazentrifugation (100.000 x g, 4 °C, 40 min) geklärt, in
Puffer A (20 mM HEPES, pH 8,0, 100 mM NaCl, 0,1 % Lubrol PX, 20 mM Imidazol, 10 mM
?-ME) auf das fünffache Volumen verdünnt und auf eine Ni2+-NTA-Agarose-Säule geladen.
Anschließend wurde die Säule mit Puffer A und zur Entfernung endogener Sf9-G?-Untereinheiten
mit AMF-Puffer (20 mM HEPES, pH 8,0, 100 mM NaCl, 1 % Natriumcholat,
10 mM NaF, 50 µM AlCl3, 10 µM GDP, 50 mM MgCl2, 10 mM ?-ME) gewaschen. Nach
dem Waschen mit Puffer B (20 mM HEPES, pH 8,0, 25 mM NaCl, 0,1 % Lubrol PX, 10 mM
?-ME) wurden die G?1?2-His-Komplexe mit Puffer C (20 mM Tris/HCl, pH 8,0, 25 mM
NaCl, 150 mM Imidazol, 0,1 % Lubrol PX, 10 mM ?-ME) eluiert.
Methoden
36
4.5.2.2 Reinigung rekombinanter Hexahistidin-markierter PI-3-Kinasen
Die cytosolische Fraktion (4.5.1) wurde mit 4-10 mM Imidazol versetzt und auf eine Ni2+-
NTA-Agarose-Säule geladen. Nach dem Waschen der Säule mit Puffer D (20 mM Tris/HCl,
pH 8,0, 150 mM NaCl, 4-10 mM Imidazol, 10 mM ?-ME) wurden die gebundenen Proteine
mit Puffer E (20 mM Tris/HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl, 150 mM Imidazol, 10 mM ?-ME)
eluiert.
4.5.2.3 Reinigung rekombinanter GST-fusionierter PI-3-Kinasen
Die cytosolische Fraktion (4.5.1) wurde langsam auf eine Glutathion-Sepharose-Säule geladen,
um eine hohe Bindung zu erreichen. Nicht gebundene Proteine wurden durch Waschen
mit Puffer F (20 mM Tris/HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl, 10 mM ?-ME) entfernt. Die
gebundenen GST-Fusionsproteine wurden mit 10 mM Glutathion in Puffer F eluiert.
4.5.3 Anionenaustausch-Chromatographie
Auf die affinitätschromatographische Reinigung der Proteine (4.5.2) folgte die Anionenaustausch-
Chromatographie, um störende Pufferbestandteile zu entfernen und die Proteine zu
konzentrieren. Hierfür wurden die Eluate (4.5.2) mit Puffer G (20 mM Tris/HCl, pH 8,0,
10 mM ?-ME sowie 0,1 % Lubrol PX für Membranproteine) auf das fünffache Volumen
verdünnt und auf eine Resource Q15-Säule (1 ml) geladen. Nach dem Waschen der Säule mit
Puffer G wurden die Proteine entsprechend ihrer steigenden negativen Nettoladung mit Hilfe
eines linearen NaCl-Gradienten (0-500 mM in Puffer G, c(NaCl)/V = 25 mM/ml) eluiert
und fraktioniert. Die gereinigten Proteine wurden durch ihre Immunoreaktivität (4.7.4)
identifiziert und durch Coomassie-Färbung nach gelelektrophoretischer Auftrennung (4.7.1)
quantifiziert. Sofern die Proteine nicht unmittelbar zum Einsatz kamen, wurden sie in
flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -70 °C gelagert.
4.6 Immunpräzipitation
Differenzierte HL-60-Zellen (4.3.1) bzw. transfizierte HEK293-Zellen (4.3.2) wurden nach
Abtrennen des Mediums in Lysispuffer (50 mM HEPES, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM
EDTA, 1 mM NaF, 2 mM ?-ME, 1 % Nonidet P40, 2 mM Pyrophosphat, 2 mM Orthovanadat,
0,2 mM Pefabloc SC, 50 µg/ml Benzamidin, 10 µg/ml Trypsin-Inhibitor, 10 µg/ml
TPCK) resuspendiert und durch Homogenisieren mit einer Injektionskanüle (26 G) aufgeschlossen.
Zur Gewinnung des Zellextrakts erfolgte eine Ultrazentrifugation (100.000 x g,
4 °C, 30 min). Inzwischen wurde der anti-p110?-Antikörper an ProteinA-Sepharose
gebunden. Die Zellextrakte wurden mit Präzipitationspuffer (50 mM Phosphatpuffer, pH 7,2,
Methoden
37
150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 5 mM NaF, 1 % Nonidet P40, 2 mM Pyrophosphat, 2 mM
Orthovanadat, 0,2 mM Pefabloc SC, 50 µg/ml Benzamidin) verdünnt und mit Antikörperhaltiger
bzw. Antikörper-freier ProteinA-Sepharose über Nacht bei 4 °C unter leichtem
Schütteln inkubiert. Nach dem Abzentrifugieren der Sepharose (1000 x g, 2 min) wurden
nicht gebundene Proteine durch Waschen mit Präzipitationspuffer entfernt. Es folgten
Waschschritte mit 1 M LiCl in 100 mM Tris/HCl, pH 7,5 und mit Vesikelpuffer (4.8.1). Die
so vorbereiteten Proben wurden zur Bestimmung der Lipid- bzw. Proteinkinase-Aktivität
(4.8) eingesetzt oder zur Identifizierung der gebundenen Proteine mit Probenpuffer nach
Lämmli (4.7.2) resuspendiert, gelelektrophoretisch aufgetrennt (4.7.2) und durch ihre
Immunoreaktivität (4.7.4) identifiziert.
4.7 Proteinbiochemische Analyse-Methoden
4.7.1 Proteinbestimmung
Die Konzentration der eingesetzten Proteine wurde durch verschiedene Methoden bestimmt,
die alle auf der Bildung eines farbigen Komplexes in Abhängigkeit vom Proteingehalt
beruhen.
Die BCA-Methode (“Pierce BCA Protein Assay”) wurde zur Konzentrationsbestimmung
von Proteinpräparationen eingesetzt, die keine Detergenzien enthielten. Dabei reagiert
das Protein mit Cu2+ und Bicinchoninsäure in alkalischer Lösung zu einem Cu+-Bicinchoninsäurekomplex.
Dieser Komplex kann spektrophotometrisch nachgewiesen werden. Für
detergenzhaltige Präparationen kam die Methode nach Lowry und Mitarbeitern (1951),
teilweise modifiziert nach Peterson (1983), zum Einsatz. Diese beruht auf der Reduktion von
Folin-Ciocalteau-Phenolreagenz durch Proteine, wobei ein farbiger Komplex entsteht, dessen
Intensität von der eingesetzten Proteinkonzentration abhängig ist.
Als weitere Bestimmungsmethode wurde die Färbung von Proteinen mit Coomassie
Brilliant Blue herangezogen (4.7.3). Dazu wurden die Proteine SDS-gelelektrophoretisch aufgetrennt
(4.7.2) und durch Coomassie-Lösung angefärbt. Die mit 10 %iger Essigsäure
entfärbten Gele wurden mit Hilfe eines Durchlichtscanners digitalisiert und mit der
Auswertungssoftware TINA 2.09f (Raytest, Straubenhardt) densitometrisch quantifiziert.
Bei allen drei Methoden wurde Rinderserum-Albumin als Mengenstandard verwendet.
4.7.2 SDS-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
Zur Auftrennung von Proteinen entsprechend ihrer relativen Molekülmasse wurde ein von
Lämmli (1970) entwickeltes, denaturierendes, diskontinuierliches Elektrophorese-System verwendet.
Dazu werden die Proben in Probenpuffer (62,5 mM Tris/HCl, 10 % (v/v) Glycerin,
5 % (v/v) ?-ME, 2 % (w/v) SDS und 0,02 % (w/v) Bromphenolblau) aufgenommen. Die
Methoden
38
Spaltung von Disulfidbrücken durch ?-Mercaptoethanol verhindert eine Zusammenlagerung
einzelner Untereinheiten zu multimeren Proteinen. SDS, ein anionisches, hydrophiles Detergenz,
denaturiert die Proteine und verleiht ihnen durch Anlagerung an ihre Oberfläche eine
negative Ladung. Dadurch können die Proteine nahezu unabhängig von ihrer eigentlichen
Ladung und Faltung entsprechend ihrer Molmasse im elektrischen Feld aufgetrennt werden.
Die Elektrophorese wurde in einem Puffer aus 25 mM Tris/HCl, 192 mM Glycin und 0,1 %
(w/v) SDS durchgeführt. Zur Konzentrierung der Proteine bei einer Spannung von 100 V
diente ein relativ großporiges Sammelgel, während die Auftrennung bei 150 V in einem
kleinporigen Trenngel erfolgte.
Sammelgel Trenngel
Acrylamid/Bisacrylamid
(30 % / 0,8 %)
4,5 % (w/v) 10 % (w/v)
SDS 0,1 % (w/v) 0,1 % (w/v)
APS 0,1 % (w/v) 0,1 % (w/v)
TEMED 0,1 % (w/v) 0,1 % (w/v)
Tris/HCl 125 mM, pH 6,8 375 mM, pH 8,8
Zur gelelektrophoretischen Trennung von Peptiden nach enzymatischem Verdau der p110?-
Untereinheit (4.10.1) wurden kommerzielle Polyacrylamidgele der Fa. Bio-Rad verwendet.
Dabei handelt es sich um ein Tris/Tricin/SDS-Gelsystem mit einem kontinuierlichen Polyacrylamidgradienten
von 4 - 20 %, das eine hohe Auflösung im Molekulargewichtsbereich
von < 10 kDa ermöglicht. Die Proben wurden in einem mitgelieferten Probenpuffer entsprechend
den Angaben des Herstellers aufgenommen.
4.7.3 Coomassie-Färbung von SDS-Polyacrylamidgelen
Die über SDS-Polyacrylamidgele aufgetrennten Proteine (4.7.2) konnten durch Färbung mit
1 % (w/v) Coomassie Brilliant Blue in 45 % (v/v) Methanol und 10 % (v/v) Essigsäure
sichtbar gemacht werden. Das Gel wurde mit der Coomassie-Lösung mindestens 20 min
gefärbt und anschließend mit einem Gemisch aus 5 % Methanol und 10 % Essigsäure
entfärbt, wobei Methanol den Farbstoff aus dem Gel herauslöst und Essigsäure den farbigen
Proteinkomplex stabilisiert. Die Proteine waren nach Entfärbung des Gels als blaue Banden
sichtbar. Für die kolorimetrische Quantifizierung von Proteinbanden (4.7.1) wurde 10 %ige
Essigsäure ohne Methanolzusatz zum Entfärben eingesetzt.
Methoden
39
4.7.4 Immunoblot
Gelelektrophoretisch aufgetrennte Proteine (4.7.2) wurden durch dieses Verfahren auf Nitrocellulose-
Membranen übertragen (Towbin et al., 1976) und anschließend mit spezifischen
Antikörpern nachgewiesen (Leopoldt et al., 1997, Viard et al., 1999, Macrez et al., 2001). Der
Proteintransfer (Minigel, 8 x 10 cm) erfolgte für 90 min bei 250 mA mit 25 mM Tris/HCl,
192 mM Glycin, 0,02 % (w/v) SDS in 20 % (v/v) Methanol. Die Nitrocellulose-Streifen
wurden mit Ponceau S-Lösung angefärbt und der überschüssige Farbstoff dann durch Spülen
mit demineralisiertem H2O entfernt. Die auf die Membran transferierten Proteine wurden
dabei durch Bindung des roten Farbstoffs reversibel sichtbar gemacht. Um den Proteinen
später eine Molmasse zuordnen zu können, wurde die Position der Standardproteine auf den
Membranen markiert. Dann wurden die Membranen bei Raumtemperatur für 1 h in einer
10 %igen Lösung von Roti-Block geschüttelt, um unspezifische Bindungsstellen abzusättigen.
Im Anschluß daran folgte eine einstündige Inkubation mit Antiseren (Verdünnungen 1:150 -
1:2000), die gegen bestimmte Peptidsequenzen der nachzuweisenden Proteine gerichtet
waren.
Nach mehrmaligem Waschen der Nitrocellulose-Streifen mit TBST-Puffer wurden
diese für 1 h mit einem 1:1000 verdünnten Peroxidase-konjugierten Anti-Immunglobulin-
Antikörper inkubiert (Anti-Maus- bzw. Anti-Kaninchen-IgG). Die Antigen-Antikörper-
Komplexe wurden nach erneutem Waschen der Membranen mit TBST-Puffer über die
Peroxidase-Aktivität durch Chemolumineszenz nachgewiesen (ECL-Kit, Amersham Buchler,
Braunschweig).
TBST-Puffer (Tris-buffered-saline-Tween)
Tris/HCl, pH 8,0 10 mM
NaCl 150 mM
Tween 0,05 % (v/v)
4.8 PI-3-Kinase-Funktionsbestimmung
Klasse I PI-3-Kinasen zeigen sowohl eine Lipid- als auch eine Ser/Thr-Proteinkinase-
Aktivität (Hunter, 1995). Zur Bestimmung der Lipidkinase-Aktivität wurde die Fähigkeit der
Klasse I PI-3-Kinasen untersucht, Phosphoinositide in der 3’-Position des Inositolrings unter
Übertragung der ?-ständigen Phosphatgruppe von [?-32P]ATP zu phosphorylieren (Stoyanov
et al., 1995). Die dabei entstandenen 32P-markierten 3’-phosphorylierten Produkte wurden
isoliert, dünnschichtchromatographisch aufgetrennt und quantifiziert (4.8.2). Die Ser/Thr-
Proteinkinase-Aktivität von Klasse I PI-3-Kinasen wurde als Autophosphorylierung gemessen
(Maier et al., 1999). Die gebildeten 32P-markierten Produkte wurden SDS-gelelektrophoretisch
aufgetrennt (4.7.2) und quantifiziert (4.8.3).
Methoden
40
4.8.1 Herstellung der Phospholipid-Vesikel
Zur Herstellung der Lipidvesikel wurden 2 ml-Eppendorf-Reaktionsgefäße mit Chloroform
ausgespült und die folgenden Lipid-Lösungen in den angegebenen Mengen gemischt: 22,5 µl
Phosphatidylethanolamin (10 mg/ml), 21 µl Phosphatidylserin (10 mg/ml), 9,6 µl Phosphatidylcholin
(10 mg/ml), 10,5 µl Sphingomyelin (2 mg/ml) und für Lipidkinase-Aktivitäts-
Untersuchungen zusätzlich 30 µl PI-4,5-P2 (1 mg/ml) oder 20 µl PI (10 mg/ml). Die Lipidmischung
wurde im N2-Strom getrocknet und der entstandene Lipidfilm in 900 µl Vesikelpuffer
(40 mM HEPES, pH 7,4, 100 mM NaCl, 1 mM EGTA, 0,2 mM EDTA, 1 mM DTT,
1 mM ?-Glycerophosphat und 0-10 mM MgCl2 bzw. MnCl2) aufgenommen. Die Eppendorfgefäße
wurden im Ultraschallbad bei Raumtemperatur inkubiert, bis sich der Lipidfilm
vollständig von der Gefäßwandung unter Bildung einer leicht trüben Suspension gelöst hatte.
4.8.2 Bestimmung der Lipidkinase-Aktivität
Die Lipidkinase-Aktivität wurde in einem Reaktionsvolumen von 50 µl bestimmt (Maier
et al., 1999). Dazu wurden 30 µl Phospholipid-Vesikel (4.8.1) mit 3 µl BSA (1 %) und den
jeweiligen Stimuli (G??-Komplexe und/oder p85-Bindungspeptid) versetzt und für 10 min auf
Eis inkubiert. Für die Messung der G??-stimulierten Lipidkinase-Aktivität wurden die
einzelnen Versuchsansätze mit Hilfe von G??-Trägerpuffer auf die gleiche Detergenz-
Konzentration eingestellt. Anschließend wurden 20-100 ng PI-3-Kinase ??bzw. 2-10 ng
PI-3-Kinase ??zugegeben und weitere 10 min auf Eis inkubiert. Die Phosphorylierungsreaktion
wurde durch Zugabe von 10 µl Reaktionspuffer (40 mM HEPES, pH 7,4, 100 mM
NaCl, 1 mM EGTA, 0,2 mM EDTA, 1 mM DTT, 1 mM ?-Glycerophosphat, 0,1 % BSA,
40 µM ATP, 1 µCi [?-32P]ATP und 0-10 mM MgCl2 bzw. MnCl2) gestartet und nach
15minütiger Inkubation bei 37 °C durch Zugabe von 150 µl 1 N HCl gestoppt.
Alle weiteren Arbeitsschritte wurden zur Vermeidung von hydrolytischen
Dephosphorylierungen auf Eis durchgeführt. Die Extraktion der Lipide erfolgte mit 500 µl
Chloroform/Methanol (1:1) durch Vortexen (30 s), anschließend wurden die Phasen durch
Zentrifugation (1000 x g, 1 min, 4 °C) wieder getrennt. Von der unteren organischen Phase
wurden 150 µl abpipettiert und in ein Eppendorfgefäß überführt, in welchem 150 µl 1 N HCl
vorgelegt waren. Der Waschschritt wurde wiederholt. Anschließend wurde die organische
Phase dünnschichtchromatographisch aufgetrennt.
Hierzu wurde eine 20 x 20 cm Dünnschichtplatte (Kieselgel 60) mit Kaliumoxalat (1 %
in 40 % Methanol) vorentwickelt, anschließend zunächst an der Luft und unmittelbar vor
Gebrauch für mindestens 1 h bei 80 °C getrocknet. Von der gewaschenen organischen Phase
wurden 40-100 µl auf die Platte aufgetragen und mit einem Gemisch aus 35 ml 2 N
Essigsäure und 65 ml n-Propanol entwickelt (2,5 h, ca. 15 cm). Die Platten wurden getrocknet
und autoradiographisch mit Hilfe eines Phosphor-Imagers ausgewertet.
Methoden
41
4.8.3 Bestimmung der Proteinkinase-Aktivität
Die Bestimmung der Proteinkinase-Aktivität erfolgte prinzipiell wie die Bestimmung der
Lipidkinase-Aktivität (4.8.2). Es wurden Phosphoinositid-freie Phospholipid-Vesikel verwendet
und das Probenvolumen betrug 25 µl (Maier et al., 1999, 2000). 15 µl Phospholipid-
Vesikel wurden mit 1,5 µl BSA (1%) und den jeweiligen Stimuli (G??-Komplexe und/oder
p85-Bindungspeptid) versetzt und für 10 min auf Eis inkubiert. Anschließend wurden
20-50 ng PI-3-Kinase zugegeben und für weitere 10 min auf Eis inkubiert. Die Angleichung
der G??-Puffermengen erfolgte analog zur Bestimmung der Lipidkinase-Aktivität. Nach
Zugabe von 5 µl Reaktionspuffer (wie in 4.8.2, jedoch 80 µM ATP und 2 µCi [?-32P]ATP)
wurde der Ansatz für 30 min bei 37 °C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von
10 µl vierfach konzentriertem Probenpuffer nach Lämmli (4.7.2) gestoppt. 25 µl der Probe
wurden SDS-gelelektrophoretisch aufgetrennt (4.7.2) und auf eine Nitrocellulose-Membran
transferiert (4.7.4). Die quantitative Auswertung der getrockneten Blot-Streifen erfolgte mit
einem Phosphor-Imager.
Zur Protein-Phosphorylierung für massenspektrometrische Untersuchungen wurden
20-50 µg PI-3-Kinase in einem Reaktionsvolumen von 1500 µl eingesetzt. Auf den Zusatz
von BSA zum Reaktionsgemisch wurde verzichtet. Nach 30minütiger Inkubation bei 37 °C
erfolgte die Zugabe von 0,5 % Natriumcholat, um die Lipidvesikel zu solubilisieren.
Anschließend wurde die Probe mit Hilfe von Centrikon Ultrazentrifugationsröhrchen konzentriert,
SDS-gelelektrophoretisch aufgetrennt und das Gel mit Coomassie-Lösung gefärbt. Zur
Quantifizierung der Autophosphorylierung wurde ein Phosphor-Imager benutzt.
4.9 Phosphoaminosäure-Analyse
Zur Bestimmung der phosphorylierten Aminosäure wurde eine zweidimensionale Dünnschichtelektrophorese
nach saurer Hydrolyse des Proteins durchgeführt (Boyle et al., 1991).
Hierfür wurde das mit radioaktiv markiertem ATP phosphorylierte Protein gelelektrophoretisch
aufgetrennt und auf eine PVDF-Membran (Immobilon P) transferiert. Die radioaktiv
markierte Proteinbande wurde ausgeschnitten und in 6 M HCl für 1 h bei 110 °C hydrolysiert.
Nach dem Einengen der Probe in einer Vakuumzentrifuge wurde diese in Puffer I (pH 1,9)
aufgenommen. Die Probe sowie Phosphoaminosäure-Standards (1 mg/ml Phosphoserin, Phosphothreonin,
Phosphotyrosin) wurden auf eine Cellulose-Dünnschichtplatte aufgebracht und
in der ersten Dimension für 60 min bei 550 V in Puffer I (pH 1,9) aufgetrennt. Nach
Trocknung der Platte wurde diese um 90 ° gegen den Uhrzeigersinn gedreht und in der
zweiten Dimension für 50 min bei 500 V in Puffer II (pH 3,5) entwickelt. Zur Sichtbarmachung
der Phosphoaminosäure-Standards wurde die getrocknete Dünnschichtplatte mit
0,2 % Ninhydrin in Aceton besprüht und erhitzt, bis die Standards als violette Flecken
sichtbar wurden. Anschließend wurde die Dünnschichtplatte zur Detektion der Radioaktivität
Methoden
42
auf einen Röntgenfilm aufgelegt. Anhand der gefärbten Phosphoaminosäure-Standards
konnten die radioaktiv markierten Phosphoaminosäuren zugeordnet werden.
Puffer I (pH 1,9) Puffer II (pH 3,5)
88 % Ameisensäure 50 ml Pyridin 10 ml
Eisessig 156 ml Eisessig 100 ml
H2O 1794 ml H2O 1890 ml
4.10 Massenspektrometrische Methoden
4.10.1 Spaltung der Gel-fixierten Proteine
Die Coomassie-gefärbte Proteinbande wurde aus dem Gel ausgeschnitten, in Würfel von ca.
1 mm Kantenlänge geteilt und zur Entfernung des SDS mit H2O gewaschen. Es folgten ein
Waschschritt mit 50 % (v/v) Acetonitril in 25 mM NH4HCO3 und das Schrumpfen der Gelstückchen
mit Acetonitril. Zur Reduktion von Disulfidbrücken wurden die Gelstückchen für
45 min bei 55 °C mit 10 mM DTT in 100 mM NH4HCO3 inkubiert. Anschließend erfolgte
die Alkylierung von Cystein-Resten durch Zugabe von 55 mM Iodacetamid in 100 mM
NH4HCO3. Nach 20minütiger Inkubation bei 25 °C im Dunklen wurden die Gelstückchen mit
50 % (v/v) Acetonitril in 25 mM NH4HCO3 gewaschen, durch Zugabe von Acetonitril
dehydratisiert und in einer Vakuumzentrifuge getrocknet.
Es folgten die Rehydratisierung der Gelstückchen mit den entsprechenden Proteaselösungen
(1-3 µg Enzym) und eine Inkubation bei 37 °C (Trypsin, LysC, AspN, Chymotrypsin)
bzw. 25 °C (GluC) über Nacht. Zur Extraktion der Peptide wurde 0,5 % (v/v) TFA in
Acetonitril zugegeben und die Probe für 15 min im Ultraschallbad inkubiert. Die peptidhaltige
Lösung wurde vorsichtig in der Vakuumzentrifuge eingeengt.
Zur nicht-enzymatischen Spaltung der Proteine wurden die Gelstückchen mit
Bromcyan-Lösung (10 mg/ml in 50 % (v/v) TFA) rehydratisiert und über Nacht bei 25 °C
inkubiert. Die Extraktion der Peptide erfolgte mit Acetonitril. Zur Entfernung der TFA wurde
die peptidhaltige Lösung mehrfach mit H2O aufgenommen und in der Vakuumzentrifuge
eingeengt.
4.10.2 Aufreinigung der peptidhaltigen Lösung mittels ZipTip
Sollte eine MALDI-MS-Analyse der unseparierten Peptid-Lösung erfolgten, wurde die Probe
mittels ZipTip C18 aufgereinigt, um störende Salze abzutrennen (Kussmann et al., 1997).
Hierfür wurde die eingeengte Probe (4.10.1) in 10 µl 0,1 % (v/v) TFA/ 5 % (v/v) Acetonitril
aufgenommen und an eine C18-reversed phase-Minisäule gebunden, die zuvor mit 0,1 % (v/v)
TFA equilibriert worden war. Es folgten ein Waschschritt mit 0,1 % (v/v) TFA und die
Methoden
43
Elution der Peptide mit 2,5 µl ACHC-Matrix-Lösung (8 mg/ml ?-Cyano-4-hydroxyzimtsäure
in 0,3 % TFA/ 70 % (v/v) Acetonitril) direkt auf die Probenplatte.
4.10.3 Reversed phase-HPLC
Zur Auftrennung der Peptide wurde eine reversed phase-HPLC an einer C18-Säule (Vydac
218 TP 5115, 150 x 1,0 mm, Partikelgröße 5 µm) durchgeführt. Hierfür wurde die eingeengte
Probe (4.10.1) in 5 µl 0,1 % (v/v) Ameisensäure aufgenommen und auf die Säule geladen, die
zuvor mit 0,1 % (v/v) Ameisensäure equilibriert worden war. Die Elution der Peptide erfolgte
mit einem linearen Acetonitril-Gradienten (4-64 % (v/v) Acetonitril in 0,1 % (v/v)
Ameisensäure, 60 min, 64 % (v/v) Acetonitril in 0,1 % (v/v) Ameisensäure, 5 min, 64-4 %
(v/v) Acetonitril in 0,1 % (v/v) Ameisensäure, 2 min) mit einem Fluß von 30 µl/min in
Fraktionen á 30 µl. Durch Messung der Cerenkov-Strahlung in einem Flüssigkeitsszintillations-
Spektrometer konnten radioaktive Fraktionen identifiziert werden, die in der
Vakuumzentrifuge eingeengt wurden. Von diesen Proben wurde 1 µl mit 1 µl ACHC-Matrix-
Lösung (4.10.2) gemischt und auf die Probenplatte aufgebracht.
4.10.4 MALDI-MS
Die nach 4.10.2 bzw. 4.10.3 aufbereiteten Proben wurden in einem MALDI-TOF (matrixassisted
laser desorption/ionization – time-of-flight)-Spektrometer der Firma Perseptive Biosystems,
Inc. (Voyager-DE STR BioSpectrometry Workstation) analysiert. Die Messungen
wurden im Reflektions-Modus mit einer Beschleunigungsspannung von 20 kV, 70 %
Gitterspannung und einer Verzögerung von 200 ns sowie im Linear-Modus mit einer
Beschleunigungsspannung von 20 kV, 94 % Gitterspannung und einer Verzögerung von
200 ns durchgeführt. Für jedes Spektrum wurde der Mittelwert aus 256 Laser-Impulsen
gebildet. Zur Interpretation der Spektren wurden die Programme MS-Fit (http://prospector.
ucsf.edu/ucsfhtml3.4/msfit.htm) und FindMod (http://expasy.ch/tools/findmod) verwendet.
4.10.5 Massenspektrometrische Peptidsequenzierung
Zur Sequenzierung von Peptiden mittels Nanoelektrospray-Ionisierungs-Tandemmassenspektrometrie
(nESI-MS/MS) wurden 5 µl der Peptidmischung (4.10.3) lyophilisiert und in
5 µl 0,5 % Ameisensäure in 50 % (v/v) Methanol aufgenommen. Die MS/MS-Messung wurde
mit einem Nanoelektrospray-Hybrid-Quadrupol-Massenspektrometer Q-TOF (Micromass,
Manchester, UK) durchgeführt. Als Kollisionsgas diente Argon bei einem Druck von
6,0 x 10-5 mbar in der Kollisionszelle.
Ergebnisse
44
5 ERGEBNISSE
5.1 Charakterisierung der Autophosphorylierung der PI-3-
Kinase ?
5.1.1 G ?????-Sensitivität der Autophosphorylierung
Ein wichtiges Charakteristikum aller Klasse I PI-3-Kinasen ist ihre intrinsische Serin/
Threonin-Proteinkinase-Aktivität (Hunter, 1995). So konnten Stoyanova und Mitarbeiter
(1997) erstmals die Autophosphorylierung der monomeren p110?-Untereinheit zeigen. In
unserer Arbeitsgruppe durchgeführte Untersuchungen zur Proteinkinase-Aktivität der
gereinigten heterodimeren PI-3-Kinase ??ergaben ebenfalls eine Phosphorylierung der katalytischen
p110?-Untereinheit, die Mg2+-abhängig war und durch Zugabe von G??-
Komplexen gesteigert werden konnte (Maier et al., 1999). Weiterhin beschrieben Bondev und
Mitarbeiter (1999) am gereinigten Enzym auch eine Phosphorylierung der p101-Untereinheit.
Zusätzlich hatten in dieser Untersuchung G??-Komplexe in höherer Konzentration einen
hemmenden Effekt auf die Proteinkinase-Aktivität der PI-3-Kinase ?. Um die Befunde
einordnen und verstehen zu können, sollte die G??-Sensitivität der Autophosphorylierung der
PI-3-Kinase ??unter verschiedenen Versuchsbedingungen untersucht werden. Ein Unterschied
in den Versuchsansätzen bestand in der Verwendung von Phosphoinositid-freien Phospholipid-
Vesikeln durch Maier und Mitarbeiter (1999), während in der Arbeit von Bondev und
Mitarbeitern (1999) auf eine lipophile Umgebung verzichtet wurde. Daher untersuchten wir
zunächst die G??-stimulierte Autophosphorylierung der rekombinant gereinigten PI-3-
Kinase ??(p101-GST/p110???in An- und Abwesenheit von Phospholipid-Vesikeln (Abb. 6A).
In Abwesenheit der Vesikel hatten G??-Komplexe keinen Einfluß auf die Autophosphorylierung
der p110?-Untereinheit, während in Anwesenheit der Vesikel eine Stimulation der
Autophosphorylierung der p110?-Untereinheit durch G???beobachtet werden konnte. Ein
Grund für die Notwendigkeit von Phospholipid-Vesikeln für die G??-Stimulation der
Autophosphorylierung der p110?-Untereinheit könnte darin liegen, dass die Vesikel für die
korrekte Faltung des Enzyms erforderlich sind und eine Präorientierung der Interaktionspartner
auf der Oberfläche der Vesikel zu einer verbesserten Wechselwirkung führt. Allerdings
wurde eine in Abwesenheit von G??-Komplexen beobachtete Phosphorylierung der
p101-Untereinheit durch Zugabe von G???auch in Anwesenheit von Phospholipid-Vesikeln
nicht verstärkt. Diese fehlende Regulierbarkeit deutet möglicherweise auf eine unspezifische
Phosphorylierung hin. Da die p101-Untereinheit mit dem Enzym Glutathion-S-Transferase
fusioniert war, ist auch nicht auszuschließen, dass die Phosphorylierung in diesem Bereich
des Fusionsproteins stattfand. Daher sollte ein Enzym mit veränderter Affinitätsmarkierung
(His-p110?/p101) auf seine Proteinkinase-Aktivität untersucht werden. Wie in Abb. 6B
gezeigt, war auch bei Verwendung des Hexahistidin-markierten Heterodimers eine
Ergebnisse
45
Phosphorylierung der p110?-Untereinheit zu beobachten, während die p101-Untereinheit
nicht phosphoryliert wurde. Daher kam für alle weiteren in vitro-Untersuchungen dieses
Heterodimer zum Einsatz.
Abb. 6: G????????-Stimulation der Autophosphorylierung der PI-3-Kinase ??in An- und Abwesenheit
von Phospholipid-Vesikeln
A Gereinigte heterodimere PI-3-Kinase ??(p101-GST/p110?) wurde auf den Einbau von radioaktiv markiertem
32P-Phosphat in An- und Abwesenheit von Phospholipid-Vesikeln sowie unter Zugabe unterschiedlicher
Konzentrationen von rekombinanten G?1?2-His-Komplexen untersucht. Die Messungen wurden entsprechend den
Angaben in den Methoden durchgeführt. Gezeigt sind repräsentative Autoradiogramme nach gelelektrophoretischer
Auftrennung der Proteine und anschließendem Transfer auf Nitrocellulose-Membranen (oben) und die
Mittelwerte (± S.D.) aus drei unabhängigen Versuchen (unten). Man beachte, dass die GST-fusionierte p101-
Untereinheit ein größeres Molekulargewicht aufweist als die p110?-Untereinheit. B Die Proteinkinase-Aktivität der
gereinigten heterodimeren PI-3-Kinase ??(p101-GST/p110??bzw. His-p110?/p101) wurde in Anwesenheit von
Phospholipid-Vesikeln bestimmt. Gezeigt sind ein Commassie-gefärbtes Gel der gereinigten Proteine (links)
sowie ein typisches Autoradiogramm (rechts).
Als nächstes wurde untersucht, ob das Hexahistidin-markierte Heterodimer (His-p110?/p101)
die gleiche Stimulierbarkeit durch G??-Komplexe zeigt wie das bisher in unserer Arbeitsgruppe
verwendete GST-Fusionsprotein (p101-GST/p110?). Die entsprechende Konzentrations-
Wirkungs-Kurve ist in Abb. 7 dargestellt. G?1?2-His-Komplexe stimulierten hierbei
die Autophosphorylierung der p110?-Untereinheit mit einem EC50-Wert von ca. 30 nM. Dies
entsprach den früher mit dem p101-GST/p110?-Heterodimer ermittelten Werten (Maier et al.,
2000).
Ergebnisse
46
Abb. 7: Sensitivität des p110?-His/p101-Heterodimers gegenüber G?????
Die Proteinkinase-Aktivität der heterodimeren PI-3-Kinase ??(His-p110?/p101) wurde mit steigenden Konzentrationen
von rekombinantem G?1?2-His stimuliert. Es wurde der Einbau von 32P-markiertem Phosphat in die
katalytische p110?-Untereinheit als Vielfaches des Basalwertes gemessen. Gezeigt ist ein typisches von drei
unabhängigen Experimenten.
5.1.2 Stöchiometrie der Autophosphorylierung
Bei den in unserer Arbeitsgruppe durchgeführten initialen Untersuchungen zur Autophosphorylierung
der p110?-Untereinheit betrug die Stöchiometrie des Phosphat-Einbaus etwa
0,6 mol Phosphat pro mol p110??(Maier et al., ?????. Das lässt die Vermutung zu, dass unter
optimalen Bedingungen genau eine Aminosäure phosphoryliert wird. Um dies zu prüfen,
sollten nun Versuchsparameter optimiert werden. Dafür wurde zunächst der Einfluß der ATPKonzentration
auf die basale und G??-stimulierte Autophosphorylierung der p110?-Untereinheit
untersucht (Abb. 8). In Anwesenheit von G??-Komplexen wurde eine maximale Autophosphorylierung
bei einer ATP-Konzentration von etwa 200 µM erreicht. Bei höheren ATPKonzentrationen
nahm die Effizienz der Phosphorylierungsreaktion wieder ab. Für die basale
Proteinkinase-Aktivität der PI-3-Kinase ??ergab sich bei einem wesentlich geringeren Ausmaß
der Phosphorylierung ein ähnliches Bild.
Weiterhin wurde der Zeitverlauf der Autophosphorylierung der p110?-Untereinheit
untersucht (Abb. 9). Unter basalen Bedingungen fand nur ein geringer Phosphat-Einbau in die
p110?-Untereinheit statt, der zeitabhängig zunahm. Im Gegensatz dazu wurde die Reaktion
durch Zugabe von G??-Komplexen stark beschleunigt. Nach etwa 30 min war der maximale
Phosphat-Einbau erreicht.
Ergebnisse
47
Abb. 8: Einfluß der ATP-Konzentration auf die Autophosphorylierung der p110?-Untereinheit
Die Proteinkinase-Aktivität der PI-3-Kinase ??wurde unter Basalbedingungen (!) sowie in Gegenwart von
120 nM G?1?2-His (") unter Verwendung steigender ATP-Konzentrationen bestimmt. Es wurde der Einbau von
32P-markiertem Phosphat in die katalytische p110?-Untereinheit gemessen, bezogen auf den maximalen
Phosphat-Einbau. Gezeigt ist ein repräsentatives von zwei Experimenten.
Abb. 9: Zeitverlauf der Autophosphorylierung der p110?-Untereinheit
Die Proteinkinase-Aktivität der PI-3-Kinase ??wurde in Ab- (!) bzw. Anwesenheit (") von 120 nM G?1?2-His
bestimmt. Die Reaktion wurde entsprechend den Angaben in den Methoden durchgeführt und nach den
angegebenen Zeiten abgestoppt. Die Messwerte sind bezogen auf die maximale Autophosphorylierung der
p110?-Untereinheit nach G??-Stimulation. Dargestellt ist ein repräsentatives von zwei Experimenten.
Unter den optimierten Versuchsbedingungen wurde in fünf unabhängigen Experimenten eine
Stöchiometrie des Phosphat-Einbaus von 0,94 ± 0,04 mol Phosphat pro mol p110??ermittelt.
Das deutet darauf hin, dass genau eine Aminosäure phosphoryliert wird.
Ergebnisse
48
5.1.3 Einfluß der Autophosphorylierung der p110 ?-Untereinheit auf die
Lipidkinase-Aktivität der PI-3-Kinase ?
Für die Klasse IA PI-3-Kinase-Isoformen ??und ??wurde berichtet, dass durch eine Mn2+-
abhängige Autophosphorylierung der regulatorischen p85-Untereinheit (PI-3-Kinase ?) bzw.
der katalytischen p110-Untereinheit (PI-3-Kinase ?) die Aktivierung der Lipidkinase-
Aktivität durch Rezeptor-Tyrosin-Kinasen (RTK) gehemmt wird (Dhand et al., 1994,
Vanhaesebroeck et al., 1999a). Hingegen soll die Mg2+-abhängige Autophosphorylierung der
p110?-Untereinheit zu keiner Beeinflussung der Lipidkinase-Aktivität führen (Stoyanova
et al., 1997). Dieser letzte Befund sollte für die Hexahistidin-markierte, heterodimere PI-3-
Kinase ??überprüft werden. Dazu wurde eine Probe der PI-3-Kinase ??in Gegenwart von G??-
Komplexen präphosphoryliert, während eine zweite Probe unter den gleichen Bedingungen,
jedoch in Abwesenheit von ATP, inkubiert wurde. Die mit ATP versetzte Probe war nach
30 min vollständig phosphoryliert (nicht gezeigt). Anschließend wurde die Lipidkinase-
Aktivität beider Proben in Abhängigkeit von der Zeit bestimmt (Abb. 10).
Abb. 10: Einfluß der Autophosphorylierung auf die Lipidkinase-Aktivität der PI-3-Kinase ?
Gereinigte heterodimere PI-3-Kinase ??wurde in Gegenwart von 120 nM G?1?2-His und Phosphoinositid-freien
Phospholipid-Vesikeln in An- (!) oder Abwesenheit (") von ATP für 30 min bei 37 °C inkubiert. Anschließend
erfolgten die Zugabe von PI-4,5-P2-haltigen Phospholipid-Vesikeln und 32P-markiertem ATP sowie die Angleichung
der ATP-Konzentration in der nicht präphosphorylierten Probe. Die Reaktion wurde nach den
angegebenen Zeiten abgestoppt und die Bildung von PI-3,4,5-P3 entsprechend den Angaben in den Methoden
bestimmt. Dargestellt sind die Mittelwerte (± S.D.) aus drei Experimenten.
Die präphosphorylierte und die nicht präphosphorylierte PI-3-Kinase ??katalysierten in
gleicher Weise die Bildung von PI-3,4,5-P3, wobei die Reaktion in beiden Fällen über
mindestens 50 min linear verlief. Daraus lässt sich schließen, dass die Autophosphorylierung
der p110?-Untereinheit keinen Einfluß auf die Lipidkinase-Aktivität der PI-3-Kinase ??hat.
Die unterschiedliche Regulation der Lipidkinase-Aktivität der PI-3-Kinase-Isoformen
??und ??durch die Autophosphorylierung der katalytischen p110-Untereinheiten ließ
uns vermuten, dass die Autophosphorylierung der p110?-Untereinheit in einer anderen Region
Ergebnisse
49
des Proteins erfolgt als bei der p110?-Untereinheit. Daher sollte im Folgenden die Phosphorylierungsstelle
der p110?-Untereinheit bestimmt werden.
5.2 Identifizierung der Phosphorylierungsstelle der p110 ?-
Untereinheit
5.2.1 Phosphoaminosäure-Analyse
Untersuchungen zur Proteinkinase-Aktivität von Klasse IA PI-3-Kinasen hatten ergeben, dass
die in vitro-Autophosphorylierung an Serin-Resten stattfindet (Dhand et al., 1994, Vanhaesebroeck
et al., 1997). Weiterhin konnten Dhand und Mitarbeiter (1994) Serin608 der p85-
Untereinheit als die Aminosäure identifizieren, die durch die intrinsische Proteinkinase-
Aktivität der p110?-Untereinheit phosphoryliert wird. Für die Autophosphorylierung der
p110?-Untereinheit wurde Serin1039 als Substrat identifiziert (Vanhaesebroeck et al., 1999a).
Daher stellte sich die Frage, ob auch die G??-stimulierbare Autophosphorylierung der p110?-
Untereinheit an einem Serin-Rest erfolgt. Um die phosphorylierte Aminosäure zu charakterisieren,
wurde eine Phosphoaminosäure-Analyse durchgeführt (Abb. 11).
Abb. 11: Phosphoaminosäure-Analyse der p110?-Untereinheit
Gereinigte heterodimere PI-3-Kinase ??(200 pmol) wurde in Anwesenheit von 400 nM G???mit [?-32P]ATP
phosphoryliert, gelelektrophoretisch aufgetrennt und auf eine PVDF-Membran transferiert. Nach dem Ausschneiden
der radioaktiv markierten p110?-Bande erfolgten der hydrolytische Abbau und die dünnschichtelektrophoretische
Auftrennung entsprechend den Angaben in den Methoden. Auf dem Autoradiogramm sind die
Phosphoaminosäure-Standards (pS – Phosphoserin, pT – Phosphothreonin, pY – Phosphotyrosin) markiert. Pi
bezeichnet die Laufhöhe von abgespaltenem Phosphat.
Die radioaktiv markierte Phosphoaminosäure, die durch hydrolytischen Abbau aus der p110?-
Untereinheit freigesetzt wurde, zeigte bei dünnschichtelektrophoretischer Auftrennung ein zu
Phosphoserin identisches chromatographisches Verhalten. Dieser Befund lässt den Schluß zu,
dass die G??-stimulierte Autophosphorylierung der p110?-Untereinheit in vitro an Serin-
Resten erfolgt.
Ergebnisse
50
5.2.2 Identifizierung des phosphorylierten Serin-Restes
5.2.2.1 Analyse verschiedener proteolytischer Spaltungen der phosphorylierten
p110 ?-Untereinheit
Zur Bestimmung der Position des phosphorylierten Serin-Restes der p110?-Untereinheit sind
vor allem massenspektrometrische Methoden geeignet (McLachlin und Chait, 2001). Hierbei
können nach der Ionisierung von Proteinen bzw. Peptiden deren Molekülmassen anhand des
Masse/Ladungs-Verhältnisses der erzeugten Molekülionen bestimmt werden. Nach enzymatischer
Spaltung eines Proteins mit spezifischen Endoproteinasen kann eine Massendifferenz
von 80 Da zwischen der theoretischen und der tatsächlich bestimmten Masse der entstandenen
Peptide als Hinweis auf das Vorhandensein von Phosphopeptiden dienen (Zhang et al., 1998).
Weiterhin können in Peptidgemischen, die aus der proteolytischen Spaltung eines Proteins
resultieren, mit Hilfe der Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS) durch Vorläufer-Ionen-
Analyse (Nachweis von PO3- (79 Da) generierenden Peptiden) und Neutralverlust-Analyse
(Detektion von Phosphoserin bzw. Phosphothreonin enthaltenden Peptiden, die H3PO4
(98 Da) abspalten) Phosphopeptide identifiziert und anschließend sequenziert werden
(Abb. 12, Wilm et al., 1996).
Abb. 12: Massenspektrometrische Methoden zur Detektion von Phosphopeptiden
Nach proteolytischer Spaltung eines phosphorylierten Proteins kann das resultierende Peptidgemisch mittels
MALDI-MS oder Nanoelektrospray-Ionisierungs-Tandem-Massenspektrometrie (nESI-MS/MS) analysiert werden.
Bei der MALDI-MS-Analyse deutet eine Massendifferenz von 80 Da zur theoretischen Peptidmasse auf eine
Phosphorylierung hin. Bei der nESI-MS/MS-Analyse können durch Vorläufer-Ionen- und Neutralverlust-Analyse
(Details siehe Text) Hinweise auf Phosphopeptide gewonnen werden. Die phosphorylierte Aminosäure kann
durch Sequenzierung des Phosphopeptids mittels nESI-MS/MS identifiziert werden. Durch eine Auftrennung des
Peptidgemisches mittels Mikro-Flüssigkeitschromatographie (Mikro-LC) vor der massenspektrometrischen Analyse
kann die Detektion von Phosphopeptiden erleichtert werden.
Ergebnisse
51
5.2.2.1.1 Proteolytisches Abbaumuster der phoshorylierten p110 ?-Untereinheit
Damit Peptide anhand ihres Masse/Ladungs-Verhältnisses massenspektrometrisch identifiziert
und gegebenenfalls sequenziert werden können, sollte ihre Masse etwa 600-3000 Da
betragen (Powell et al., 2000, Andreeva et al., 2001). Daher wurde zunächst untersucht,
inwieweit nach Spaltung der phosphorylierten p110?-Untereinheit mit verschiedenen Proteasen
Phosphopeptide entsprechender Größe entstanden. Die Spaltung mit den Endoproteinasen
Trypsin, LysC, GluC und AspN erfolgte im Gel nach einer Methode von
Shevchenko und Mitarbeitern (1996). Diese Proteasen katalysieren spezifisch die Hydrolyse
von Peptidbindungen C-terminal von Lysin und Arginin (Trypsin), C-terminal von Lysin
(LysC), C-terminal von Glutaminsäure (GluC) sowie N-terminal von Asparagin- und Cysteinsäure
(AspN). Auf die Verwendung von Chymotrypsin wurde verzichtet, da diese Protease
Peptidbindungen nicht nur C-terminal von Tyrosin, Phenylalanin und Tryptophan, sondern
teilweise auch C-terminal von Leucin, Methionin, Alanin, Asparagin- und Glutaminsäure
spaltet und aufgrund dieses komplexen Spaltungsmusters die Zuordnung der Massen sehr
schwierig ist. Die nach Protease-Spaltung entstandenen Peptide wurden gelelektrophoretisch
mit Hilfe eines Tris/Tricin/SDS-Gelsystems aufgetrennt (Abb. 13).
Abb. 13: Gelelektrophoretische Charakterisierung von Phosphopeptiden nach Protease-
Spaltung der phosphorylierten p110?-Untereinheit
Gereinigte heterodimere PI-3-Kinase ??(200 pmol) wurde in Anwesenheit von 400 nM G???mit [?-32P]ATP
inkubiert und gelelektrophoretisch aufgetrennt. Anschließend erfolgte die Proteolyse der Gel-fixierten p110?-
Untereinheit mit den aufgeführten Proteasen (1 - 3 µg) entsprechend den Angaben in den Methoden. Die
entstandenen Peptide wurden nach Zugabe von Acetonitril aus dem Gel extrahiert, und die peptidhaltige Lösung
wurde nach dem Einengen in der Vakuumzentrifuge mit Probenpuffer nach Lämmli aufgenommen („Acetonitril-
Extraktion“). Weiterhin wurden die Gelstückchen mit Probenpuffer nach Lämmli versetzt („SDS-Extraktion“).
Anschließend erfolgte eine gelelektrophoretische Auftrennung der Peptide mit Hilfe eines Tris/Tricin/SDSGradientengels
(4 - 20 % Polyacrylamid). Gezeigt ist ein repräsentatives Autoradiogramm. Die relativen
Molekulargewichte (kDa) von Standardproteinen sind am linken Bildrand markiert.
Da keine Proteinbanden mit einer Größe von 110 kDa zu detektieren waren, kann geschlossen
werden, dass die phosphorylierte p110?-Untereinheit mit allen verwendeten Proteasen
Ergebnisse
52
gespalten wurde. Nach Spaltung mit Trypsin, LysC und AspN waren keine distinkten, radioaktiv
markierten Peptidbanden zu erkennen. Die breiten radioaktiven Banden im unteren
Bereich des Gels deuteten darauf hin, dass mehrere kleine Phosphopeptide, vermutlich mit
Fehlspaltungen, entstanden. Hierbei wurde die p110?-Untereinheit an bestimmten Stellen
nicht gespalten, obwohl die entsprechenden Aminosäuren, z.B. Lysin bzw. Arginin im Falle
einer Trypsin-Spaltung, vorlagen. Dies könnte einerseits auf die schlechte Zugänglichkeit
dieser Bereiche des Proteins zurückzuführen sein, andererseits wird die Kinetik einer proteolytischen
Spaltung auch durch die unmittelbar vor und nach der Spaltungsstelle liegenden
Aminosäuren beeinflusst. Beispielsweise erfolgt eine Trypsin-Spaltung nicht, wenn auf Lysin
bzw. Arginin die Aminosäure Prolin folgt. Die nach Trypsin-, LysC- und AspN-Spaltung
entstandenen Phosphopeptide waren gut aus dem Gel extrahierbar, so dass die Extraktion der
Gelstückchen mit SDS-haltigem Puffer keine zusätzliche Rückgewinnung von Phosphopeptiden
erbrachte. Im Gegensatz dazu entstanden nach Spaltung mit GluC größere Phosphopeptide,
eine distinkte Peptidbande bei etwa 14 kDa ist hier zu erwähnen. Ein größerer Anteil
der Radioaktivität verblieb nach der Extraktion mit Acetonitril im Gel und konnte teilweise
mit SDS-haltigem Puffer herausgelöst werden.
5.2.2.1.2 MALDI-MS-Analyse der Protease-Spaltungen
Parallel zur Abschätzung der Größe der Phosphopeptide wurde eine Peptidkartierung mittels
MALDI-MS durchgeführt, um zu ermitteln, welche Sequenzbereiche der p110?-Untereinheit
mit den verschiedenen Protease-Spaltungen abgedeckt wurden, und gegebenenfalls erste
Hinweise auf phosphorylierte Peptide zu erhalten. Dafür wurden die nach der proteolytischen
Spaltung entstandenen Peptide mit Hilfe eines MALDI-TOF-Massenspektrometers analysiert.
Bei dieser massenspektrometrischen Methode werden die mit einer UV-absorbierenden
Matrix (z.B. ?-Cyano-4-hydroxyzimtsäure) kokristallisierten Peptide durch UV-Laser-Pulse
ionisiert. Anschließend werden die entstandenen Ionen im elektrischen Feld auf eine
definierte kinetische Energie beschleunigt und im Flugzeit-Analysator in einer feldfreien
Röhre aufgetrennt. Über die Flugzeit kann das Masse/Ladungs-Verhältnis für die einzelnen
Ionen ermittelt und bestimmten Peptiden zugeordnet werden. Üblicherweise werden MALDIMS-
Spektren von Peptiden als Positiv-Ionen-Spektren aufgenommen, d.h. nach der Ionisierung
der Moleküle werden durch Anlegen einer negativen Gitterspannung an die Beschleunigungselektrode
positive Ionen von der Probenoberfläche in Richtung des Analysators
beschleunigt und anschließend detektiert. Für die Peptidkartierung wurden zunächst Spektren
im Reflektions-Modus aufgenommen. Hierbei werden die Ionen in einem an die Driftstrecke
anschließenden elektrischen Gegenfeld umgelenkt, es erfolgt eine Energiefokussierung, die
eine höhere Auflösung und Massengenauigkeit der erhaltenen Massenspektren zur Folge hat.
Eine Zuordnung der Massen ist so mit größerer Sicherheit möglich. Ein Nachteil dieser
Methode ist der Empfindlichkeitsverlust, da während der Flugphase fragmentierte Ionen nicht
Ergebnisse
53
erfasst werden, was insbesondere Peptide größerer Masse betrifft. Um diese zu detektieren,
wurden auch Messungen im Linear-Modus durchgeführt. Hierbei werden durch Ausschalten
des elektrischen Gegenfeldes und Detektion der Ionen in linearer Anordnung zur Ionenquelle
alle Ionen, die beschleunigt wurden, erfasst, was eine erhöhte Empfindlichkeit der Messung
bedingt. Das hat allerdings eine geringere Auflösung und Massengenauigkeit zur Folge. Die
Zuordnung der Massen war daher mit einem größeren Fehler behaftet, was bei der Bewertung
der erhobenen Daten berücksichtigt werden musste. Bei der Aufnahme von Positiv-Ionen-
Spektren werden Phosphopeptide im Vergleich zu nicht phosphorylierten Peptiden schlechter
ionisiert und sind daher im Massenspektrum unterrepräsentiert (Janek et al., 2001). Weiterhin
konnte gezeigt werden, dass durch Messung im Negativ-Ionen-Modus eine verbesserte
Detektion von Phosphopeptiden erzielt werden kann. Hierbei werden durch Anlegen einer
positiven Gitterspannung an die Beschleunigungselektrode negative Ionen beschleunigt und
anschließend detektiert. Die entsprechenden Messungen wurden im Linear-Modus durchgeführt.
In Abb. 14 sind ein typisches MALDI-MS-Spektrum im Reflektions-Modus nach
Trypsin-Spaltung der phosphorylierten p110?-Untereinheit sowie die Sequenzabdeckung mit
Messungen im Reflektions- und im Linear-Modus (Positiv- und Negativ-Ionen-Modus) dargestellt.
Insgesamt konnten 60-70 % der entstandenen Peptide massenspektrometrisch nachgewiesen
werden, wobei der N- und C-Terminus des Proteins nicht erfasst wurden (siehe
Abb. 14B). Nach Spaltung mit LysC ergab sich eine vergleichbare Sequenzabdeckung,
wohingegen nach Spaltung mit GluC und AspN nur 40-50 % der Sequenz erfasst wurden
(nicht gezeigt). Hinweise auf Phosphopeptide gab es nach Spaltung mit den genannten
Proteasen nur bei Messungen im Linear-Modus anhand einer Massendifferenz von 80 Da zur
theoretischen Masse der Peptide. Dabei wurden Serin-Reste in Position 257, 513, 515, 517,
853, 859, 871, 915, 974 und 1101 der p110?-Untereinheit nach Spaltung mit mehreren Proteasen
als mögliche Phosphorylierungsstellen erfasst. Die Signalintensität der entsprechenden
Peptide war für eine Messung im Reflektions-Modus zu gering. Messungen im Negativ-
Ionen-Modus erbrachten keine zusätzlichen Hinweise auf Phosphopeptide. Daher war eine
weitere Charakterisierung dieser Peptide durch Sequenzierung mittels MALDI-PSD (postsource
decay, siehe 5.3.2) nicht möglich.
Die Schwierigkeiten bei der Detektion der Phosphopeptide können durch die
Komplexität des Peptidgemisches bedingt sein, die Diskriminierungseffekte während des
Ionisierungsprozesses bewirkt (Cohen und Chait, 1996, Kratzer et al., 1998). Zusammen mit
der im Vergleich zu nicht phosphorylierten Peptiden schlechten Ionisierbarkeit von Phosphopeptiden
können diese Diskriminierungseffekte die geringe Signalintensität von Phosphopeptiden
im MALDI-MS-Spektrum bewirken. Um die Detektion der Phosphopeptide zu verbessern,
war daher deren Isolierung aus dem nach der Protease-Spaltung vorliegenden
Peptidgemisch notwendig.
Ergebnisse
54
Abb. 14: Sequenzabdeckung nach Spaltung der p110?-Untereinheit mit Trypsin
A MALDI-MS-Spektrum der tryptischen Peptide der phosphorylierten p110?-Untereinheit im Reflektions-Modus.
Die proteolytische Spaltung, die Extraktion der Peptide aus dem Gel, die Aufreinigung des Peptidgemisches
mittels ZipTip und die MALDI-MS-Analyse wurden entsprechend den Angaben in den Methoden durchgeführt.
B Bereiche der Aminosäuresequenz der p110?-Untereinheit, die mit tryptischen Peptiden abgedeckt wurden. Für
die fett markierten Sequenzabschnitte konnten Peptide, deren Masse im Linar-Modus detektiert wurde,
zugeordnet werden. Eine graue Schattierung bedeutet die Detektion von Peptidmassen im Reflektions-Modus.
Für unterstrichene Sequenzabschnitte konnten im Linear-Modus Massen nachgewiesen werden, die im Vergleich
zur theoretischen Peptidmasse um 80 Da erhöht waren, was auf eine mögliche Phosphorylierung hindeutet.
Dargestellt sind die Ergebnisse eines repräsentativen Versuchs von drei.
Ergebnisse
55
5.2.2.2 Isolierung und MALDI-MS-Analyse von Phosphopeptiden
In Vorversuchen konnte eine selektive Anreicherung von Phosphopeptiden mittels Affinitätschromatographie
an Fe3+-NTA-Material (Zhou et al., 2000, Stensballe et al., 2001) nicht
erreicht werden. Daher sollte nach der proteolytischen Spaltung der phosphorylierten p110?-
Untereinheit eine reversed phase-HPLC zur Isolierung Phosphopeptid-haltiger Fraktionen
erfolgen, die anhand einer Markierung mit 32P-Phosphat identifiziert werden sollten. Es gibt
Berichte darüber, dass abhängig von der Probenbearbeitung bei der Protease-Spaltung Gelfixierter
Proteine unterschiedlich große Verluste auftreten können (Speicher et al., 2000).
Weiterhin hatten unsere Untersuchungen gezeigt, dass nach der Spaltung der phosphorylierten
p110?-Untereinheit mit verschiedenen Proteasen eine unterschiedliche Rückgewinnung von
Phosphopeptiden aus dem Gel möglich war (siehe 5.2.2.1.1). Um eine Optimierung der
proteolytischen Spaltungen und der Peptidextraktion zu ermöglichen, sollte daher die radioaktive
Markierung der phosphorylierten p110?-Untereinheit zur Quantifizierung von Verlusten
bei allen Schritten der Probenbearbeitung (Abb. 15) sowie zur Bestimmung der
Effektivität der Rückgewinnung von Phosphopeptiden nach Spaltungen mit verschiedenen
Proteasen genutzt werden. Dafür erfolgte nach jedem Schritt der Probenbearbeitung eine
Messung der Cerenkov-Strahlung der verwendeten Lösungen und der Gelstückchen.
Abb. 15: Übersicht über die proteolytische Spaltung Gel-fixierter Proteine
Zur Entfernung von SDS und Coomassie-Farbstoff wurde die in Gelstückchen zerteilte Proteinbande mit Wasser,
Acetonitril-haltigem Puffer sowie Acetonitril gewaschen. Es folgten die Reduktion von Disulfidbrücken und die
Alkylierung von Cystein-Resten sowie weitere Waschschritte zur Entfernung der Reduktions- und Alkylierungs-
Reagenzien. Anschließend wurden die Gelstückchen mit Protease-Lösung versetzt, die Spaltung erfolgte über
Nacht. Zur Extraktion der Peptide wurde 0,5 % (v/v) TFA in Acetonitril zugesetzt. Die Peptidlösung wurde zur
Entfernung des Lösungsmittels in der Vakuumzentrifuge eingeengt. Anschließend erfolgte die Auftrennung des
Peptidgemisches durch reversed phase-HPLC (Details siehe Methodenteil).
Ergebnisse
56
5.2.2.2.1 Effektivität der Gewinnung von Phosphopeptiden nach proteolytischer
Spaltung der Gel-fixierten phosphorylierten p110 ?-Untereinheit
Zunächst wurden die der eigentlichen Protease-Spaltung vorangehenden Wasch-, Reduktions-
und Alkylierungsschritte untersucht (siehe Abb. 15 und Tab. 7).
Tab. 7: Radioaktivitätsverlust während der Reduktion und Alkylierung der Gel-fixierten
phosphorylierten p110?-Untereinheit vor der Protease-Spaltung
Die Cerenkov-Strahlung der jeweiligen Lösungen wurde gemessen, die Ausgangsaktivität der Gelstückchen
betrug 100 %. Nach den Probenbearbeitungsschritten betrug die Aktivität der Gelstückchen 94,45 ± 1,20 % der
Ausgangsaktivität. Aufgeführt sind Mittelwerte (± S.D.) aus drei unabhängigen Experimenten.
Die Ergebnisse zeigten, dass bei diesen Operationen kaum Radioaktivität aus dem Gel herausgelöst
wurde, d.h. mehr als 90 % des radioaktiv markierten Proteins verblieben im Gel. Da
abgespaltenes Phosphat leicht löslich sein sollte, war eine Dephosphorylierung der p110?-
Untereinheit während der Reduktion und Alkylierung unwahrscheinlich. Nun erfolgten die
Protease-Spaltung mit den Endoproteinasen LysC, GluC und AspN und die Extraktion der
Phosphopeptide aus dem Gel (Abb. 16). Auf die Verwendung von Trypsin wurde verzichtet,
da die entstehenden Peptide im Vergleich zu LysC durch zusätzliche Spaltungen, die Cterminal
von Arginin-Resten stattfinden, noch kleiner wären und anhand der Auftrennung im
Tris/Tricin/SDS-Gradientengel (siehe 5.2.2.1.1) schon nach Spaltung mit LysC eher kleine
Phosphopeptide zu erwarten wären.
Nach der Spaltung mit AspN und GluC konnten radioaktiv markierte Peptide in
unterschiedlichem Ausmaß aus dem Gel extrahiert werden (siehe Abb. 16 links und Mitte).
Während nach der AspN-Spaltung durch Extraktion der Gelstückchen mit 0,5 % (v/v) TFA in
Acetonitril etwa 50 % der Radioaktivität gewonnen wurden (siehe Abb. 16 links, B), verblieben
nach Spaltung mit GluC mehr als 75 % der Radioaktivität im Gel (siehe Abb. 16
Mitte, B). Das könnte durch die Entstehung großer Phosphopeptide bedingt sein, wie schon in
Abb. 13 gezeigt wurde. Unklar blieb, ob es sich bei den nicht extrahierbaren Phosphopeptiden
um unvollständig gespaltene Peptide handelte, die dasselbe Phosphoserin enthielten wie die
extrahierten Phosphopeptide, oder ob zusätzliche Phosphopeptide aus einem anderen
Probenbearbeitung Radioaktivitätsverlust
Waschschritt mit 50 % (v/v) Acetonitril in 25 mM NH4HCO3 0,30 ± 0,10 %
Waschschritt mit Acetonitril 0,05 ± 0,00 %
Reduktion von Disulfidbrücken mit 10 mM DTT in 100 mM NH4HCO3 0,45 ± 0,05 %
Alkylierung von Cys mit 55 mM Iodacetamid in 100 mM NH4HCO3 0,30 ± 0,10 %
Waschschritt mit 50 % (v/v) Acetonitril in 25 mM NH4HCO3 0,35 ± 0,15 %
Waschschritt mit Acetonitril 0,10 ± 0,05 %
Ergebnisse
57
Sequenzbereich der p110?-Untereinheit auftraten. Eine Extraktion der Gelstückchen mit
0,1 % (w/v) SDS erbrachte keine verbesserte Rückgewinnung von phosphorylierten Peptiden
(nicht gezeigt).
Abb. 16: Rückgewinnungseffizienz radioaktiv markierter Peptide nach Spaltung der Gelfixierten
phosphorylierten p110?-Untereinheit
Die Spaltung der phosphorylierten p110?-Untereinheit wurde mit den aufgeführten Proteasen über Nacht durchgeführt.
Anschließend erfolgte die Extraktion der Peptide entsprechend den Angaben in den Methoden. Die
Cerenkov-Strahlung der jeweiligen Lösungen sowie der Gelstückchen wurde gemessen. A Gelstückchen vor
Zugabe der Protease, B Extrakt mit 0,5 % (v/v) TFA in Acetonitril, C Acetonitril-Extrakt nach dem Einengen in der
Vakuumzentrifuge, D Differenz zwischen C und F (entspricht der Radioaktivität, die auf die HPLC-Säule
gelangte), E in den Gelstückchen nach Extraktion verbliebene Radioaktivität, F im Reaktionsgefäß verbliebene
Radioaktivität nach Entnahme der Peptidlösung.
Problematisch waren Verluste an radioaktiv markierten Peptiden während des Einengens in
der Vakuumzentrifuge sowie durch Adsorption an den Wänden des Reaktionsgefäßes (siehe
Abb. 16 B, C, F), so dass nur 25-45 % (siehe Abb. 16 D) der extrahierten Radioaktivität auf
die HPLC-Säule geladen werden konnten. Eine Extraktion der Peptide mit einem kleinen
Volumen einer wässrigen Lösung wie es Speicher und Mitarbeiter (2000) vorschlugen, um die
genannten Verluste zu vermeiden, erschien uns nicht zweckmäßig, da so die Adsorption an
Oberflächen eher erhöht würde und eine Extraktion hydrophober Peptide kaum gelänge. Ein
Einengen der peptidhaltigen Lösung war nicht zu vermeiden, da die Entfernung von
Acetonitril notwendig war und nur sehr kleine Probenvolumina auf die HPLC-Säule geladen
werden konnten. Die Ergebnisse zeigten, dass durch unvollständige Extraktion der Peptide
und Verluste bei der Aufarbeitung der Extrakte höchstens 10-20 % der nach der Spaltung im
Gel vorliegenden Peptide einer chromatographischen Auftrennung und anschließenden
massenspektrometrischen Analyse zugänglich waren. Daher musste eine entsprechend hohe
Ausgangsmenge der phosphorylierten p110?-Untereinheit (ca. 100-150 pmol) eingesetzt
werden, um eine für die massenspektrometrische Analyse ausreichende Menge an phosphorylierten
Peptiden auf die HPLC-Säule laden zu können.
Ergebnisse
58
5.2.2.2.2 Isolierung von Phosphopeptiden durch reversed phase-HPLC
Die extrahierten Peptide wurden mit Hilfe einer reversed phase-HPLC aufgetrennt und die
erhaltenen Fraktionen auf Radioaktivität untersucht. Während nach Spaltung mit LysC die
gesamte Radioaktivität im Durchlauf erschien (nicht gezeigt), konnten nach Spaltung mit
GluC und AspN radioaktiv markierte Phosphopeptide auf der Säule retiniert werden, die in
späteren Fraktionen eluierten (Abb. 17). Allerdings war dies nicht quantitativ, denn auch hier
band ein großer Teil der Radioaktivität nicht an die C18-Säule. Bei der nicht gebundenen
Radioaktivität könnte es sich um sehr kleine, hydrophile Peptide handeln (Neubauer und
Mann, 1999).
Abb. 17: Auftrennung der nach Protease-Spaltung entstandenen Peptidgemische mittels
reversed phase-HPLC
Die nach der Protease-Spaltung mit 0,5 % (v/v) TFA in Acetonitril aus dem Gel extrahierten Peptide wurden auf
eine C18-Säule (Vydac 218 TP 5115, 150 x 1,0 mm, 5 µm) geladen. Die Elution erfolgte mit einem linearen
Acetonitril-Gradienten (4-76 % (v/v) Acetonitril in 0,1 % (v/v) Ameisensäure, 90 min, 76 % (v/v) Acetonitril in 0,1 %
(v/v) Ameisensäure, 5 min, 76-4 % (v/v) Acetonitril in 0,1 % (v/v) Ameisensäure, 2 min) mit einem Fluß von
30 µl/min in Fraktionen á 30 µl. Die Cerenkov-Strahlung der einzelnen Fraktionen wurde gemessen.
Von den Radioaktivität enthaltenden Fraktionen wurden MALDI-MS-Spektren aufgenommen.
Nach GluC-Spaltung konnte in Fraktion 52 (siehe Abb. 17 links) im Linear-Modus
ein 3536,45 Da schweres Peptid nachgewiesen werden (nicht gezeigt), dessen Masse mit einer
Abweichung von 0,46 Da dem phosphorylierten C-Terminus der p110?-Untereinheit entsprach
(1074VCRDKGWTVQFNWFLHLVLGIKQGEKHSA1102, eine Fehlspaltung). Das Cterminale
Phosphopeptid ohne Fehlspaltung (1099KHSA1102, m/z (kalkuliert) 522,24 Da) war
zu klein, um mittels MALDI-MS erfassbar zu sein. Vermutlich war auch die Hydrophobie
dieses Peptids für eine Bindung an die C18-Säule zu gering. Das könnte den großen Anteil an
Radioaktivität im Durchlauf erklären (siehe Abb. 17 links).
Nach AspN-Spaltung konnte außer im Durchlauf ein großer Teil der Radioaktivität in
Fraktion 53 nachgewiesen werden (siehe Abb. 17 rechts). Ein MALDI-MS-Spektrum dieser
Fraktion im Reflektions-Modus ist in Abb. 18 dargestellt.
Ergebnisse
59
Abb. 18: MALDI-MS-Spektrum nach Spaltung der phosphorylierten p110?-Untereinheit mit
AspN
Die nach AspN-Spaltung und Auftrennung des Peptidgemisches mittels reversed phase-HPLC identifizierte,
Radioaktivität enthaltende Fraktion 53 wurde in der Vakuumzentrifuge auf ca. 1 µl eingeengt und mit 1 µl ACHCMatrix-
Lösung (8 mg/ml ?-Cyano-4-hydroxyzimtsäure in 0,3 % TFA/ 70 % (v/v) Acetonitril) vermischt direkt auf die
Probenplatte gebracht. Dargestellt ist ein MALDI-MS-Spektrum im Reflektions-Modus. Die dem phosphorylierten
C-Terminus der p110?-Untereinheit entsprechende Masse ist markiert.
Ein 3118,66 Da schweres Peptid entsprach wiederum dem phosphorylierten C-Terminus der
p110?-Untereinheit (1077DKGWTVQFNWFLHLVLGIKQGEKHSA1102, ohne Fehlspaltung,
m/z (kalkuliert) 3118,60 Da). Dieses Peptid konnte auch im Linear-Modus nachgewiesen
werden. Anhand der Größe des Phosphopeptids werden die Verluste während der Extraktion
der Peptide aus dem Gel und der Aufarbeitung des Extrakts verständlich, da große Peptide
stärker an Oberflächen adsorbieren. Wegen der Größe des Peptids war eine Sequenzierung
und damit Identifizierung der phosphorylierten Aminosäure nicht möglich.
In einem weiteren Versuchsansatz wurde die phosphorylierte p110?-Untereinheit mit
Chymotrypsin gespalten, da hierbei ein kleineres C-terminales Fragment (1093GIKQGE
KHSA1102, m/z des Phosphopeptids (kalkuliert) 1134,56 Da) entstehen würde, was eine
Sequenzierung des Peptids erleichtern würde. Die entstandenen Phosphopeptide konnten
leicht extrahiert werden (siehe Abb. 16 rechts) und wurden mit Hilfe einer reversed phase-
HPLC aufgetrennt (Abb. 19). Im Gegensatz zu den Spaltungen mit LysC, GluC und AspN
erschien nach Spaltung mit Chymotrypsin nur wenig Radioaktivität im Durchlauf. Dies ließ
darauf schließen, dass die Phosphopeptide für die Retention auf dem gewählten Säulenmaterial
eine hinreichende Größe und Hydrophobie aufwiesen. Der Hauptteil der Radioaktivität
konnte in Fraktion 10 nachgewiesen werden. Im MALDI-MS-Spektrum dieser
Fraktion (Abb. 20) konnte ein 1134,56 Da schweres Peptid detektiert werden, was dem phosphorylierten
C-Terminus der p110?-Untereinheit entsprach.
Ergebnisse
60
Abb. 19: Auftrennung des nach Chymotrypsin-Spaltung entstandenen Peptidgemisches
mittels reversed phase-HPLC
Die nach der Protease-Spaltung mit 0,5 % (v/v) TFA in Acetonitril aus dem Gel extrahierten Peptide wurden auf
eine C18-Säule (Vydac 218 TP 5115, 150 x 1,0 mm, 5 µm) geladen. Die Elution erfolgte mit einem linearen
Acetonitril-Gradienten (4-64 % (v/v) Acetonitril in 0,1 % (v/v) Ameisensäure, 60 min, 64 % (v/v) Acetonitril in 0,1 %
(v/v) Ameisensäure, 5 min, 64-4 % (v/v) Acetonitril in 0,1 % (v/v) Ameisensäure, 2 min) mit einem Fluß von
30 µl/min in Fraktionen á 30 µl. Die Cerenkov-Strahlung der einzelnen Fraktionen wurde gemessen.
Abb. 20: MALDI-MS-Spektrum nach Spaltung der p110?-Untereinheit mit Chymotrypsin
Die nach Chymotrypsin-Spaltung und Auftrennung des Peptidgemisches mittels reversed phase-HPLC identifizierte,
Radioaktivität enthaltende Fraktion 10 wurde in der Vakuumzentrifuge auf ca. 1 µl eingeengt und mit 1 µl
ACHC-Matrix-Lösung vermischt direkt auf die Probenplatte gebracht. Dargestellt ist ein MALDI-MS-Spektrum im
Reflektions-Modus. Die dem phosphorylierten C-Terminus der p110?-Untereinheit entsprechende Masse ist
markiert.
In den ebenfalls Radioaktivität enthaltenden Fraktionen 21 und 30 wurden Peptide mit
Massen nachgewiesen, die den Massen phosphorylierter C-terminaler Peptide mit Fehlspaltungen
entsprachen (Tab. 8). In den später eluierenden Fraktionen, die Radioaktivität enthielten,
konnten keine weiteren Phosphopeptide identifiziert werden. Die Ursache hierfür
könnte in der Größe dieser Peptide liegen, die eine schlechte massenspektrometrische Detek-
Ergebnisse
61
tierbarkeit bedingt. Zusammen enthielten die Fraktionen 10, 21 und 30 mehr als 80 % der von
der HPLC-Säule eluierten Radioaktivität. Dies macht die Existenz einer zweiten
Phosphorylierungsstelle wenig wahrscheinlich.
Tab. 8: C-terminale Phosphopeptide der p110?-Untereinheit nach Chymotrypsin-Spaltung
Fraktion m/z
(kalkuliert)
m/z
(bestimmt) Peptidsequenz Fehlspaltungen
10 1134,56 Da 1134,56 Da 1093GIKQGEKHSA1102 0
21 1346,72 Da 1346,75 Da 1091VLGIKQGEKHSA1102 1
30 1709,94 Da 1709,92 Da 1088LHLVLGIKQGEKHSA1102 3
Somit konnten nach Spaltung der phosphorylierten p110?-Untereinheit mit GluC, AspN und
Chymotrypsin verschiedene Peptide nachgewiesen werden, die in ihrer Masse phosphorylierten
C-terminalen Fragmenten der p110?-Untereinheit entsprachen. Da in diesem
Sequenzabschnitt der p110?-Untereinheit ein Serin-Rest nur in Position 1101 vorhanden ist
(siehe Tab. 8), kann vermutet werden, dass die Phosphorylierung an Serin1101 erfolgt. Zur
Überprüfung dieser Annahme sollte das 1134,56 Da schwere chymotryptische Peptid
sequenziert werden.
5.2.2.3 Massenspektrometrische Sequenzierung eines C-terminalen Phosphopeptids
der p110 ?-Untereinheit
Die Sequenzierung erfolgte mittels des in unserer Arbeitsgruppe bereits erfolgreich angewandten
Verfahrens der Nanoelektrospray-Ionisierungs-Tandem-Massenspektrometrie (nESIMS/
MS, Exner et al., 1999). Bei dieser Methode werden die durch Elektrospray-Ionisierung
gebildeten Primärionen, die häufig mehrfach geladen sind, durch Kollision mit Argon-
Atomen an ihren Peptidbindungen gespalten (Abb. 21, Roepstorff und Fohlmann, 1984).
Abb. 21: Fragmentionen
Fragmentierungen treten hauptsächlich an den Peptidbindungen
entlang der Peptidkette auf. Verbleibt die Ladung an den Fragmenten
der N-terminalen Serie, werden diese als a- bzw. b-Ionen bezeichnet,
während die Fragmentionen der C-terminalen Serie als y’’- bzw. z-
Ionen bezeichnet werden. Ein zusätzlicher Index gibt die Zahl der im
Fragment enthaltenen Aminosäure-Reste an (Roepstorff und Fohlmann,
1984, Biemann und Scoble, 1987).
Anhand der Größe dieser Fragmentionen kann auf die Sequenz des Peptids geschlossen
werden. Charakteristische Differenzen zwischen bestimmten Fragmentmassen weisen dabei
auf Modifizierungen hin. So kann aus Peptiden, die an Serin- oder Threonin-Resten phosphoryliert
sind, unter Bildung von Dehydroaminosäuren H3PO4 abgespalten werden, was eine
Massendifferenz von 98 Da zwischen dem Phosphat-haltigen und dem Dehydroaminosäure-
Ergebnisse
62
Fragment zur Folge hat (Annan et al., 2001). Das nESI-MS/MS-Spektrum des 1134,56 Da
schweren C-terminalen chymotryptischen Peptids aus Fraktion 10 des HPLC-Laufs ist in
Abb. 22 dargestellt.
Abb. 22: nESI-MS/MS-Spektrum des Phosphopeptids GIKQGEKHpSA
Das 568,27 Da schwere Fragment konnte dem zweifach geladenen C-terminalen Phosphopeptid 1093GIKQGE
KHpSA1102 zugeordnet werden. Die y’’-Ionen des Spektrums sind durch aufeinanderfolgende Fragmentierungsreaktionen
mit Spaltung der Amid-Bindung und Neutralverlust von H3PO4 entstanden.
Das 568,27 Da schwere Ion entsprach in seiner Masse dem zweifach geladenen C-terminalen
Phosphopeptid 1093GIKQGEKHpSA1102. Durch Abspaltung von H3PO4 (98 Da) aus diesem
Peptid entstand das entsprechende, zweifach geladenene Dehydroaminosäure-Fragment
(518,77 Da). Dies zeigte, dass es sich bei dem untersuchten Peptid tatsächlich um ein Phosphopeptid
handelte. Anhand der Fragmentionen vom y’’- und z-Typ konnte geschlossen
werden, dass die Sequenz des untersuchten Peptids dem C-Terminus der p110?-Untereinheit
entsprach. Weiterhin wurde aus allen nachgewiesenen C-terminalen Fragmentionen (y2’’,
y3’’, y6’’, z7, y8’’, siehe Abb. 22) H3PO4 abgespalten. Da somit auch das y2’’-Fragmention
(1101SA1102) einen Phosphat-Rest enthielt, konnte Serin1101 als Substrat für die Autophosphorylierung
der p110?-Untereinheit identifiziert werden.
5.2.3 Lipid- und Proteinkinase-Aktivität von PI-3-Kinase ?-Mutanten
Um die durch massenspektrometrische Analyse gefundene Phosphorylierung der p110?-
Untereinheit an Serin1101 zu überprüfen, wurde eine Mutante erzeugt, bei der Serin1101 durch
Alanin ersetzt wurde und die daher an dieser Stelle nicht mehr phosphoryliert werden konnte.
Die Proteinkinase-Aktivität dieser Mutante wurde im Vergleich zur nicht modifizierten PI-3-
Kinase ??bestimmt (Abb. 23). Nach Austausch des Serin-Restes gegen Alanin konnte keine
Stimulation der Autophosphorylierung der p110?-Untereinheit durch G??-Komplexe beobachtet
werden. Das lässt den Schluß zu, dass die G??-stimulierte Autophosphorylierung der
p110?-Untereinheit an Serin1101 erfolgt.
Ergebnisse
63
Abb. 23: Proteinkinase-Aktivität der p110?S1101A-Mutante
Gereinigte heterodimere PI-3-Kinase ?, die entweder die unmodifizierte p110?-Untereinheit (Ser) oder eine
p110?S1101A-Untereinheit (Ala) enthielt, wurde auf den Einbau von radioaktiv markiertem 32P-Phosphat in An-
(+) und Abwesenheit (-) von 120 nM G?1?2-His untersucht. Die Messungen wurden entsprechend den Angaben in
den Methoden durchgeführt. Gezeigt ist ein repräsentatives Autoradiogramm.
Weiterhin wurden p110?-Mutanten erzeugt, die anstelle von Serin1101 die negativ geladenen
Aminosäuren Asparagin- bzw. Glutaminsäure enthielten. Diese Substitution sollte den Effekt
einer Phosphorylierung an dieser Position des Proteins nachahmen (Vanhaesebroeck et al.,
1999a). Die basale sowie die G??-stimulierte Lipidkinase-Aktivität der Aspartat-, Glutamat-
und Alanin-Mutanten wurde im Vergleich zur Wildtyp-PI-3-Kinase ??bestimmt (Abb. 24).
Abb. 24: Lipidkinase-Aktivität von p110?S1101-Mutanten
Die Lipidkinase-Aktivität der gereinigten heterodimeren PI-3-Kinase ?, die entweder die unmodifizierte p110?-
Untereinheit (Ser) oder eine mutierte p110?-Untereinheit (p110?S1101A = Ala, p110?S1101D = Asp,
p110?S1101E = Glu) enthielt, wurde in An- (+) und Abwesenheit (-) von 120 nM G?1?2-His untersucht. Die
Isolation, Trennung und Quantifizierung von 32P-markiertem PI-3,4,5-P3 wurde entsprechend den Angaben in
den Methoden durchgeführt. Gezeigt sind ein repräsentatives Autoradiogramm sowie die Mittelwerte (± S.D.) aus
drei Experimenten.
Sowohl das unveränderte Protein als auch die Alanin-Mutante zeigten dieselbe Lipidkinase-
Aktivität, was den Schluß zulässt, dass Serin1101 für die katalytische Aktivität der p110?-
Untereinheit nicht essentiell ist. Weiterhin wurde deutlich, dass durch Austausch des Serin-
Restes gegen Asparagin- bzw. Glutaminsäure weder die basale noch die G??-stimulierte
Lipidkinase-Aktivität des Enzyms beeinflusst wurde. Das bestätigte und erweiterte den durch
Präphosphorylierung der unmodifizierten PI-3-Kinase ??erhobenen Befund (siehe 5.1.3).
Ergebnisse
64
Beim Vergleich der Proteinkinase-Aktivität der PI-3-Kinase-Isoformen ??(hier untersucht)
und ??(Vanhaesebroeck et al., 1999a) läßt sich feststellen, dass die Autophosphorylierung an
einem Serin-Rest im extremen C-Terminus der p110-Untereinheit offenbar unterschiedliche
Effekte auf die Lipidkinase-Aktivität des Enzyms haben kann. Dies veranlasste uns, die
Autophosphorylierung der PI-3-Kinase ??näher zu untersuchen, die eine große strukturelle
Ähnlichkeit zur PI-3-Kinase ??aufweist, deren Lipidkinase-Aktivität jedoch nicht nur durch
RTKs, sondern auch, wie bei der PI-3-Kinase ???durch G??-Komplexe stimuliert werden kann
(Maier et al., 1999).
5.3 Proteinkinase-Aktivität der PI-3-Kinase ?
5.3.1 Charakterisierung der Autophosphorylierung der PI-3-Kinase ?
Über die Proteinkinase-Aktivität der PI-3-Kinase ??ist wenig bekannt. Roche und Mitarbeiter
(1998) konnten nach Zugabe eines großen Überschusses der gereinigten p85-Untereinheit zur
PI-3-Kinase ??eine Phosphorylierung der p85-Untereinheit beobachten. Auch nach Expression
der PI-3-Kinase ??in HEK293-Zellen konnte eine in vitro- und in vivo-Phosphorylierung
der p85-Untereinheit nachgewiesen werden (Beeton et al., 2000). Das spricht dafür, dass die
Proteinkinase-Aktivität der PI-3-Kinase ?, wie auch der PI-3-Kinase ???eine Phosphorylierung
der regulatorischen p85-Untereinheit bewirkt (Dhand et al., 1994). Betrachtet man
jedoch die strukturelle Verwandtschaft der katalytischen Untereinheiten der p85-assoziierten
PI-3-Kinase-Isoformen ?, ??und ?, so weisen die p110?- und die p110?-Untereinheit mit
56 % die größte Aminosäureidentität auf. Beim Vergleich der C-terminalen Aminosäuresequenzen
aller vier p110-Untereinheiten (Abb. 25) fällt weiterhin auf, dass die p110??–
ebenso wie die p110?- und p110?-Untereinheit – im extremen C-Terminus einen Serin-Rest
aufweist. Die beiden letztgenannten PI-3-Kinase-Isoformen werden an diesen Serin-Resten
phosphoryliert (siehe 5.2.2 und Vanhaesebroeck et al., 1999a), während die PI-3-Kinase ?,
die in diesem Sequenzbereich kein Serin besitzt, die regulatorische p85-Untereinheit
phosphoryliert (Dhand et al., 1994).
Abb. 25: C-terminale Aminosäuresequenz der p110-Untereinheiten
Konservierte Aminosäuren sind grau unterlegt. Die phosphorylierten Serin-Reste der p110?- und p110?-Untereinheit
sind fett markiert und unterstrichen.
Ergebnisse
65
Unter strukturellen Gesichtspunkten wäre somit nicht nur eine Phosphorylierung der p85-
Untereinheit, sondern auch eine Autophosphorylierung der p110?-Untereinheit vorstellbar.
Um dies zu prüfen, wurde die Proteinkinase-Aktivität der aus Sf9-Zellen gereinigten heterodimeren
PI-3-Kinase ??in Anwesenheit von Phosphoinositid-freien Phospholipid-Vesikeln
untersucht. Da für die p85-assoziierten PI-3-Kinase-Isoformen ??und ??eine Mn2+-Abhängigkeit
der Proteinkinase-Aktivität beschrieben wurde (Dhand et al., 1994, Vanhaesebroeck
et al., 1997), während die Autophosphorylierung der PI-3-Kinase ??in Anwesenheit von Mg2+
abläuft (Maier et al., 1999), sollte zunächst die Metallionen-Abhängigkeit der Autophosphorylierung
der PI-3-Kinase ??überprüft werden (Abb. 26).
Abb. 26: Metallionen-Abhängigkeit der Proteinkinase-Aktivität von Klasse I PI-3-Kinasen
Rekombinante gereinigte His-p110?/p85, GST-p110?/p85 und His-p110?/p101 wurden auf den Einbau von radioaktiv
markiertem 32P-Phosphat in Anwesenheit von 7 mM Mg2+ bzw. 2 mM Mn2+ untersucht. Für die PI-3-
Kinase ??erfolgte die Messung in An- (+) bzw. Abwesenheit (-) von 120 nM G?1?2-His. Dargestellt sind jeweils ein
Coomassie-gefärbtes Protein-Gel der affinitätschromatographisch gereinigten PI-3-Kinase sowie repräsentative
Autoradiogramme.
In Anwesenheit von Mg2+ zeigte die PI-3-Kinase ??nur eine schwache Proteinkinase-Aktivität,
die in Anwesenheit von Mn2+ deutlich erhöht war (siehe Abb. 26 links). In beiden Fällen
wurde die p110?-Untereinheit autophosphoryliert. In Anwesenheit von Mn2+ war zusätzlich
ein Einbau von Phosphat in die p85-Untereinheit zu beobachten, der jedoch nur etwa 15 %
des Phosphat-Einbaus in die p110?-Untereinheit betrug. Im Vergleich dazu konnte bei der PI-
3-Kinase ??(siehe Abb. 26 Mitte) eine Phosphorylierung der p85-Untereinheit beobachtet
werden, die die Phosphat-Inkorporation in die p110?-Untereinheit bei weitem übertraf. Der
Vergleich mit der Autophosphorylierung der p110?-Untereinheit (Abb. 26 rechts) machte
auch deutlich, dass sich die Proteinkinase-Aktivität der PI-3-Kinase ??in ihrer Metallionen-
Abhängigkeit wie die übrigen p85-assoziierten PI-3-Kinase-Isoformen verhielt und damit ein
anderes Verhalten als die Klasse IB PI-3-Kinase ??zeigte.
Es ist bekannt, dass die Lipidkinase-Aktivität der PI-3-Kinase ??sowohl durch G??-
Komplexe als auch durch von verschiedenen RTKs abgeleitete Phosphotyrosin-Peptide
stimuliert werden kann (Kurosu et al., 1997, Maier et al., 1999). Daher sollte geprüft werden,
ob die Proteinkinase-Aktivität der PI-3-Kinase ??ebenfalls gegenüber diesen Stimuli sensitiv
ist. Dazu wurde die Autophosphorylierung der p110?-Untereinheit in Gegenwart von
Ergebnisse
66
steigenden Mengen G?1?2-His bzw. eines vom PDGF-Rezeptor abgeleiteten Phosphotyrosin-
Peptids bestimmt (Abb. 27).
Abb. 27: Sensitivität der Lipid- und Proteinkinase-Aktivität der PI-3-Kinase ??gegenüber G?????
und Phosphotyrosin-Peptid
Heterodimere PI-3-Kinase ??wurde auf ihre Stimulierbarkeit mit steigenden Konzentrationen G?1?2-His (links) bzw.
Phosphotyrosin-Peptid (rechts) untersucht. Zur Bestimmung der Lipidkinase-Aktivität (!) wurde die Bildung von
32P-markiertem PI-3,4,5-P3 in Anwesenheit von 7 mM Mg2+ als Vielfaches des Basalwertes gemessen. In einem
parallelen Ansatz wurde die Stimulation der Autophosphorylierung (") der p110?-Untereinheit in Anwesenheit
von 2 mM Mn2+ bestimmt. Gemessen wurde der Einbau von radioaktivem Phosphat in die katalytische p110?-
Untereinheit als Vielfaches des Basalwertes. Dargestellt sind repräsentative Autoradiogramme sowie die Mittelwerte
(± S.D.) aus drei Versuchen.
Während G?1?2-His-Komplexe die Lipidkinase-Aktivität der PI-3-Kinase ??mit einem EC50-
Wert von ca. 20 nM stimulierten, konnte selbst mit 100-fach höheren Konzentrationen von
G?1?2-His keine Stimulation der Proteinkinase-Aktivität der PI-3-Kinase ??erzielt werden
(siehe Abb. 27 links). Auch durch Inkubation mit dem Phosphotyrosin-Peptid konnte die
Proteinkinase-Aktivität der PI-3-Kinase ??nicht aktiviert werden, obwohl die Stimulation der
Lipidkinase-Aktivität mit einem EC50-Wert von ca. 5 nM erfolgte (siehe Abb. 27 rechts). Bei
weiteren Versuchen in Anwesenheit unterschiedlicher Konzentrationen von Mn2+ oder Mg2+
oder von Gemischen beider Kationen konnte ebenfalls keine signifikante Stimulation der
Proteinkinase-Aktivität der PI-3-Kinase ??durch G??-Komplexe oder Phosphotyrosin-Peptid
beobachtet werden (nicht gezeigt). Demnach ist die Autophosphorylierung der p110?-Untereinheit
im Gegensatz zur p110?-Untereinheit zumindest in vitro unter Versuchsbedingungen,
die eine Stimulation der Lipidkinase-Aktivität der PI-3-Kinase-Isoformen ??und ??sowie der
Proteinkinase-Aktivität der PI-3-Kinase ??erlaubten, nicht stimulierbar.
Diese fehlende Stimulierbarkeit der Proteinkinase-Aktivität der PI-3-Kinase ??könnte
darauf zurückzuführen sein, dass bereits unter Basalbedingungen ein hoher Phosphat-Einbau
Ergebnisse
67
in die p110?-Untereinheit stattfindet, der durch Zugabe von G??-Komplexen oder Phosphotyrosin-
Peptid nicht weiter erhöht werden kann. Um dies zu prüfen, sollte die Stöchiometrie
der Autophosphorylierung der p110?-Untereinheit bestimmt werden. Dafür wurde der
Zeitverlauf der Autophosphorylierung der p110?-Untereinheit untersucht (Abb. 28).
Abb. 28: Zeitverlauf der Autophosphorylierung der p110?-Untereinheit
Die Proteinkinase-Aktivität der PI-3-Kinase ??wurde in Gegenwart von 2 mM Mn2+ unter Basalbedingungen ("),
in Anwesenheit von 120 nM G?1?2-His (!), 100 nM Phosphotyrosin-Peptid (#) sowie beider Stimuli ($) entsprechend
den Angaben in den Methoden bestimmt. Dargestellt ist ein repräsentatives von drei Experimenten.
Die Geschwindigkeit der Autophosphorylierung der p110?-Untereinheit war relativ gering,
der maximale Phosphat-Einbau wurde erst nach etwa 30 min erreicht. Durch Zugabe von
G??-Komplexen oder Phosphotyrosin-Peptid konnte die Geschwindigkeit der Autophosphorylierung
der p110?-Untereinheit nicht erhöht werden. Das bestätigte unseren Befund, dass
die Autophosphorylierung der p110?-Untereinheit nicht stimulierbar ist. Der Zeitverlauf war
mit der Autophosphorylierung der p110?-Untereinheit vergleichbar (siehe Abb. 9). Im Gegensatz
zur Stöchiometrie der Autophosphorylierung der p110?-Untereinheit, die ca. 1 mol Phosphat
pro mol p110??betrug (siehe 5.1.2), wurde für die Autophosphorylierung der p110?-
Untereinheit eine wesentlich niedrigere Stöchiometrie des Phosphat-Einbaus von 0,38 –
0,59 mol Phosphat pro mol p110??(n = 4) ermittelt.
5.3.2 Identifizierung der Phosphorylierungsstelle der p110 ?-Untereinheit
Nun sollte geprüft werden, ob die Autophosphorylierung der p110?-Untereinheit ebenfalls an
einem Serin-Rest im extremen C-Terminus des Proteins erfolgt. Hierfür sollten wiederum
massenspektrometrische Methoden zur Anwendung kommen. Anhand der Aminosäuresequenz
der p110?-Untereinheit sowie der Spaltungsmuster der verschiedenen Endoproteinasen
(siehe 5.2.2.1) erschien keine Protease dazu geeignet, C-terminale Peptide geeigneter
Ergebnisse
68
Größe zu erzeugen. Daher wurde eine Spaltung des Gel-fixierten Proteins mit CNBr
durchgeführt. Hierbei werden Peptidbindungen C-terminal von Methionin unter Bildung eines
Homoserinlactons gespalten. Nach der Extraktion der Peptide aus dem Gel erfolgten die
Auftrennung des Peptidgemisches mit Hilfe einer reversed phase-HPLC und die Identifizierung
radioaktiver Fraktionen (Abb. 29).
Abb. 29: Auftrennung des nach CNBr-Spaltung der phosphorylierten p110?-Untereinheit
entstandenen Peptidgemisches mittels reversed phase-HPLC
Die nach der CNBr-Spaltung mit 0,5 % (v/v) TFA in Acetonitril aus dem Gel extrahierten Peptide wurden auf eine
C18-Säule (Vydac 218 TP 5115, 150 x 1,0 mm, 5 µm) geladen. Die Elution erfolgte mit einem linearen Acetonitril-
Gradienten (4-64 % (v/v) Acetonitril in 0,1 % (v/v) Ameisensäure, 60 min, 64 % (v/v) Acetonitril in 0,1 % (v/v)
Ameisensäure, 5 min, 64-4 % (v/v) Acetonitril in 0,1 % (v/v) Ameisensäure, 2 min) mit einem Fluß von 30 µl/min in
Fraktionen á 30 µl. Die Cerenkov-Strahlung der einzelnen Fraktionen wurde gemessen.
Der Hauptteil der Radioaktivität konnte in Fraktion 12 nachgewiesen werden. Ein MALDIMS-
Spektrum dieser Fraktion im Reflektions-Modus ist in Abb. 30 dargestellt. Das
1312,65 Da schwere Peptid entsprach dem phosphorylierten C-Terminus der p110?-Untereinheit
(1061AHTVRKDYRS1070, m/z (kalkuliert) 1312,65 Da). Ein weiteres Peptidion mit
einer Masse von 1392,63 Da, jedoch wesentlich geringerer Intensität, könnte auf eine zweifache
Phosphorylierung des C-Terminus hindeuten. Dies könnte einer zusätzlichen Phosphorylierung
an Threonin1063 entsprechen. Da beide Peptide eine ausreichende Signalintensität
aufwiesen, wurden zur näheren Charakterisierung der beiden Peptidionen MALDIPSD-
Spektren aufgenommen. Hierbei werden Fragmentionen, die nach der Beschleunigung
durch Zerfall der Peptidionen in der feldfreien Driftstrecke – der sog. metastabilen Fragmentierung
– entstanden sind, erfasst. Anhand dieser Fragmente können, ähnlich wie bei der
Sequenzierung mittels Tandem-Massenspektrometrie, Hinweise auf die Sequenz des Peptids
gewonnen werden (Metzger und Hoffmann, 2000). Insbesondere konnte bei beiden Peptiden
die Abspaltung eines neutralen Fragments mit einer Masse von 98 Da nachgewiesen werden
Ergebnisse
69
(nicht gezeigt). Diese Massendifferenz entsprach dem Verlust von H3PO4. Das ließ den
Schluß zu, dass die Peptide als Phosphopeptide vorlagen.
Abb. 30: MALDI-MS-Spektrum nach Spaltung der p110?-Untereinheit mit CNBr
Die nach CNBr-Spaltung und Auftrennung des Peptidgemisches mittels reversed phase-HPLC identifizierte
radioaktive Fraktion 12 wurde in der Vakuumzentrifuge auf ca. 1 µl eingeengt und mit 1 µl ACHC-Matrix-Lösung
vermischt direkt auf die Probenplatte gebracht. Dargestellt ist ein MALDI-MS-Spektrum im Reflektions-Modus. Die
dem phosphorylierten C-Terminus der p110?-Untereinheit entsprechenden Massen sind markiert.
Eine komplette Sequenzierung der Peptide mittels MALDI-PSD gelang jedoch nicht. Daher
kam zur Sequenzierung wiederum nESI-MS/MS zum Einsatz. Das Ergebnis der Sequenzierung
des 1312,65 Da schweren Peptids ist in Tab. 9 zusammengefasst.
Tab. 9: Nachgewiesene Fragmentionen des 1312,65 Da schweren Peptids
y’’-Ion m/z (Da) Neutralverlust
(Da) b-Ion m/z (Da) Neutralverlust
(Da)
y3’’ 505,18 407,20 b2 209,10 -
y7’’ 1003,47 905,50 b3 310,15 -
y8’’ 1104,52 1006,54 b5 565,32 -
y9’’ 1241,58 1143,60 b6 693,42 -
b7 808,44 -
b8 971,51 -
b9 1127,61 -
b10 1294,61 1196,63
Anhand der Fragmente, deren Massen den kalkulierten Massen der y’’- bzw. b-Ionen des
phosphorylierten C-Terminus (1061AHTVRKDYRS1070) der p110?-Untereinheit ent-
Ergebnisse
70
sprachen, konnte die Sequenz des Peptids zweifelsfrei bestätigt werden. Aus allen
nachgewiesenen C-terminalen Fragmentionen (y3’’, y7’’, y8’’, y9’’) wurde ein neutrales
Fragment mit einer Masse von 98 Da, H3PO4 entsprechend, abgespalten (Neutralverlust,
siehe Tab. 9). Im Gegensatz dazu zeigte nur das N-terminale b10-Ion, welches das komplette
Peptid repräsentierte, nicht jedoch das b9-Ion mit der Sequenz 1061AHTVRKDYR1069 sowie
alle weiteren b-Ionen, einen Verlust von H3PO4 (siehe Tab. 9). Damit wurde deutlich, dass
die Autophosphorylierung der p110?-Untereinheit an der C-terminalen Aminosäure des
Peptids und damit an Serin1070 erfolgte. Das vermutlich doppelt phosphorylierte, 1392,63 Da
schwere Peptid konnte in den nESI-MS/MS-Experimenten nicht nachgewiesen werden,
womit die Bestätigung einer zweiten Phosphorylierung nicht möglich war.
5.3.3 Lipid- und Proteinkinase-Aktivität von PI-3-Kinase ?-Mutanten
Um zu prüfen, ob die Autophosphorylierung ausschließlich an Serin1070 stattfindet, wurde
eine Mutante erzeugt, bei der Serin1070 durch Alanin ersetzt wurde. Die Proteinkinase-
Aktivität dieser Mutante wurde im Vergleich zur nicht modifizierten PI-3-Kinase ??untersucht
(Abb. 31).
Abb. 31: Proteinkinase-Aktivität der p110?S1070A-Mutante
Gereinigte heterodimere PI-3-Kinase ?, die entweder die unmodifizierte p110?-Untereinheit (Ser) oder eine
p110?S1070A-Untereinheit (Ala) enthielt, wurde auf den Einbau von radioaktiv markiertem 32P-Phosphat
untersucht. Die Messungen wurden entsprechend den Angaben in den Methoden durchgeführt. Gezeigt ist ein
repräsentatives Autoradiogramm.
Nach Austausch des Serin-Restes gegen Alanin war eine massive Abnahme der Autophosphorylierung
der p110?-Untereinheit zu beobachten. Die verbliebene geringfügige Proteinkinase-
Aktivität der mutierten PI-3-Kinase ??ist eventuell auf eine Phosphorylierung von
Threonin1063 zurückzuführen, für die wir in den MALDI-MS-Untersuchungen erste Hinweise
erhielten. Jedoch war wegen des geringen Ausmaßes der Phosphorylierung eine Bestätigung
durch Sequenzierung nicht möglich. Somit können wir schließen, dass die quantitativ
bedeutsamste Autophosphorylierung der p110?-Untereinheit an Serin1070 im extremen CTerminus
des Proteins erfolgt. Es findet also eine zur Autophosphorylierung der PI-3-Kinase-
Isoformen ??und ??analoge Serin-Phosphorylierung statt. Dies warf die Frage auf, welche
Auswirkungen diese Autophosphorylierung auf die Lipidkinase-Aktivität der PI-3-Kinase ?
hat.
Dazu wurden p110?-Mutanten erzeugt, die anstelle von Serin1070 Asparagin- bzw.
Glutaminsäure enthielten (siehe 5.2.3). Die Lipidkinase-Aktivität gereinigter Aspartat-,
Ergebnisse
71
Glutamat- und Alanin-Mutanten wurde im Vergleich zur Wildtyp-PI-3-Kinase ??bestimmt
(Abb. 32).
Abb. 32: Lipidkinase-Aktivität von p110?S1070-Mutanten
Die Lipidkinase-Aktivität der gereinigten heterodimeren PI-3-Kinase ?, die entweder die unmodifizierte p110?-
Untereinheit (Ser) oder eine mutierte p110?-Untereinheit (p110?S1070A = Ala, p110?S1070D = Asp,
p110?S1070E = Glu) enthielt, wurde in Ab- (-) sowie Anwesenheit (+) von 120 nM G?1?2-His, 100nM
Phosphotyrosin-Peptid bzw. beider Stimuli untersucht. Die Isolation, Trennung und Quantifizierung von 32Pmarkiertem
PI-3,4,5-P3 wurde entsprechend den Angaben in den Methoden durchgeführt. Gezeigt sind ein
repräsentatives Autoradiogramm sowie die Mittelwerte (± S.D.) aus drei Experimenten.
Die Alanin-Mutante zeigte eine im Vergleich zum nicht modifizierten Protein verringerte
basale PI-3,4,5-P3-Bildung, während die durch G??-Komplexe, Phosphotyrosin-Peptid sowie
durch beide Stimuli synergistisch aktivierte Lipidkinase-Aktivität mit dem Wildtyp-Enzym
vergleichbar waren. Im Gegensatz dazu wurde durch Austausch des Serin-Restes gegen
Asparagin- bzw. Glutaminsäure sowohl die basale als auch die stimulierte Lipidkinase-
Aktivität des Enzyms deutlich gehemmt. Während die Aspartat-Mutante eine Restaktivität
von etwa 25 % zeigte, wies die Glutamat-Mutante nur noch etwa 10 % der Lipidkinase-
Aktivität des Wildtyp-Enzyms auf. Auffällig war weiterhin, dass die Stabilität der
heterodimeren PI-3-Kinase ?, die eine der mutierten p110?-Untereinheiten enthielt, deutlich
reduziert war.
Somit ist feststellbar, dass die Autophosphorylierung der PI-3-Kinase ??genau wie die
Autophosphorylierung der anderen Klasse IA PI-3-Kinase-Isoformen ??und ??zu einer
Hemmung der Lipidkinase-Aktivität dieser Enzyme führt.
Ergebnisse
72
5.4 Mechanismus der Autophosphorylierung G ?????-sensitiver
PI-3-Kinasen
Es stellte sich nun die Frage nach dem Mechanismus der PI-3-Kinase-Autophosphorylierung.
Die Klasse IA PI-3-Kinase-Isoformen ??und ??sollen nicht in der Lage sein, Peptide, die von
den Phosphorylierungsstellen der p85- bzw. p110?-Untereinheit abgeleitet sind, zu
phosphorylieren (Vanhaesebroeck et al., 1999a). Das spricht dafür, dass die Phosphorylierungsreaktionen
dieser PI-3-Kinase-Isoformen spezifische Protein-Protein-Interaktionen
voraussetzen. Daher sollte geprüft werden, inwieweit die PI-3-Kinase-Isoformen ??und ??in
der Lage sind, Peptidsubstrate zu phosphorylieren. Dazu wurden Peptide synthetisiert, die den
C-Termini der beiden PI-3-Kinasen entsprachen und eine für die massenspektrometrische
Analyse geeignete Größe aufwiesen (Abb. 33). Diese Peptide wurden in Gegenwart von ATP
und den entsprechenden Metallionen (Mn2+ bzw. Mg2+) mit der jeweiligen heterodimeren PI-
3-Kinase inkubiert. Zusätzlich enthielt das Reaktionsgemisch Phospholipid-Vesikel. Im Fall
der PI-3-Kinase ??wurden weiterhin G??-Komplexe zur Stimulation der Proteinkinase-
Aktivität zugegeben. Wie in Abb. 33A und C gezeigt, war bei beiden PI-3-Kinase-Isoformen
auch nach mehrstündiger Inkubation keine Phosphorylierung der C-terminalen Peptide zu
beobachten. Um zu bestätigen, dass mit dem angewendeten Verfahren eine Peptid-Phosphorylierung
durch eine Proteinkinase nachweisbar ist, wurden die Proteinkinasen A (PKA) und
G (PKG) mit ihrem jeweiligen Peptid-Substrat (LRRASLG bzw. GRTGRRNSI) inkubiert
und die Phosphorylierung der Peptide mit der gleichen Methode massenspektrometrisch
bestimmt. Bereits nach 30-minütiger Inkubation konnte eine vollständige (PKA) bzw.
deutliche (PKG) Phosphorylierung der Peptide nachgewiesen werden (nicht gezeigt). Daher
war die Methode zur Bestimmung von Peptid-Phosphorylierungen geeignet.
Weiterhin wurde der Einfluß der C-terminalen Peptide auf die Autophosphorylierung
der p110?- und p110?-Untereinheit untersucht. Dazu wurde die Proteinkinase-Aktivität der
beiden PI-3-Kinase-Isoformen in Gegenwart steigender Mengen des jeweiligen C-terminalen
Peptids bestimmt. In Abb. 33B ist gezeigt, dass die Autophosphorylierung der p110?-
Untereinheit auch bei höchsten Peptid-Konzentrationen unbeeinflusst blieb. Weiterhin wurde
das Ausmaß der basalen und der G??-stimulierten Autophosphorylierung der p110?-Untereinheit
durch Inkubation mit dem C-terminalen Peptid nicht verändert (siehe Abb. 33D). Aus
beiden Befunden lässt sich schließen, dass weder die PI-3-Kinase ??noch die PI-3-Kinase ?
mit Peptid-Substraten wechselwirken und diese auch nicht phosphorylieren können.
Um weiterhin zu prüfen, ob der Autophosphorylierung der PI-3-Kinase ??ein
Transphosphorylierungs- oder ein „echter“ Autophosphorylierungs-Mechanismus zugrunde
liegt, wurde gereinigte heterodimere PI-3-Kinase ??(His-p110?/p101) mit einer p110?-Mutante
(GST-p110?K833R) inkubiert, die weder eine Lipid- noch eine Proteinkinase-Aktivität besitzt
(Stoyanova et al., 1997).
Ergebnisse
73
Abb. 33: Proteinkinase-Aktivität der PI-3-Kinase-Isoformen ??und ??in Gegenwart C-terminaler
Peptide
A/C Die C-terminalen Peptide der p110?- (A) bzw. p110?-Untereinheit (C) wurden in Gegenwart von Phospholipid-
Vesikeln, ATP und den entsprechenden Metallionen (Mn2+ bzw. Mg2+) mit der heterodimeren PI-3-Kinase ?
(A) bzw. der heterodimeren PI-3-Kinase ??und G??-Komplexen (C) inkubiert. Anschließend wurden MALDI-MSSpektren
der Peptidmischungen aufgenommen. Die Massen der phosphorylierten Peptide sind mit einem Pfeil
markiert. B/D Die Proteinkinase-Aktivität der PI-3-Kinase ??(B) bzw. ??(D) wurde in Gegenwart steigender Mengen
der entsprechenden C-terminalen Peptide sowie im Fall der PI-3-Kinase ??in An- (+) und Abwesenheit (-) von
120 nM G?1?2-His entsprechend den Angaben in den Methoden bestimmt. Dargestellt ist jeweils ein typisches
Autoradiogramm eines von drei Versuchen.
Ergebnisse
74
Abb. 34: Mechanismus der Autophosphorylierung der PI-3-Kinase ?
Die Proteinkinase-Aktivität der gereinigten heterodimeren PI-3-Kinase ??(His-p110?/p101) und der Kinaseinaktiven
Mutante GST-p110?K833R wurde entweder allein oder nach Koinkubation der beiden Enzyme in An- (+)
und Abwesenheit (-) von 120 nM G?1?2-His entsprechend den Angaben in den Methoden bestimmt. Zur
Markierung der Laufhöhe von phosphorylierter GST-p110?K833R wurde zusätzlich die Autophosphorylierung der
monomeren GST-p110??gemessen. Dargestellt sind ein repräsentatives Autoradiogramm (links) und ein
Coomassie-gefärbtes Protein-Gel der affinitätschromatographisch gereinigten PI-3-Kinasen (rechts).
Wie in Abb. 34 zu sehen ist, wurde die Hexahistidin-markierte p110?-Untereinheit des
Heterodimers, nicht jedoch die GST-fusionierte, Kinase-inaktive p110?-Untereinheit phosphoryliert.
Auch nach Stimulation der Proteinkinase-Aktivität der heterodimeren
PI-3-Kinase ??mit G??-Komplexen konnte keine Phosphorylierung der GST-p110?K833RMutante
nachgewiesen werden. Demnach erfolgte die Autophosphorylierung der PI-3-
Kinase ??nicht über einen Transphosphorylierungs-Mechanismus. Vergleichbare Resultate
wurden kürzlich von Bondev und Mitarbeitern (2001) unter Verwendung der monomeren
p110?-Untereinheit erzielt.
5.5 In vivo-Autophosphorylierung der PI-3-Kinase ?
5.5.1 Nachweis der PI-3-Kinase ??in HL-60-Zellen
Eine entscheidende Frage ist, welche Bedeutung die Autophosphorylierung der Klasse I PI-3-
Kinasen in vivo hat. Da wir gefunden hatten, daß die Proteinkinase-Aktivität der PI-3-
Kinase ??regulierbar ist, während die PI-3-Kinase ??eine konstitutive Aktivität zeigte,
konzentrierten wir uns bei den in vivo-Untersuchungen auf die PI-3-Kinase ?. Die bisherigen
Befunde zur Proteinkinase-Aktivität von Tyrosinkinase-assoziierten PI-3-Kinasen nach
Überexpression in Sf9-Zellen sind uneinheitlich. Während Dhand und Mitarbeiter (1994)
durch metabolische Markierung der überexprimierten PI-3-Kinase ??mit 32P-Phosphat eine
starke Phosphorylierung der p85-Untereinheit sowie einen geringen Phosphat-Einbau in die
p110?-Untereinheit nachweisen konnten, wurde die p110?-Untereinheit bei der Expression in
Sf9-Zellen nicht phosphoryliert (Vanhaesebroeck et al., 1999a). Für die PI-3-Kinase ??konnten
Ergebnisse
75
wir nach Überexpression in Sf9-Zellen und 32P-Phosphat-Markierung ebenfalls keine
signifikante Phosphorylierung der p110?-Untereinheit nachweisen (nicht gezeigt). Vanhasebroeck
und Mitarbeiter (1999a) zeigten weiterhin in unstimulierten Jurkat-T-Zellen, welche
die PI-3-Kinase ??exprimierten, nach Behandlung mit dem Serin/Threonin-Proteinphosphatase-
Inhibitor Okadainsäure eine Phosphorylierung der p110?-Untereinheit, die durch CD28
stimulierbar war.
Daher erschien es interessant, die in vivo-Autophosphorylierung der PI-3-Kinase ??in
einem Zellsystem zu untersuchen, das die PI-3-Kinase ??exprimiert. In neutrophilen Granulozyten
und U937-Zellen konnte eine G-Protein-abhängige, RTK-unabhängige Stimulation der
PI-3,4,5-P3-Bildung durch fMLP und ATP gezeigt werden (Stephens et al., 1993a, b). Dies
führt zur Beeinflussung verschiedener Signalwege, wie z.B. zur Aktivierung der NADPHOxidase
(Coffer et al., 1998). Tatsächlich exprimieren neutrophile Granulozyten sowie
humane Leukämie-Zellinien, wie U937- und K562-Zellen, die p110?-Untereinheit (Stoyanov
et al., 1995, Kular et al., 1997, Naccache et al., 2000). Wir verwendeten für unsere Untersuchungen
HL-60-Zellen, die durch Behandlung mit dbt-cAMP in Richtung neutrophiler
Granulozyten differenziert werden können. In diesen Zellen kann durch Stimulation
G-Protein-gekoppelter Rezeptoren mit dem chemotaktischen Faktor fMLP durch Aktivierung
der NADPH-Oxidase die Bildung von O2
- induziert werden (Abb. 35).
Abb. 35: O2--Produktion in HL-60-Zellen
Die fMLP-induzierte Bildung von O2
- in dbt-cAMP-differenzierten HL-60-Zellen wurde als Reduktion von Cytochrom
c entsprechend den Angaben in den Methoden gemessen. Die Vorbehandlung der Zellen mit Pertussistoxin
(PT) erfolgte für 24 h, während die Inkubation mit den PI-3-Kinase-Inhibitoren Wortmannin (WT) bzw.
LY294002 sowie dem inaktiven 20-Methyl-Wortmannin für 30 min erfolgte. Dargestellt sind die Mittelwerte
(± S.D.) aus drei Experimenten.
Anhand der Sensitivität der fMLP-stimulierten O2
--Bildung gegenüber Pertussistoxin und den
PI-3-Kinase-Inhibitoren Wortmannin und LY294002 konnte geschlossen werden, dass eine
Ergebnisse
76
G-Protein-abhängige PI-3-Kinase in diesen Signalweg involviert war. Der Nachweis der PI-3-
Kinase ??in HL-60-Zellen erfolgte durch Immunoblot-Analyse mit einem monoklonalen,
gegen die p110?-Untereinheit gerichteten Antikörper (Leopoldt et al., 1998, Abb. 36).
Abb. 36: Immunologischer Nachweis der p110?-Untereinheit
in differenzierten HL-60-Zellen
HL-60-Zellextrakt wurde gelelektrophoretisch aufgetrennt und durch
Immunoblot-Analyse mit einem monoklonalen, gegen die p110?-Untereinheit
gerichteten Antikörper analysiert.
5.5.2 Biochemische Charakterisierung der in HL-60-Zellen enthaltenen
PI-3-Kinase ?
Zur biochemischen Charakterisierung der in HL-60-Zellen enthaltenen PI-3-Kinase ??sollte
das Enzym mittels Immunpräzipitation gewonnen werden. In Vorversuchen zeigte sich, dass
der zur Immunoblot-Analyse verwendete monoklonale anti-p110?-Antikörper (MAB) hierfür
ungeeignet war. Daher sollte ein neuer monoklonaler, gegen die p110?-Untereinheit
gerichteter Antikörper (MAB 641) zur Anwendung kommen. Zur Charakterisierung dieses
Antikörpers im Vergleich zu MAB wurde zunächst eine Immunoblot-Analyse mit den
gereinigten PI-3-Kinase-Isoformen ??und ??durchgeführt (Abb. 37A).
Abb. 37: Charakterisierung eines monoklonalen anti-p110?-Antikörpers
A Die aus Sf9-Zellen gereinigten PI-3-Kinase-Isoformen ??und ??(0,5-50 ng) wurden gelelektrophoretisch aufgetrennt,
auf Nitrocellulose-Membranen transferiert und durch Immunoblot-Analyse (IB) mit den monoklonalen antip110?-
Antikörpern MAB bzw. MAB 641 analysiert. B/C HEK293-Zellen wurden entsprechend den Angaben in den
Methoden mit p110?- und p101-Plasmid-DNA transfiziert. Nach 48 h wurden die Zellen geerntet und der
Zellextrakt gewonnen. Die Immunpräzipitation (IP) der PI-3-Kinase ??erfolgte über Nacht mit an ProteinASepharose
gebundenem anti-p110?-Antikörper (MAB 641), zur Kontrolle wurde Antikörper-freie ProteinASepharose
(-) verwendet. Nach dem Abzentrifugieren der ProteinA-Sepharose wurden nicht gebundene Proteine
durch Waschen entfernt. Die ProteinA-Sepharose wurde in Probenpuffer nach Lämmli resuspendiert, es folgten
die gelelektrophoretische Auftrennung der Proteine, der Transfer auf Nitrocellulose-Membranen sowie der
immunologische Nachweis der p110?-Untereinheit mit MAB (B). Zur Bestimmung der Lipidkinase-Aktivität wurde
die ProteinA-Sepharose in Reaktionspuffer aufgenommen und die Bildung von PI-3,4,5-P3 in An- (+) und
Abwesenheit (-) von 120 nM G?1?2-His entsprechend den Angaben in den Methoden gemessen (C).
Ergebnisse
77
Im Gegensatz zum bisher verwendeten MAB, der spezifisch die p110?-Untereinheit
markierte, erkannte MAB 641 die denaturierte p110?-Untereinheit in der Immunoblot-
Analyse nicht. Hingegen konnte mit Hilfe des MAB 641 die in HEK293-Zellen überexprimierte,
heterodimere PI-3-Kinase ??immunpräzipitiert werden, wie der immunologische
Nachweis der p110?-Untereinheit im Immunpräzipitat durch den MAB zeigte (siehe
Abb. 37B). Wie in Abb. 37C zu sehen ist, konnte die Lipidkinase-Aktivität dieser aus
HEK293-Zellen präzipitierten PI-3-Kinase ??mit G???stimuliert werden. Damit konnte mit
dem angewendeten Verfahren zur Immunpräzipitation eine funktionell aktive PI-3-Kinase ?
gewonnen werden.
Nun wurde die in differenzierten HL-60-Zellen enthaltene PI-3-Kinase ??immunpräzipitiert
und auf ihre Lipidkinase-Aktivität untersucht. Wie in Abb. 38A zu sehen ist,
konnte die mittels Immunoblot-Analyse in HL-60-Zellen nachgewiesene PI-3-Kinase ??mit
dem monoklonalen anti-p110?-Antikörper MAB 641 spezifisch immunpräzipitiert werden.
Die Bestimmung der Lipidkinase-Aktivität (siehe Abb. 38B) zeigte, dass die durch die
immunpräzipitierte PI-3-Kinase ??katalysierte PI-3,4,5-P3-Bildung durch Zugabe von G??-
Komplexen stimuliert werden konnte. Die Resultate bestätigten, dass die in differenzierten
HL-60-Zellen exprimierte PI-3-Kinase ??funktionell aktiv war.
Abb. 38: Lipidkinase-Aktivität der in differenzierten HL-60-Zellen enthaltenen PI-3-Kinase ?
A Die Immunpräzipitation (IP) der in HL-60-Zellen enthaltenen PI-3-Kinase ??erfolgte über Nacht mit an ProteinASepharose
gebundenem anti-p110?-Antikörper (MAB 641), zur Kontrolle wurde Antikörper-freie ProteinA-Sepharose
(-) verwendet. Nach dem Abzentrifugieren der ProteinA-Sepharose wurden nicht gebundene Proteine durch
Waschen entfernt. Die ProteinA-Sepharose wurde in Probenpuffer nach Lämmli resuspendiert, es folgten die
gelelektrophoretische Auftrennung der Proteine, der Transfer auf Nitrocellulose-Membranen sowie die Immunoblot-
Analyse (IB) mit MAB. B Zur Bestimmung der Lipidkinase-Aktivität wurde die ProteinA-Sepharose in
Reaktionspuffer aufgenommen und die Bildung von PI-3,4,5-P3 in An- (+) und Abwesenheit (-) von 120 nM
G?1?2-His entsprechend den Angaben in den Methoden gemessen.
5.5.3 In vivo-Proteinkinase-Aktivität der PI-3-Kinase ?
Zur Untersuchung der in vivo-Phosphorylierung der p110?-Untereinheit wurden differenzierte
HL-60-Zellen mit 32P-Phosphat metabolisch markiert. Nach der anschließenden Immunpräzipitation
der PI-3-Kinase ??konnte jedoch keine signifikante Phosphorylierung der p110?-
Untereinheit nachgewiesen werden. Auch eine Behandlung der HL-60-Zellen mit Okadainsäure
(siehe 5.5.1) bewirkte keine verstärkte Phosphorylierung der p110?-Untereinheit (nicht
gezeigt). Weiterhin wurden die 32P-Phosphat-markierten HL-60-Zellen mit fMLP stimuliert,
was ebenfalls nicht zu einer erhöhten Phosphorylierung der PI-3-Kinase ??führte (nicht
Ergebnisse
78
gezeigt). Somit konnte in HL-60-Zellen keine in vivo-Phosphorylierung der p110?-Untereinheit
nachgewiesen werden.
Es stellte sich daher die Frage, ob die in differenzierten HL-60-Zellen enthaltene PI-3-
Kinase ??über eine Proteinkinase-Aktivität verfügte. Um dies zu überprüfen, wurde die
in vitro-Autophosphorylierung der aus HL-60-Zellen immunpräzipitierten PI-3-Kinase ?
bestimmt (Abb. 39).
Abb. 39: Proteinkinase-Aktivität der immunpräzipitierten PI-3-Kinase ?
A/B Gereinigte heterodimere PI-3-Kinase ??(50 ng), Zellextrakt von HEK293-Zellen, die mit p110?- und p101-
Plasmid-DNA transfiziert waren, sowie aus differenzierten HL-60-Zellen gewonnener Zellextrakt wurden über
Nacht mit an ProteinA-Sepharose gebundenem anti-p110?-Antikörper (MAB 641) inkubiert, zur Kontrolle wurde
Antikörper-freie ProteinA-Sepharose (-) verwendet. Nach dem Abzentrifugieren der ProteinA-Sepharose wurden
nicht gebundene Proteine durch Waschen entfernt. Die ProteinA-Sepharose wurde in Probenpuffer nach Lämmli
resuspendiert, es folgten die gelelektrophoretische Auftrennung der Proteine, der Transfer auf Nitrocellulose-
Membranen sowie der immunologische Nachweis der p110?-Untereinheit mit MAB (A). Zur Bestimmung der
Proteinkinase-Aktivität wurde die ProteinA-Sepharose in Reaktionspuffer aufgenommen und die Autophosphorylierung
der p110?-Untereinheit in An- (+) und Abwesenheit (-) von 120 nM G?1?2-His entsprechend den Angaben
in den Methoden bestimmt (B).
Zum Vergleich wurde auch eine Immunpräzipitation der gereinigten PI-3-Kinase ?
(His-p110?/p101, 50 ng Protein) sowie der in HEK293-Zellen überexprimierten, heterodimeren
PI-3-Kinase ??durchgeführt. Wie in Abb. 39A zu sehen ist, konnten vergleichbare
Mengen der gereinigten sowie der überexprimierten PI-3-Kinase ??gewonnen werden,
während aus HL-60-Zellen eine etwa halb so große Menge der PI-3-Kinase ??immunpräzipitiert
wurde. In allen Immunpräzipitaten konnte eine basale Autophosphorylierung der
p110?-Untereinheit nachgewiesen werden. Unter Berücksichtigung der eingesetzten
Proteinmengen fiel die Autophosphorylierung der aus HL-60-Zellen immunpräzipitierten
p110?-Untereinheit im Vergleich zur gereinigten und in HEK293-Zellen überexprimierten PI-
3-Kinase ??jedoch deutlich geringer aus (siehe Abb. 39B). Das könnte möglicherweise darauf
Ergebnisse
79
zurückzuführen sein, dass der aus HL-60-Zellen gewonnene Immunkomplex auch eine mit
der PI-3-Kinase ??assoziierte Protein-Phosphatase enthielt.
Auffällig war weiterhin, dass in keinem Immunpräzipitat eine Stimulation der Autophosphorylierung
der p110?-Untereinheit durch G??-Komplexe nachgewiesen werden
konnte. Da die Proteinkinase-Aktivität der gereinigten PI-3-Kinase ??bei allen bisherigen
Untersuchungen sensitiv gegenüber G??-Dimeren war (siehe 5.1.1), könnte der an die p110?-
Untereinheit gebundene Antikörper Ursache für die fehlende Stimulierbarkeit der Autophosphorylierung
der immunpräzipitierten PI-3-Kinase ??sein. Um dies näher zu untersuchen,
wurde gereinigte PI-3-Kinase ??(His-p110?/p101) an Ni2+-NTA-Agarose gebunden und
anschließend die Autophosphorylierung der p110?-Untereinheit bestimmt. Während eine
basale Autophosphorylierung stattfand, konnte die Proteinkinase-Aktivität der immobilisierten
PI-3-Kinase ??wiederum nicht durch G??-Komplexe stimuliert werden (nicht gezeigt).
Somit scheint der Verlust der G??-Stimulierbarkeit der Autophosphorylierung der p110?-
Untereinheit nach Immobilisierung des Proteins ein generelles Problem darzustellen, was bei
der Interpretation entsprechender Experimente beachtet werden muß.
Um die fehlende Stimulierbarkeit der in vivo-Phosphorylierung der p110?-Untereinheit
durch fMLP besser einordnen zu können, sollte die Rezeptor-vermittelte Membran-Rekrutierung
der PI-3-Kinase ??in differenzierten HL-60-Zellen näher untersucht werden. Dazu wurde
zunächst die subzelluläre Verteilung der PI-3-Kinase ??untersucht. Unter Basalbedingungen
war der größte Teil der PI-3-Kinase ??cytosolisch lokalisiert, während nur ein geringer Anteil
in der Membranfraktion nachgewiesen werden konnte (Abb. 40A).
Abb. 40: Rezeptor-vermittelte Membran-Translokation der PI-3-Kinase ?
A Subzelluläre Verteilung der PI-3-Kinase ??in HL-60-Zellen. Die Gewinnung von Cytosol und Membranen erfolgte
gemäß den Angaben in den Methoden. Nach gelelektrophoretischer Auftrennung gleicher Proteinmengen der
cytosolischen und Membranfraktionen wurde die p110?-Untereinheit immunologisch nachgewiesen. B HL-60-
Zellen wurden für 15 s mit 1 µM fMLP oder dem entsprechenden Puffer inkubiert. Anschließend erfolgte die
Gewinnung von Cytosol und Membranen. Aliquots der Membranfraktionen wurden gelelektrophoretisch
aufgetrennt und die p110?-Untereinheit wurde immunologisch nachgewiesen. Die Laufhöhe der rekombinanten
gereinigten p110?-Untereinheit ist markiert. Dargestellt ist ein typischer von 6 Versuchen. Die Intensität der
Banden wurde densitometrisch ausgewertet. Die angegebenen Werte entsprechen dem Mittelwert (± S.D.) aus
den 6 Versuchen.
Weiterhin wurden Membranen von unstimulierten und fMLP-stimulierten HL-60-Zellen auf
ihren Gehalt an PI-3-Kinase ??untersucht. In Abb. 40B ist gezeigt, dass in differenzierten HL-
60-Zellen nach fMLP-Stimulation eine Membran-Translokation der p110?-Untereinheit zu
beobachten war. Diese entsprach in ihrem Ausmaß der von Naccache und Mitarbeitern (2000)
Ergebnisse
80
nach Rezeptor-Stimulation gezeigten Translokation der PI-3-Kinase ??in neutrophilen Granulozyten.
Verglichen mit dem cytosolischen Anteil der PI-3-Kinase ??ist das Ausmaß dieser
Translokation jedoch gering. Da eine fMLP-vermittelte Aktivierung der Enzymaktivität der
PI-3-Kinase ??jedoch nur möglich ist, wenn das Enzym mit den an der Membran lokalisierten
aktivierten G??-Komplexen interagiert, könnte das geringe Ausmaß der durch fMLP
bewirkten Translokation der PI-3-Kinase ??erklären, warum wir keine Stimulation der in vivo-
Phosphorylierung der p110?-Untereinheit durch fMLP beobachten konnten.
Diskussion 81
6 DISKUSSION
6.1 Mechanismen der Spezifität PI-3-Kinase-abhängiger
Signalwege
Klasse I PI-3-Kinasen vermitteln eine Vielzahl zellulärer Prozesse wie Wachstum und
Differenzierung, cytoskelettale Veränderungen, Zellmigration oder vesikuläre Transportvorgänge
(siehe Abb. 4). Die Aktivierung der PI-3-Kinasen erfolgt hierbei in erster Linie
durch verschiedene Rezeptor-Tyrosin-Kinasen (RTK), wie z.B. den Insulin-, EGF- oder
PDGF-Rezeptor, sowie durch G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCR), wie z.B. den fMLP-
oder den Lysophosphatidsäure-Rezeptor. Während die Klasse IA PI-3-Kinase-Isoformen ?
und ??ubiquitär exprimiert werden, konnte die ebenfalls p85-assoziierte PI-3-Kinase ??nur in
Leukozyten nachgewiesen werden (Hu et al., 1993, Vanhaesebroeck et al., 1997). Auch die
Klasse IB PI-3-Kinase ??kommt bevorzugt in hämatopoietischen Zellen vor und wird
anscheinend in neuronalen Geweben und im ZNS nicht exprimiert (Stoyanov et al., 1995,
Bernstein et al., 1998). Trotz des restriktiven Expressionsmusters einzelner Klasse I PI-3-
Kinasen enthalten die meisten Zellen jedoch mehr als eine PI-3-Kinase-Isoform. In
Leukozyten werden sogar alle vier Vertreter exprimiert. Das Vorhandensein einer Vielzahl
von Stimuli für die Auslösung PI-3-Kinase-abhängiger Signalwege und die Expression
mehrerer PI-3-Kinase-Isoformen in einer Zelle legen nahe, dass die verschiedenen Klasse I
PI-3-Kinasen spezifische Funktionen bei der Signalübertragung ausüben.
Erste Hinweise hierfür ergaben sich durch Studien an „Knockout“-Mäusen. So sind
die Mäuse nach Ausschaltung des p110?-Gens lebensfähig. Sie zeigen jedoch spezifische
Defekte in der Funktion hämatopoietischer Zellen, z.B. neutrophiler Granulozyten und
Lymphozyten, wie es anhand des Expressionsmusters der PI-3-Kinase ??zu erwarten war
(Hirsch et al., 2000, Li et al., 2000, Sasaki et al., 2000a). Hingegen ist die Inaktivierung des
p110?- bzw. p110?-Gens letal (Wymann und Pirola, 1998, Bi et al., 1999). Deshalb müssen
Aussagen zur Spezifität dieser ubiquitär exprimierten PI-3-Kinase-Isoformen zurückgestellt
werden, bis lebensfähige Tiere, z.B. durch konditionelle Ausschaltung der entsprechenden
Gene in bestimmten Geweben, existieren. Dennoch konnten in jüngster Zeit wichtige
Hinweise auf spezifische Funktionen von PI-3-Kinase-Isoformen durch Inaktivierung der
Enzyme mit Hilfe Isoform-spezifischer Antikörper erbracht werden. Demnach vermittelt die
PI-3-Kinase ??nach Stimulation von Makrophagen mit CSF-1 (colony-stimulating factor 1)
die Aktivierung der DNA-Synthese, während durch Aktivierung der PI-3-Kinase-Isoformen ?
und ??Cytoskelett-Veränderungen induziert werden (Vanhaesebroeck et al., 1999b). Weiterhin
soll die PI-3-Kinase ??in PAE (porcine aortic endothelial)-Zellen eine PDGF-abhängige
Actin-Umlagerung bewirken, während die Insulin-vermittelte Actin-Umlagerung über die PI-
3-Kinase ??verlaufen soll (Hooshmand-Rad et al., 2000). Schließlich konnte in NK (natural
killer)-Zellen nachgewiesen werden, dass die PI-3-Kinase ??in die Chemokin-vermittelte
Diskussion 82
Chemotaxis involviert ist, während die PI-3-Kinase ??hierbei keine Rolle zu spielen scheint
(Al-Aoukaty et al., 1999).
Wie kommt diese hohe Isoform-Selektivität PI-3-Kinase-abhängiger Signalwege
zustande? Zunächst unterscheiden sich Klasse I PI-3-Kinasen in ihrer Sensititvität gegenüber
verschiedenen Rezeptorfamilien. Während die PI-3-Kinase-Isoformen ??und ??durch RTK
aktiviert werden und die Aktivierung der PI-3-Kinase ??über eine Stimulation von GPCR
vermittelt wird, ist die PI-3-Kinase ??sowohl gegenüber RTK als auch G??-Komplexen
sensitiv (Kurosu et al., 1997, Maier et al., 1999). Da die Interaktion der Klasse IA PI-3-
Kinasen mit RTK über p85-Adaptor-Untereinheiten erfolgt, könnte eine Selektivität PI-3-
Kinase-abhängiger Signalwege durch unterschiedliche Affinitäten von p85-Isoformen zu
RTK bedingt sein. In der Tat gibt es Hinweise, dass die Adaptor-Untereinheiten mit
verschiedenen RTK unterschiedlich gut assoziieren. So sollen p85-Isoformen mit Insulininduzierten
Signalkomplexen in der Reihenfolge p50??> p85??> p55??interagieren (Antonetti
et al., 1996, Inukai et al., 1997, 2001). Allerdings konnte bisher keine selektive Interaktion
der katalytischen Untereinheiten der Klasse IA PI-3-Kinasen mit bestimmten Adaptor-
Untereinheiten nachgewiesen werden (Vanhaesebroeck et al., 1997). Folgerichtig wurde
bislang eine Isoform-spezifische Kopplung von Klasse IA PI-3-Kinasen mit untersuchten
Rezeptoren, wie dem CSF-1-, CD28- oder GM-CSF (granulocyte-macrophage colonystimulating
factor)-Rezeptor, ausgeschlossen (Vanhaesebroeck et al., 1997, 1999b). Da aber
durch Aktivierung eines bestimmten Rezeptors unterschiedliche Effekte über verschiedene
PI-3-Kinase-Isoformen ausgelöst werden können (s.o.), sind zusätzliche, die Spezifität der
Interaktion von Rezeptor und PI-3-Kinase bedingende Mechanismen wahrscheinlich.
Ein weiterer Aspekt für eine Selektivität PI-3-Kinase-abhängiger Signalwege könnte
eine unterschiedliche Lipidsubstrat-Spezifität bestimmter Klasse I PI-3-Kinase-Isoformen
sein. Während in vitro eine Phosphorylierung von PI, PI-4-P und PI-4,5-P2 erfolgt, besteht in
vivo eine Präferenz der Klasse I PI-3-Kinasen für PI-4,5-P2 (Stephens et al., 1991, Hawkins
et al., 1992). Allerdings gibt es Hinweise, dass die p110?-Untereinheit in Abwesenheit der
p101-Untereinheit nach G??-Stimulation bevorzugt PI phosphoryliert, während die heterodimere
PI-3-Kinase ??verstärkt PI-4,5-P2 phosphorylieren soll (Maier et al., 1999, referiert in
Steinberg, 2001). Die entstehenden Lipidprodukte PI-3-P bzw. PI-3,4,5-P3 werden selektiv
von Proteinen erkannt, die unterschiedliche Lipid-Bindungsdomänen enthalten. Während sog.
FYVE-Domänen PI-3-P binden, können bestimmte PH-Domänen mit PI-3,4,5-P3 und/oder
PI-3,4-P2 wechselwirken (Vanhaesebroeck und Waterfield, 1999). Da die p110??in
bestimmten Zellen nicht konstitutiv mit p101 assoziiert sein soll, sondern möglicherweise als
monomere p110?-Untereinheit Funktionen ausüben kann, wäre grundsätzlich vorstellbar, dass
die PI-3-Kinase ??durch die selektive Bildung distinkter 3’-phosphorylierter Phosphoinositide
unterschiedliche Signale weitergeben könnte (Baier et al., 1999, Metjian et al., 1999).
Möglicherweise bestimmt nicht nur die Generierung sekundärer Botenstoffe, sondern
auch die direkte Interaktion von PI-3-Kinasen mit weiteren Proteinen und damit die Bildung
Diskussion 83
von Signalkomplexen, die Selektivität PI-3-Kinase-abhängiger Signalwege. So konnte eine
Wechselwirkung von Ras mit p110-Untereinheiten nachgewiesen werden (Vanhaesebroeck
et al., 1997, Deora et al., 1998, Pacold et al., 2000, Rubio und Wetzker, 2000). Weiterhin
sollen p85-Untereinheiten, auch in Abwesenheit der p110-Untereinheit, mit Rac und Cdc42
interagieren (Zheng et al., 1994, Tolias et al., 1995, Jimenez et al., 2000, Kang et al., 2002).
Neuere Studien heben die Existenz eines unabhängigen Polyphosphoinositid-
Stoffwechsels im Zellkern hervor. Es gibt Hinweise, dass Klasse I PI-3-Kinasen nicht nur
cytosolisch, sondern auch nukleär lokalisiert sein können (Metjian et al., 1999, Martelli et al.,
2000, Bacqueville et al., 2001). Die Regulation dieser nukleären PI-3-Kinasen soll sich
teilweise von der Regulation cytosolischer PI-3-Kinasen unterscheiden. So wurde kürzlich die
nukleäre GTPase PIKE (phosphoinositide kinase enhancer) identifiziert, die an p85-
Untereinheiten binden und damit Klasse IA PI-3-Kinasen aktivieren soll (Ye et al., 2000).
Hingegen wird die nukleäre PI-3-Kinase ??durch aus nukleären Gi/o-Proteinen freigesetzte
G??-Komplexe stimuliert (Bacqueville et al., 2001). Die subzelluläre Verteilung könnte also
zur Selektivität der Signalwege von Klasse I PI-3-Kinasen beitragen.
In jüngster Zeit wird zunehmend auch ein Einfluß der Proteinkinase-Aktivität von
Klasse I PI-3-Kinasen auf die funktionelle Spezifität dieser Enzyme diskutiert (Hunter, 1995,
Vanhaesebroeck et al., 1999b, Cantrell, 2001, Steinberg, 2001). Wichtigste Hinweise hierfür
lieferten Bondeva und Mitarbeiter (1998), die eine p110?-Mutante erzeugten, die durch
Austausch der PI-Substratbindungsregion keine Lipidkinase-Aktivität besaß, während die
Proteinkinase-Aktivität der Mutante, gemessen als Autophosphorylierung, erhalten blieb. Die
Überexpression dieser Mutante bewirkte in einem zellulären Kontext im Gegensatz zum nicht
modifizierten Enzym keine Aktivierung von PKB/Akt, stimulierte jedoch die MAPK. Dieser
Befund steht in Übereinstimmung mit der Annahme, dass durch die beiden Enzymqualitäten
der PI-3-Kinase ??unterschiedliche Signalwege beeinflusst werden können. Gegenwärtig ist
jedoch das Substrat der Protein-Phosphorylierung nicht identifiziert. Weiterhin ist noch
unklar, in welcher Weise die über die Proteinkinase-Aktivität der PI-3-Kinase ??vermittelte
MAPK-Aktivierung durch GPCR reguliert werden kann, da nur die cytosolisch lokalisierte,
jedoch nicht die Membran-gebundene PI-3-Kinase ??die MAPK aktivierte, obwohl der direkte
Stimulus G???nur Membran-assoziiert vorkommt.
Zum besseren Verständnis der Proteinkinase-Aktivität von Klasse I PI-3-Kinasen
wurden deshalb mit der vorliegenden Arbeit weitere Untersuchungen zur proteinbiochemischen
Charakterisierung dieser enzymatischen Eigenschaft durchgeführt. Hierbei
konzentrierten wir uns auf die Proteinkinase-Aktivität der G-Protein-regulierten PI-3-Kinase-
Isoformen ??und ?.
Diskussion 84
6.2 In vitro-Proteinkinase-Aktivität von Klasse I PI-3-Kinasen
In früheren Untersuchungen zur Proteinkinase-Aktivität der PI-3-Kinase-Isoformen ??und ?
fiel eine Mn2+-Abhängigkeit der Autophosphorylierung auf (Dhand et al., 1994, Vanhaesebroeck
et al., 1997). Die Autophosphorylierung der hier untersuchten, gleichfalls p85-
assoziierten PI-3-Kinase ??benötigt ebenfalls Mn2+. Im Gegensatz dazu ist eine suffiziente
Proteinkinase-Aktivität der Klasse IB PI-3-Kinase ??bereits in Gegenwart von Mg2+ zu
beobachten. Zudem sind die erforderlichen Mg2+-Konzentrationen nahezu identisch mit den
für die Lipidkinase-Aktivität benötigten Konzentrationen (Stoyanova et al., 1997, Maier et al.,
1999). Somit unterscheiden sich die p85-assoziierten Klasse IA PI-3-Kinasen hinsichtlich der
Metallionen-Abhängigkeit der Autophosphorylierung von der Klasse IB PI-3-Kinase ?.
Die vorliegende Arbeit zeigt erstmals, dass die Proteinkinase-Aktivität der PI-3-
Kinase ??eine Phosphorylierung ihrer katalytischen p110?-Untereinheit bewirkt. Dies wird
durch unpublizierte Beobachtungen von Bart Vanhaesebroeck und Mitarbeitern gestützt (pers.
Mitteilung). Interessanterweise berichteten andere Arbeitsgruppen über eine Phosphorylierung
der regulatorischen p85-Untereinheit der PI-3-Kinase ??(Roche et al., 1998, Beeton
et al., 2000). Die Untersuchung von Roche und Mitarbeitern (1998) wurde jedoch mit der
nach Überexpression in COS7-Zellen immunpräzipitierten p110?-Untereinheit durchgeführt,
der große Mengen der aus Sf9-Zellen gereinigten p85-Untereinheit als Substrat zugefügt
wurden. Da mit den von uns verwendeten, stöchiometrischen His-p110?/p85-Dimeren
ebenfalls ein geringfügiger Phosphat-Einbau in die p85-Untereinheit beobachtet werden
konnte (siehe Abb. 26), ist vorstellbar, dass bei einem massiven Überangebot der p85 eine
deutliche Phosphorylierung dieser Adaptor-Untereinheit nachweisbar ist. Unklar blieb in der
Publikation von Roche und Mitarbeitern (1998), ob die p110?-Untereinheit ebenfalls
phosphoryliert wurde. Eine weitere Besonderheit in der zitierten Arbeit sowie der Publikation
von Beeton und Mitarbeitern (2000) war die Verwendung einer durch Immunpräzipitation
immobilisierten PI-3-Kinase ??zur Untersuchung der Autophosphorylierung. In der Tat
scheint jedoch gerade dieser methodische Ansatz einen Einfluß auf die Proteinkinase-
Aktivität der PI-3-Kinase ??zu haben. So konnten wir in vergleichenden Untersuchungen eine
verstärkte Phosphorylierung der p85-Untereinheit beobachten, wenn die PI-3-Kinase ?
immobilisiert vorlag. Dies war unabhängig davon, ob bei der Bestimmung der Proteinkinase-
Aktivität Phosphoinositid-freie Phospholipid-Vesikel verwendet wurden (Abb. 41).
Diskussion 85
Abb. 41: Proteinkinase-Aktivität der löslichen und immobilisierten PI-3-Kinase ?
Gereinigte heterodimere PI-3-Kinase ??(1 µg) wurde entweder an Ni2+-NTA-Agarose gebunden (+) oder als
lösliches Enzym (-) verwendet. Die Proteinkinase-Aktivität wurde in beiden Fällen in An- (+) und Abwesenheit (-)
von Phosphoinositid-freien Phospholipid-Vesikeln entsprechend den Angaben in den Methoden bestimmt.
Dargestellt ist ein repräsentatives Autoradiogramm. Die Proteinverluste bei der Bindung der PI-3-Kinase ??an die
Ni2+-NTA-Agarose bedingten, dass geringere Mengen der immobilisierten PI-3-Kinase ??bei der Bestimmung der
Autophosphorylierung zum Einsatz kamen. Die Menge des 32P-Phosphat-Einbaus in die p110?-Untereinheit
korrelierte mit der Proteinmenge (nachgewiesen durch Ponceau-Färbung), während die p85-Phosphorylierung
der immobilisierten PI-3-Kinase ??im Vergleich zum löslichen Enzym erhöht war.
Somit haben die Versuchsbedingungen einen signifikanten Einfluß auf die Autophosphorylierung
der PI-3-Kinase ?. Auch bei der Untersuchung der Proteinkinase-Aktivität der PI-3-
Kinase ??war ein Einfluß der Versuchsbedingungen zu beobachten. Eine Stimulation der
Autophosphorylierung durch G??-Komplexe erfolgte nur, wenn die PI-3-Kinase ??nicht
immobilisiert war (siehe 5.5.3).
Unsere Befunde belegen eindeutig, dass die Proteinkinase-Aktivität der PI-3-Kinase ?
bevorzugt eine Phosphorylierung der p110?-Untereinheit und nicht der p101-Untereinheit
bewirkt (siehe Abb. 6, Stoyanova et al., 1997, Maier et al., 1999). Für die PI-3-Kinase ?
hatten Vanhaesebroeck und Mitarbeiter (1997) ebenfalls eine Autophosphorylierung der
katalytischen p110?-Untereinheit nachgewiesen. Im Gegensatz dazu erfolgt die Autophosphorylierung
der PI-3-Kinase ??an der regulatorischen p85-Untereinheit, jedoch nur, wenn die
Assoziation von p85 und p110??nicht behindert ist (Dhand et al., 1994, Vanhaesebroeck
et al., 1999a). Somit lassen sich Klasse I PI-3-Kinasen anhand ihrer Autophosphorylierung
differenzieren. Die Proteinkinase-Aktivität der PI-3-Kinase-Isoformen ?, ??und ??führt zur
Autophosphorylierung der katalytischen p110-Untereinheit, während die PI-3-Kinase ??eine
Phosphorylierung der p85-Untereinheit bewirkt.
Ein wichtiges Ziel dieser Arbeit war die Analyse der Regulierbarkeit der
Proteinkinase-Aktivität der PI-3-Kinase-Isoformen ??und ?. Unter in vitro-Bedingungen ist
nur eine geringe basale Autophosphorylierung der p110?-Untereinheit der gereinigten PI-3-
Kinase ??zu beobachten. Diese kann durch G??-Komplexe auf das 8 - 10-fache gesteigert
werden. Der hierbei beobachtete EC50-Wert von etwa 30 nM G???stimmt mit dem
entsprechenden Wert für die Stimulation der Lipidkinase-Aktivität überein (siehe Abb. 7,
Maier et al., 1999). Eine Voraussetzung für die Stimulation der p110?-Autophosphorylierung
durch G??-Dimere ist allerdings die Gegenwart von Lipid-Vesikeln (siehe Abb. 6).
Vermutlich sind diese Lipide nicht nur für die Aktivität von G??, sondern auch für die
korrekte Orientierung der katalytischen Domäne der PI-3-Kinase ??notwendig (Roger
Williams, pers. Mitteilung, Pacold et al., 2000). Im Fall der PI-3-Kinase ??ist die Proteinkinase-
im Gegensatz zur Lipidkinase-Aktivität unter den gewählten Versuchsbedingungen
weder durch G??-Dimere noch durch das Phosphotyrosin-Peptid stimulierbar. Auch die
Diskussion 86
Verwendung von Lipid-Vesikeln sowie die Variation der Mn2+- und Mg2+-Konzentration
ermöglichten keine Stimulation der Autophosphorylierung der p110?-Untereinheit. Der
Einfluß von Ras auf die Proteinkinase-Aktivität der gereinigten PI-3-Kinase ??konnte wegen
der Notwendigkeit eines bislang unbekannten Kofaktors nicht untersucht werden (Pacold
et al., 2000). Das Studium der Literatur ergab ebenfalls keine Hinweise auf eine in vitro-
Stimulierbarkeit der Autophosphorylierung der PI-3-Kinase-Isoformen ??und ?, da die
Untersuchungen für beide PI-3-Kinasen in der Regel mit den an Phosphotyrosin-Peptidbeladenen
Resinaten immobilisierten Enzymen durchgeführt wurden (Dhand et al., 1994,
Vanhaesebroeck et al., 1997, 1999a). Dies würde zwar einer Aktivierung entsprechen, jedoch
fehlen Daten zur basalen Phosphorylierung. Somit verbieten sich Aussagen über das
Verhältnis von basaler zu stimulierter Proteinkinase-Aktivität. Beobachtungen von
Vanhaesebroeck und Mitarbeitern (1999a) bei Untersuchungen zur in vivo-Phosphorylierung
der PI-3-Kinase ??in Jurkat-T-Zellen deuteten jedoch auf eine Stimulation der p110?-
Phosphorylierung durch CD28 hin, die durch den PI-3-Kinase-Inhibitor LY294002 hemmbar
war. Allerdings blieb ungeklärt, ob die PI-3-Kinase ??selbst für diese Phosphorylierung
verantwortlich war.
In der vorliegenden Arbeit wurde in Gegenwart von Mn2+ eine Stöchiometrie des
Phosphat-Einbaus von 0,5 mol Phosphat pro mol p110??ermittelt. Damit könnte vermutet
werden, dass die hohe basale Autophosphorylierung der PI-3-Kinase ??die Regulierbarkeit
durch G???und Phosphotyrosin-Peptid behindert. Da aber auch in Gegenwart von Mg2+ keine
Stimulation beobachtet werden konnte, obwohl der Phosphat-Einbau in die p110?-
Untereinheit wesentlich geringer war, ist anzunehmen, dass die fehlende Aktivierbarkeit der
Proteinkinase-Aktivität der PI-3-Kinase ??andere Ursachen hat. Vanhaesebroeck und Mitarbeiter
(1999a) ermittelten für die aus Sf9-Zellen gereinigte PI-3-Kinase ??ebenfalls eine
Stöchiometrie der Autophosphorylierung von etwa 0,5 mol Phosphat pro mol p110?. Es ist
daher vorstellbar, dass die Reaktionsbedingungen für die Phosphorylierung von Klasse IA PI-
3-Kinasen oder die Natur dieser Phosphorylierung an sich für diesen substöchiometrischen
Phosphorylierungsgrad verantwortlich sind. Im Gegensatz dazu wurde für die G??-stimulierte
Autophosphorylierung der p110?-Untereinheit eine Stöchiometrie von etwa 1 mol Phosphat
pro mol p110??bestimmt, während der basale Phosphat-Einbau nach 30 min nur etwa 0,1 mol
pro mol p110??betrug.
Zu Beginn dieser Arbeit waren nur die Phosphorylierungsstellen der p85?- sowie der
p110?-Untereinheit bekannt (Dhand et al., 1994, Vanhaesebroeck et al., 1999a). Hier konnte
Serin1101 der p110?-Untereinheit als die nach G??-Stimulation phosphorylierte Aminosäure
identifiziert werden. Dies basierte auf der massenspektrometrischen Sequenzierung eines
C-terminalen Phosphopeptids sowie auf der Bestätigung dieses Befundes anhand der
fehlenden Stimulierbarkeit der Autophosphorylierung einer p110?-Mutante, bei der Serin1101
durch Alanin ersetzt war. In analoger Weise wurde Serin1070 als die phosphorylierte
Aminosäure der p110?-Untereinheit identifiziert und durch Mutation bestätigt. Für die p110?-
Diskussion 87
Untereinheit war in einer früheren Untersuchung Serin1039 als phosphorylierte Aminosäure
bestimmt worden (Vanhaesebroeck et al., 1999a). Somit erfolgt die Autophosphorylierung der
Klasse I PI-3-Kinasen, deren katalytische p110-Untereinheit phosphoryliert wird, an einem
homologen Serin-Rest im extremen C-Terminus des Proteins (siehe Abb. 25 und Tab. 10).
Hingegen verfügt die p110?-Untereinheit in diesem Bereich nicht über einen Serin-Rest und
wird auch nicht phosphoryliert.
Tab. 10: Charakteristika der Autophosphorylierung von Klasse I PI-3-Kinasen
PI-3-Kinase-Isoform PI3K ?1 PI3K ??PI3K ??PI3K ?2
Metallionen-Abhängigkeit Mn2+ Mn2+ Mg2+ 4 Mn2+
phosphorylierte Untereinheit p85 p110???p110?4,5 p110?
phosphorylierte Aminosäure Ser608 Ser1070 Ser1101 Ser1039
Effekt der Autophosphorylierung
auf die Lipidkinase-Aktivität $ $ - $
Stimulierbarkeit der
Autophosphorylierung k.A. - durch G????k.A.
$ = Hemmung; - = kein Einfluß; k.A. = keine Aussage
1 Dhand et al., 1994
2 Vanhaesebroeck et al., 1999a
3 Hinweise auf p85-Phosphorylierung durch Roche et al., 1998, Beeton et al., 2000
4 Stoyanova et al., 1997, Maier et al., 1999
5 Hinweise auf p101-Phosphorylierung durch Bondev et al., 1999
6 Maier et al., 2000
Für die PI-3-Kinase ??liegt mittlerweile die Kristallstruktur der monomeren p110?-
Untereinheit vor (Walker et al., 1999, 2000, Pacold et al., 2000). Hieraus ist ersichtlich, dass
sich der phosphorylierte Serin-Rest (Serin1101) in einer Region hinter der C-terminalen k?12-
Helix befindet. Diese Helix bildet zusammen mit der Aktivierungsschleife und der
katalytischen Schleife des Enzyms eine Tasche, die für die Substratbindung von Bedeutung
ist. Entsprechend ist auch der ?-Phosphat-Rest des ATP in der Nähe dieser Region lokalisiert.
Somit befinden sich die 3’-Position des Phosphoinositids sowie Serin1101 und damit das
Lipid- wie auch das Proteinsubstrat der PI-3-Kinase ??in unmittelbarer räumlicher Nähe.
Aufgrund dieser sterischen Verhältnisse könnte die Hydroxylgruppe des Serins mit der 3’-
Hydroxylgruppe des Phosphoinositids um den Angriff des ?-Phosphat-Restes des ATP
konkurrieren. Serin1101 könnte also eine für die Autophosphorylierung des Enzyms
begünstigte Position einnehmen. Der Einfluß der p101-Untereinheit und von G???bei der
Autophosphorylierung bleiben jedoch spekulativ, da hierfür bisher keine Kristalldaten
vorliegen. Weiterhin ist zu vermuten, dass Serin1070 der p110?-Untereinheit und Serin1039
der p110?-Untereinheit innerhalb des Enzyms eine zu Serin1101 der p110?-Untereinheit
vergleichbare Position einnnehmen, wodurch die Autophosphorylierung dieser Serin-Reste
begünstigt ist. Erste, durch massenspektrometrische Untersuchen erbrachte Hinweise auf eine
Diskussion 88
Threonin-Phosphorylierung im extremen C-Terminus der p110?-Untereinheit stehen ebenfalls
in Übereinstimmung mit der Annahme, dass die unmittelbare Nähe zur Substratbindungstasche
eine Autophosphorylierung von Threonin1063 ermöglicht. Interessanterweise zeigen
auch die Befunde von Pirola und Mitarbeitern (2001) zur Proteinkinase-Aktivität von PI-3-
Kinase ?-Hybriden eine deutliche Autophosphorylierung der p110?-Untereinheit. Es wäre zu
prüfen, ob diese Autophosphorylierung an dem zu Threonin1063 der p110?-Untereinheit
homologen Threonin-Rest der p110??erfolgt (siehe Abb. 25).
Für die PI-3-Kinase-Isoformen ??und ??wurde in vitro gezeigt, dass die Autophosphorylierung
der p85-Untereinheit an Serin608 (PI-3-Kinase ?) bzw. der p110?-Untereinheit
an Serin1039 (PI-3-Kinase ?) zu einer Hemmung der durch RTK stimulierten Lipidkinase-
Aktivität führt (Dhand et al., 1994, Vanhaesebroeck et al., 1999a). Um die Auswirkungen der
Autophosphorylierung der PI-3-Kinase-Isoformen ??und ??auf deren Lipidkinase-Aktivität zu
prüfen, wurden in der hier vorgestellten Untersuchung p110-Mutanten erzeugt, deren
phosphorylierter Serin-Rest durch Asparagin- bzw. Glutaminsäure ersetzt war. Damit sollte
der Einfluß der durch Phosphorylierung der entsprechenden Serin-Reste eingeführten
negativen Ladung auf das Protein nachgeahmt werden. Die PI-3-Kinase ?-Mutanten zeigten
im Vergleich zum Wildtyp-Enzym keine Veränderungen der basalen und G??-stimulierten
Lipidkinase-Aktivität (siehe Abb. 24). Außerdem katalysierten die präphosphorylierte und die
nicht präphosphorylierte Wildtyp-PI-3-Kinase ??die PI-3,4,5-P3-Bildung in gleicher Weise
(siehe Abb. 10). Beide Befunde lassen den Schluß zu, dass die Autophosphorylierung der
p110?-Untereinheit die Lipidkinase-Aktivität der PI-3-Kinase ??nicht beeinträchtigt. Das ist
insofern überraschend, als Walker und Mitarbeiter (1999) anhand der p110?-Befunde und der
Kristallstruktur der p110?-Untereinheit postuliert hatten, dass eine Phosphorylierung von
Klasse I PI-3-Kinasen im extremen C-Terminus des Enzyms einen Abschalt-Mechanismus für
die Lipidkinase-Aktivität darstellt. Als Ursache wurde eine sterische Behinderung der
Substratbindung diskutiert. Bei der ebenfalls in diesem Bereich der p110?-Untereinheit
phosphorylierten PI-3-Kinase ??führt die Autophosphorylierung zu einer Hemmung sowohl
der basalen als auch der durch G??-Komplexe, Phosphotyrosin-Peptid sowie synergistisch
durch beide Stimuli aktivierten PI-3,4,5-P3-Bildung (siehe Abb. 32). Dies steht in
Übereinstimmung mit den für die strukturell am nächsten verwandte PI-3-Kinase ??erhobenen
Befunden (Vanhaesebroeck et al., 1999a). Eine zusätzliche Unterstützung unserer Befunde
durch einen komplementären Versuchsansatz, der eine Präphosphorylierung der PI-3-
Kinase ??und die anschließende Bestimmung der Lipidkinase-Aktivität im Vergleich zum
unbehandelten Enzym beinhaltete, war hier nicht möglich. Ursache könnte ein hemmender
Effekt von Mn2+ auf die Lipidkinase-Aktivität der PI-3-Kinase ??sein, der eine vollständige
Entfernung dieses für die Präphosphorylierung der PI-3-Kinase ??notwendigen Kations
erforderte. Ein derartiger Effekt wurde früher für native, p85-assoziierte PI-3-Kinasen aus
Rattenleber beschrieben (Chauhan et al., 1995). Abhilfe würde möglicherweise eine
Immobilisierung der PI-3-Kinase ??bringen, um nach der Präphosphorylierung Mn2+ durch
Diskussion 89
Chelierung und Waschen vollständig entfernen zu können. Da diese Immobilisierung jedoch
eine verstärkte p85-Phosphorylierung (siehe Abb. 41) und damit die von Dhand und
Mitarbeitern (1994) beschriebenen Auswirkungen auf die Lipidkinase-Aktivität des Enzyms
zur Folge hätte, ist unter diesen Versuchsbedingungen eine Aussage über den Einfluß einer
Autophosphorylierung der p110?-Untereinheit auf die Lipidkinase-Aktivität der PI-3-
Kinase ??nicht möglich.
In Abb. 42 sind die hier erhobenen in vitro-Befunde zur Autophosphorylierung der PI-
3-Kinase-Isoformen ??und ??schematisch zusammengefasst. Es ist festzustellen, dass die
Autophosphorylierung beider PI-3-Kinase-Isoformen an einem homologen Serin-Rest im
C-Terminus der katalytischen Untereinheit erfolgt. Jedoch unterscheidet sich diese
Autophosphorylierung in allen untersuchten Charakteristika. Während die Mg2+-abhängige
Autophosphorylierung der PI-3-Kinase ??durch G??-Dimere um das 8 - 10-fache stimuliert
wird und keinen Einfluß auf die Lipidkinase-Aktivität des Enzyms hat, führt die Mn2+-
abhängige Autophosphorylierung der PI-3-Kinase ?, die weder durch G??-Komplexe noch
durch ein vom PDGF-Rezeptor abgeleitetes Phosphotyrosin-Peptid stimulierbar ist, zu einer
Hemmung der Lipidkinase-Aktivität des Enzyms.
Abb. 42: Autophosphorylierung der PI-3-Kinase-Isoformen ??und ?
Die Lipidkinase-Aktivität beider PI-3-Kinase-Isoformen kann durch entsprechende Stimuli (G??-Dimere bei der PI-
3-Kinase ??bzw. G??-Komplexe und RTKs bei der PI-3-Kinase ?) aktiviert werden. Im Gegensatz dazu ist die
Proteinkinase-Aktivität nur bei der PI-3-Kinase ??stimulierbar. Beide PI-3-Kinase-Isoformen werden an einem
Serin-Rest im C-Terminus der p110-Untereinheit phosphoryliert, wobei Unterschiede in der Metallionen-
Abhängigkeit dieser Autophosphorylierung bestehen. Während die Autophosphorylierung der PI-3-Kinase ?
keinen Einfluß auf die Lipidkinase-Aktivität des Enzyms hat, führt die Autophosphorylierung der PI-3-Kinase ??zur
Abschaltung der Lipidkinase-Aktivität des Enzyms.
Diskussion 90
Vergleicht man weiterhin die hier erhobenen Befunde mit den aus der Literatur bekannten
Daten zur Proteinkinase-Aktivität der PI-3-Kinase-Isoformen ??und ?, wird deutlich, dass die
Autophosphorylierung der PI-3-Kinase ??innerhalb der Klasse I PI-3-Kinasen eine Sonderstellung
einnimmt, während die Autophosphorylierung der PI-3-Kinase ??in wichtigen
Charakteristika, wie der Metallionen-Abhängigkeit und dem Abschalt-Mechanismus, mit
denen der anderen Klasse IA PI-3-Kinasen übereinstimmt (siehe Tab. 10).
Hinsichtlich der Metallionen-Abhängigkeit der Proteinkinase-Aktivität von PI-3-
Kinasen ist interessant, dass die Mn2+-abhängige Autophosphorylierung der Klasse III PI-3-
Kinase Vps34p nicht zu einer Hemmung der Lipidkinase-Aktivität führt, wobei allerdings
unbekannt ist, welcher Bereich der Kinase phosphoryliert wird (Stack und Emr, 1994). Im
Gegensatz dazu wird die Lipidkinase-Aktivität der PI-4-Kinase ??durch eine Mn2+-abhängige
Autophosphorylierung des Enzyms, die wie bei den PI-3-Kinase-Isoformen ?, ??und ??in einer
C-terminalen Region und damit in der katalytischen Domäne des Enzyms stattfinden soll,
gehemmt. Diese Autophosphorylierung ist allerdings in Gegenwart von PI, dem Lipidsubstrat
der PI-4-Kinase ?, nicht zu beobachten (Zhao et al., 2000). Für einen weiteren Vertreter der
Lipidkinasen, die Typ I Phosphatidylinositolphosphat-Kinase, wurde berichtet, dass eine
Mg2+-abhängige Autophosphorylierung die Lipidkinase-Aktivität des Enzyms hemmt, wobei
diese Autophosphorylierung durch PI stimuliert wird (Itoh et al., 2000).
Es ist festzustellen, dass die Autophosphorylierung eine charakteristische Eigenschaft
von Lipidkinasen ist. Zwischen verschiedenen Klassen und sogar einzelnen Isoformen dieser
Enzyme bestehen allerdings Unterschiede in der Metallionen-Abhängigkeit sowie in der
Regulation der Autophosphorylierung. Nur für die Klasse I PI-3-Kinasen wurde jedoch
postuliert, dass die Proteinkinase-Aktivität dieser Enzyme durch die Phosphorylierung von
Substraten zur Signaltransduktion beiträgt (Bondeva et al., 1998).
6.3 Mechanismus der Autophosphorylierung
Deshalb war die Analyse des der Autophosphorylierung der PI-3-Kinase ??zugrunde
liegenden Mechanismus ein weiteres Ziel dieser Arbeit. Eine erste Frage war, ob es sich um
eine Auto- und/oder Transphosphorylierung handelt. Die heterodimere PI-3-Kinase ?
(His-p110?/p101) war nicht in der Lage, eine GST-fusionierte, Kinase-inaktive p110?-
Mutante (GST-p110?K833R) zu phosphorylieren (siehe Abb. 34). Analoge Ergebnisse
wurden kürzlich von Bondev und Mitarbeitern (2001) unter Verwendung der monomeren
p110?-Untereinheit berichtet. Zwar kann nicht völlig ausgeschlossen werden, dass der zur
Dimerisierung neigende N-terminale GST-Fusionsbereich der p110?-Mutante die Phosphorylierung
durch die enzymatisch aktive, heterodimere PI-3-Kinase ??behindert. Dies ist jedoch
aus mehreren Gründen wenig wahrscheinlich. So haben Untersuchungen zur G??-
Stimulierbarkeit der Lipid- und Proteinkinase-Aktivität der GST-fusionierten sowie
Hexahistidin-markierten PI-3-Kinase ??keine signifikanten Unterschiede ergeben (C. Czupalla
Diskussion 91
und M. Culo, unveröffentlichte Befunde). Deshalb ist anzunehmen, dass eine Dimerisierung
der GST-p110?K833R-Mutante höchstens ein partielles Hindernis für den Zugang des
His-p110?/p101-Dimers und damit für eine Transphosphorylierungs-Reaktion darstellt.
Jedoch wurde keinerlei Phosphat-Einbau in die p110?-Mutante beobachtet, obwohl im
gleichen Versuch eine leichte Phosphorylierung der p101-Untereinheit des enzymatisch
aktiven Heterodimers stattfand. Somit können wir schließen, dass es sich tatsächlich um eine
p110?-Auto- nicht jedoch um eine Transphosphorylierung handelt. In dieser Eigenschaft
gleicht die PI-3-Kinase ??einer weiteren Lipidkinase, der PI-4-Kinase ?, für die ebenfalls
keine Transphosphorylierung nachgewiesen werden konnte (Zhao et al., 2000).
In diesem Zusammenhang sind unsere Befunde von Bedeutung, die zeigen, dass die
PI-3-Kinase-Isoformen ??und ??mit C-terminalen Peptiden, die die Phosphorylierungsstellen
der p110?- bzw. p110?-Untereinheit beeinhalten, nicht interagierten (siehe Abb. 33B/D) und
diese auch nicht phosphorylieren konnten (siehe Abb. 33A/C). Für die PI-3-Kinase-
Isoformen ??und ??wurde ebenfalls berichtet, dass diese nicht in der Lage sind, Substratpeptide,
die von den entsprechenden Regionen der p85- bzw. p110?-Untereinheit abgeleitet
waren, zu phosphorylieren (Vanhaesebroeck et al., 1999a). Hingegen konnten Beeton und
Mitarbeiter (2000) die Phosphorylierung eines p85-Peptids durch die PI-3-Kinase-
Isoformen ??und ??nachweisen. Ob die Diskrepanz der in den verschiedenen Arbeitsgruppen
erzielten Resultate auf versuchstechnischen Spezifitäten beruht, muß derzeit leider ungeklärt
bleiben.
Unabhängig davon wird jedoch deutlich, dass die Phosphorylierungsreaktionen der
PI-3-Kinasen nur unter der Bedingung einer spezifischen Protein-Protein-Interaktion
stattfinden. Das hat Auswirkungen auf die Suche nach Phosphorylierungssubstraten von
Klasse I PI-3-Kinasen.
6.4 Zellbiologisch-funktionelle Konsequenzen der Proteinkinase-
Aktivität von Klasse I PI-3-Kinasen
Zur in vivo-Proteinkinase-Aktivität von Klasse I PI-3-Kinasen gibt es bisher wenige und
uneinheitliche Befunde. Die p85-Untereinheit der PI-3-Kinase ??wird sowohl nach Überexpression
des Heterodimers in Sf9-Zellen und HEK293-Zellen als auch in bovinen
SGBAF-1-Zellen, einer Nebennierenrinden-Zellinie, phosphoryliert (Dhand et al., 1994,
Beeton et al., 2000). Hingegen erfolgt in HEK293-Zellen nach Transfektion der PI-3-Kinase ?
keine Phosphorylierung der p110?-Untereinheit (Beeton et al., 2000). Für die PI-3-Kinase ?
konnten Vanhaesebroeck und Mitarbeiter (1999a) in Jurkat-T-Zellen eine durch CD28
stimulierbare Phosphorylierung der p110?-Untereinheit nachweisen. In allen weiteren in
dieser Studie untersuchten Zellinien, wie z.B. SCF (stem cell factor)-stimulierten MC/9-
Mastzellen, wurde die p110?-Phosphorylierung jedoch nicht verstärkt.
Diskussion 92
In der vorliegenden Arbeit wurden zur Untersuchung der in vivo-Proteinkinase-Aktivität der
PI-3-Kinase ??HL-60-Zellen verwendet, die durch Behandlung mit dbt-cAMP in Richtung
neutrophiler Granulozyten differenziert waren. Die in HL-60-Zellen endogen exprimierte PI-
3-Kinase ??konnte durch Stimulation der Zellen mit dem chemotaktischen Faktor fMLP
aktiviert werden. Dies führte zu einer Membran-Translokation der PI-3-Kinase ??(siehe
Abb. 40) sowie über die Aktivierung der NADPH-Oxidase zur verstärkten O2
--Bildung (siehe
Abb. 35). Trotz dieser Stimulation der PI-3-Kinase ??durch fMLP konnte jedoch keine fMLPvermittelte
in vivo-Phosphorylierung der p110?-Untereinheit nachgewiesen werden. Auch
nach Behandlung der HL-60-Zellen mit dem Serin/Threonin-Proteinphosphatase-Inhibitor
Okadainsäure war keine p110?-Phosphorylierung zu beobachten. Dieser Befund macht eine
parallel zur Phosphorylierungsreaktion ablaufende Dephosphorylierung der p110?-
Untereinheit durch eine Proteinphosphatase unwahrscheinlich. Im Unterschied hierzu konnten
Vanhaesebroeck und Mitarbeiter (1999a) nach Behandlung von Jurkat-T-Zellen mit Okadainsäure
eine signifikante Phosphorylierung der p110?-Untereinheit beobachten, die durch CD28
stimulierbar war. Während in dieser Studie auch in weiteren Cytokin-abhängigen Zellinien
mit Hilfe von Okadainsäure eine p110?-Autophosphorylierung nachgewiesen werden konnte,
war diese jedoch in keinem Fall stimulierbar (s.o.). Ursache könnte die transiente PI-3-
Kinase-Aktivierung durch die verwendeten Stimuli IL-3 und SCF sein, die bereits nach
2-5 min ihr Maximum erreicht, während CD28 länger als 15 min über die p85-Untereinheit
mit der PI-3-Kinase ??assoziiert. Weiterhin wird auch die geringe Dichte der Rezeptoren
dieser Stimuli im Vergleich zum 10 - 50-fach häufiger vorkommenden CD28-Molekül als
Ursache für die fehlende Stimulierbarkeit diskutiert. Möglicherweise ist also die Stimulation
der p110?-Autophosphorylierung durch CD28 ein für diesen Stimulus spezifisches Phänomen
und kann für andere PI-3-Kinase-Isoformen und die entsprechenden Stimuli nicht
nachgewiesen werden. Betrachtet man weiterhin das Ausmaß der fMLP-stimulierten
Membran-Translokation der PI-3-Kinase ??im Vergleich zur Menge des cytosolisch
lokalisierten Enzyms (siehe Abb. 40), so wird deutlich, dass nur ein geringer Anteil der PI-3-
Kinase ??(weniger als 10 %) an die Membran gelangt. Eine fMLP-vermittelte Aktivierung der
Enzymaktivität der PI-3-Kinase ??ist jedoch nur möglich, wenn das Enzym mit den an der
Membran lokalisierten G??-Dimeren interagieren kann. Zusammen mit einer im Vergleich
zum rekombinanten Protein offensichtlich geringeren in vitro-Proteinkinase-Aktivität der aus
HL-60-Zellen gewonnenen PI-3-Kinase ??(siehe Abb. 39) könnte dieser geringe Anteil der
nach fMLP-Stimulation an der Membran befindlichen PI-3-Kinase ??erklären, warum wir eine
möglicherweise stattfindende in vivo-Phosphorylierung der p110?-Untereinheit nicht nachweisen
konnten.
Neben dem in vivo-Nachweis einer Autophosphorylierung der Klasse I PI-3-Kinasen
stellt sich natürlich die Frage nach der funktionellen Bedeutung dieser Autophosphorylierung.
Für die PI-3-Kinase ??soll die über deren intrinsische Proteinkinase-Aktivität vermittelte
Serin-Phosphorylierung der p85-Untereinheit zur Hemmung der Lipidkinase-Aktivität des
Diskussion 93
Enzyms führen (Carpenter et al., 1993, Dhand et al., 1994). Daneben findet auch eine
Tyrosinkinase-vermittelte Tyrosin-Phosphorylierung der p85-Untereinheit statt, die eine
Aktivierung der Lipdkinase-Aktivität der PI-3-Kinase ??bewirken soll (Gout et al., 1992,
Ruiz-Larrea et al., 1993, Roche et al., 1994). Anhand dieser Untersuchungen schlugen
Woscholski und Mitarbeiter bereits 1994 das folgende Modell zur Regulation der Enzymaktivität
der PI-3-Kinase ??vor. Danach wird die PI-3-Kinase-vermittelte PI-3,4,5-P3-Bildung
nicht nur durch die Stimulation von RTKs und die anschließende Membran-Translokation der
PI-3-Kinase ?, sondern auch durch die Serin- und Tyrosin-Phosphorylierung und -Dephosphorylierung
der p85-Untereinheit reguliert. Die Serin-phosphorylierte, inaktive PI-3-
Kinase ??soll dabei durch die RTK-Aktivierung sowie durch die Tyrosin-Phosphorylierung
der p85-Untereinheit aktiviert werden und anschließend durch eine über endogene Proteinphosphatasen
vermittelte Dephosphorylierung des Serin-Restes ihre volle Aktivität erlangen.
Die Deaktivierung des Enzyms soll durch eine Tyrosin-Dephosphorylierung sowie durch die
PI-3-Kinase-vermittelte Serin-Phosphorylierung der p85-Untereinheit erfolgen. Somit wäre
die zeitlich limitierte PI-3,4,5-P3-Bildung nach einer Stimulation der Zellen mit
Wachstumsfaktoren durch eine konzertierte positive und negative Regulation der PI-3-
Kinase ??bedingt. Unterstützt wird dieses Modell von Untersuchungen, die eine durch die
Tyrosinkinasen Abl und Lck vermittelte Phosphorylierung der p85-Untereinheit an
Tyrosin688 nachweisen konnten, die zur Aktivierung der PI-3-Kinase ??führte und durch die
Proteinphosphatase SHP-1 reguliert war (von Willebrand et al., 1998, Cuevas et al., 1999,
2001). Im Gegensatz dazu konnten Geltz und Augustine (1998) bei Untersuchungen zur
Phosphorylierung der PI-3-Kinase ??in Thrombozyten keinen Einfluß einer Tyrosin-Phosphorylierung
auf die Lipidkinase-Aktivität feststellen. Hier war jedoch eine Serin-, Threonin- und
Tyrosin-Phosphorylierung beider Untereinheiten der PI-3-Kinase ??zu beobachten. Weiterhin
gibt es Hinweise, dass eine Tyrosin-Phosphorylierung der p110?-Untereinheit durch einen
HMG-CoA-Reduktase-Inhibitor zur Hemmung der Lipidkinase-Aktivität der PI-3-Kinase ?
führen soll (Nakagawa et al., 2001). Zum Einfluß der p85-Serin-Phosphorylierung auf die
Aktivität der PI-3-Kinase ??gibt es hingegen keine neueren Untersuchungen. Insbesondere ist
unbekannt, inwieweit ein Austausch des phosphorylierten Serin608 durch Alanin die in vivo-
Lipidkinase-Aktivität des Enzyms beeinflusst. Zum besseren Verständnis der komplexen
Wirkungen einer Serin- bzw. Tyrosin-Phosphorylierung auf die Aktivität der PI-3-Kinase ?
sind daher weitere Untersuchungen erforderlich. Im Gegensatz zur Regulation der Aktivität
der PI-3-Kinase ??durch Phosphorylierung und Dephosphorylierung des Enzyms vermuteten
Yu und Mitarbeiter (1998b), dass durch die PI-3,4,5-P3-Bildung eine Regulation der PI-3-
Kinase ??über eine Produkthemmung erfolgen soll. Das scheint anhand der raschen Kinetik
von PI-3,4,5-P3-Bildung und -Abbau (s.u.) allerdings wenig wahrscheinlich zu sein.
Auch für die PI-3-Kinase ??wurde von Vanhaesebroeck und Mitarbeitern (1999a)
vorgeschlagen, dass die Autophosphorylierung der p110?-Untereinheit als Autoregulations-
Mechanismus dient. In der zitierten Arbeit konnte mit Hilfe eines Phosphopeptid-spezifischen
Diskussion 94
Antikörpers mit Hilfe von CD28 erstmals eine Rezeptor-stimulierte in vivo-Autophosphorylierung
einer PI-3-Kinase-Untereinheit gezeigt werden (s.o.). Dennoch bleibt ein direkter
Zusammenhang zwischen der parallel stattfindenden in vivo-p110?-Phosphorylierung und
einer hiermit korrelierenden Abnahme der in vitro-Lipidkinase-Aktivität der PI-3-Kinase ??zu
beweisen. Hilfreich wäre eine analoge Untersuchung mit einer p110?-Mutante, bei der der
phosphorylierte Serin-Rest durch Alanin ersetzt ist. Diese zusätzliche Kontrolle erscheint
wünschenswert, da Vanhaesebroeck und Mitarbeiter (1999a) in derselben Studie eine Stimulation
der in vitro-Lipidkinase-Aktivität der PI-3-Kinase ??durch CD28 nachweisen konnten.
Betrachtet man den Zeitverlauf der in vitro-Autophosphorylierung von Klasse I PI-3-
Kinasen, so wird deutlich, dass dies ein eher langsamer Prozeß ist, da erst nach 5-10 min eine
merkliche Phosphorylierung zu beobachten ist (siehe Abb. 9, Abb. 28, Dhand et al., 1994).
Darüber hinaus erfolgt auch die in vivo-Autophosphorylierung der PI-3-Kinase ??in einer
vergleichbaren Geschwindigkeit (Vanhaesebroeck et al., 1999a). Hingegen ist die in vivo-
Bildung von PI-3,4,5-P3 und dessen Abbauprodukt PI-3,4-P2 transient. Beispielsweise wird in
fMLP-stimulierten neutrophilen Granulozyten nach wenigen Sekunden das Maximum der
PI-3,4,5-P3-Bildung erreicht, während die durch Dephosphorylierung des PI-3,4,5-P3
bedingte PI-3,4-P2-Bildung nur leicht verzögert ist (Stephens et al., 1991, Ptasznik et al.,
1996). Daher könnte ein Abbau der PI-3-Kinase-Lipidprodukte durch Phosphatasen wie die
Phosphatidylinositol-3-Phosphatase PTEN der wichtigere Kontrollmechanismus für den
Umsatz 3’-phosphorylierter Phosphoinositide als sekundärer Botenstoffe sein (Cantley und
Neel, 1999). Dies lassen Daten von PTEN-defizienten Tumorzellen vermuten. Diese Zellen
weisen einen erhöhten Gehalt an PI-3,4-P2 und PI-3,4,5-P3 sowie eine konstitutive
Aktivierung von PI-3-Kinase-abhängigen Signalwegen auf (Stambolic et al., 1998, Shan
et al., 2000, Liliental et al., 2000). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Autophosphorylierung
von Klasse I PI-3-Kinasen für die Regulation des Umsatzes 3’-phosphorylierter
Lipidprodukte nur eine untergeordnete Rolle zu spielen scheint und darüber hinaus
für die Regulation der Lipidkinase-Aktivität der PI-3-Kinase ??ohne Bedeutung ist.
Suche nach neuen Funktionen der Autophosphorylierung von Klasse I PI-3-Kinasen
Wenn also die Autophosphorylierung der PI-3-Kinase ?, möglicherweise sogar aller Klasse I
PI-3-Kinasen, nicht als Regulationsmechanismus der Enzymaktivität dient, welche Funktion
könnte diese Phosphorylierung dann haben? In den letzten Jahren gibt es zunehmend
Hinweise, dass nicht nur durch eine Tyrosin-Phosphorylierung, sondern auch durch eine
Phosphorylierung von Serin- oder Threonin-Resten Bindungsstellen für Proteine geschaffen
werden, wodurch eine Bildung multimolekularer Signalkomplexe ermöglicht wird (Yaffe und
Elia, 2001). So wurden 14-3-3-Proteine als Phosphoserin-bindende Proteine identifiziert
(Muslin et al., 1996, Yaffe et al., 1997). Diese 14-3-3-Proteine binden beispielsweise die
durch Chk1 phosphorylierte Proteinphosphatase Cdc25, die dadurch im Cytosol retiniert wird.
Diskussion 95
Somit wird der Zugang von Cdc25 zu seinem im Zellkern lokalisierten Substrat Cdc2 und
damit die Zellzyklus-Progression verhindert (Zeng und Piwnica-Worms, 1999, Lopez-Girona
et al., 1999). Weiterhin erkennen bestimmte Proteinmotive, die zwei konservierte
Tryptophan-Reste (W) enthalten und daher als WW-Domänen bezeichnet werden, sowie
FHA (forkhead-associated)-Domänen selektiv Phosphoserin- bzw. Phosphothreonin-haltige
Proteine (Lu et al., 1999, Durocher et al., 2000). Deshalb ist gut vorstellbar, dass auch
Bindungspartner existieren, die spezifisch mit einer phosphorylierten PI-3-Kinase interagieren.
Durch eine Assoziation von PI-3-Kinasen mit derartigen Phosphoserin-erkennenden
Proteinen wäre eine über die Autophosphorylierung der PI-3-Kinasen vermittelte Signalweiterleitung
denkbar. Ein nächster wichtiger Schritt ist daher die Suche nach Interaktionspartnern
phosphorylierter PI-3-Kinasen.
In diesem Zusammenhang muß erwähnt werden, dass die Frage nach Substraten der
Proteinkinase-Aktivität von Klasse I PI-3-Kinasen nicht endgültig geklärt ist. Ursprünglich
wurde IRS-1 als in vitro-Phosphorylierungssubstrat der PI-3-Kinase ??beschrieben (Lam
et al., 1994, Tanti et al., 1994, Uddin et al., 1997, Pirola et al., 2001). Jedoch konnte der für
die Abschätzung der physiologischen Bedeutung wichtige in vivo-Nachweis dieser
Phosphorylierung bislang nicht erbracht werden. Darüber hinaus wird diskutiert, dass eine PI-
3-Kinase auch in die Insulin-vermittelte Phosphorylierung der Phosphodiesterase PDE3B
involviert ist (Rondinone et al., 2000). Im Unterschied zur Identifizierung direkter
Phosphorylierungssubstrate gingen Bondeva und Mitarbeiter (1998) den umgekehrten Weg
und suchten in einem eleganten Versuchsansatz nach Signalwegen, die durch die
Proteinkinase-Aktivität der PI-3-Kinase ??beeinflusst werden. Dazu verwendeten sie eine
p110?-Mutante, die durch Austausch der PI-Substratbindungsregion gegen die entsprechende
Region der Klasse IV PI-3-Kinase FRAP selektiv ihre Lipidkinase-Aktivität und damit die
Fähigkeit, PKB/Akt zu stimulieren, verloren hatte (siehe 6.1). Diese Mutante, deren
Proteinkinase-Aktivität erhalten war, konnte dennoch eine MAPK-Aktivierung bewirken. Die
Annahme, dass die Beeinflussung des MAPK-Weges durch die Proteinkinase-Aktivität der
PI-3-Kinase ??erfolgt, wird von dem Befund unterstützt, dass die durch Expression der PI-3-
Kinase ??katalysierte PI-3,4,5-P3-Bildung für eine Stimulation der MAPK nicht ausreicht
(Lopez-Ilasaca et al., 1997). Allerdings hat die gleiche Arbeitsgruppe Hinweise, daß die
MAPK auch ohne Beteiligung der Proteinkinase-Aktivität durch die PI-3-Kinase ??stimuliert
werden kann (Hehl et al., 2001). In ihren nachfolgenen Untersuchungen haben die Autoren
mittlerweile MEK1 als mögliches Phosphorylierungssubstrat der PI-3-Kinase ??postuliert
(Bondev et al., 1999). Von Lopez-Ilasaca und Mitarbeitern (1997) wurde hingegen gezeigt,
dass die PI-3-Kinase ??oberhalb von Src-Kinasen und Shc in den MAPK-Weg signalisieren
soll (siehe Abb. 43). Dies wird durch Befunde von Hawes und Mitarbeitern aus dem
Arbeitskreis von Lefkowitz (1996) gestützt, wobei allerdings nicht auszuschließen ist, dass
auch p85-assoziierte PI-3-Kinasen in die MAPK-Aktivierung involviert sind. Weiterhin wird
eine über PKC-Isoformen verlaufende, PI-3-Kinase ?-abhängige MAPK-Aktivierung
Diskussion 96
diskutiert (Takeda et al., 1999, Cieslik et al., 2001). Auch für die PI-3-Kinase ??gibt es
Hinweise, dass in humanen SW-480-Colonkarzinom-Zellen nach G??-Stimulation über eine
Aktivierung der PKC??und von Raf die MAPK aktiviert wird (Graneß et al., 1998). Nicht
zuletzt sollen p85-assozierte PI-3-Kinasen durch Bildung von Komplexen mit Grb2 auch in
die RTK-abhängige Aktivierung der MAPK involviert sein (Daub et al., 1997).
Abb. 43: Rezeptor-vermittelte MAPK-Aktivierung
Der „klassische“ MAPK-Weg verläuft über eine Tyrosinkinase-vermittelte Komplexbildung von Shc, Grb2 und Sos.
Das führt zur sequentiellen Aktivierung der monomeren GTPase Ras, der Proteinkinasen Raf, MEK sowie MAPK.
Daneben kann eine MAPK-Aktivierung auch über eine Stimulation von GPCR erfolgen. Exemplarisch ist die G??-
vermittelte, vermutlich über eine PI-3-Kinase ?-abhängige Aktivierung der Nicht-Rezeptor-Tyrosinkinase Src
verlaufende Stimulation des MAPK-Wegs gezeigt (nach Liebmann, 2001b, modifiziert).
Aufgrund ihrer biochemischen Charakteristika, insbesondere der Mn2+-Abhängigkeit sowie
einer fehlenden Regulierbarkeit der Proteinkinase-Aktivität (für die PI-3-Kinase ??gezeigt),
scheint es allerdings wenig wahrscheinlich, dass die Klasse IA PI-3-Kinasen über ihre
Proteinkinase-Aktivität Signalwege wie den MAPK-Weg beeinflussen. Die beobachtete
Wortmannin-Sensitivität wäre in dieser Hypothese eher der Ausdruck einer sterischen
Behinderung der Interaktion von PI-3-Kinasen mit Komplexpartnern, als einer Hemmung der
Proteinkinase-Aktivität (Lam et al., 1994, Rondinone et al., 2000). Als Proteine mit
vielfältigen Bindungsdomänen (SH2, SH3, BH) könnten diese PI-3-Kinasen vielmehr eine
Diskussion 97
„Scaffold“-Funktion haben. Dies könnte auch zur Aktivierung der MAPK durch die
Lipidkinase-defiziente PI-3-Kinase ??beitragen. Die Konstruktion einer PI-3-Kinase ?-
Mutante, der selektiv die Proteinkinase-Aktivität fehlt, während die Lipidkinase-Aktivität
erhalten ist, wäre daher wünschenswert. Eine derartige Mutante könnte bei der Beantwortung
der Frage helfen, ob die MAPK-Stimulation ausschließlich über die Proteinkinase-Aktivität
der PI-3-Kinase ??verläuft, oder ob weitere Faktoren, wie die Bildung von Signalkomplexen,
eine Rolle spielen.
Zusammenfassung 98
7 ZUSAMMENFASSUNG
Über eine Aktivierung von Klasse I PI-3-Kinasen werden vielfältige zelluläre Prozesse wie
Wachstums- und Differenzierungssvorgänge, cytoskelettale Veränderungen oder die
Steuerung vesikulärer Transportvorgänge vermittelt. Dies kann sowohl über die Lipidkinase-
Aktivität der PI-3-Kinasen durch Bildung 3’-phosphorylierter Phosphoinositide als sekundäre
Botenstoffe, als auch über die Proteinkinase-Aktivität dieser Enzyme erfolgen. Während die
Lipidkinase-Aktivität der Klasse I PI-3-Kinasen in vielen Untersuchungen charakterisiert
wurde, ist insbesondere über die Proteinkinase-Aktivität der G-Protein-sensitiven PI-3-
Kinase-Isoformen ??und ??wenig bekannt. Ziel der vorliegenden Arbeit war es deshalb, die
Proteinkinase-Aktivität dieser PI-3-Kinase-Isoformen anhand ihrer Autophosphorylierung
näher zu charakterisieren.
Zu diesem Zweck wurden beide PI-3-Kinase-Isoformen als Hexahistidin-markierte,
heterodimere Enzyme in Sf9-Zellen exprimiert, gereinigt und in vitro phosphoryliert. Es
wurde bestätigt, dass die Mg2+-abhängige Autophosphorylierung der katalytischen p110?-
Untereinheit der PI-3-Kinase ??durch G??-Komplexe stimulierbar ist. Hingegen konnte die
ebenfalls an der katalytischen p110?-Untereinheit stattfindende, Mn2+-abhängige Autophosphorylierung
der PI-3-Kinase ??weder durch G??-Dimere noch durch ein vom PDGFRezeptor
abgeleitetes Phosphotyrosin-Peptid stimuliert werden, obwohl unter den entsprechenden
Versuchsbedingungen eine Aktivierung der Lipidkinase-Aktivität der PI-3-
Kinase ??mit diesen Stimuli erfolgte. Durch massenspektrometrische Analyse konnten
Serin1070 der p110?-Untereinheit sowie Serin1101 der p110?-Untereinheit als die phosphorylierten
Aminosäuren identifiziert werden. Die Bestätigung dieser Befunde erfolgte mit Hilfe
von Autophosphorylierungs-defizienten PI-3-Kinase-Mutanten, deren phosphorylierter Serin-
Rest durch Alanin ersetzt war. Somit findet die Autophosphorylierung beider PI-3-Kinase-
Isoformen an einem homologen Serin-Rest im extremen C-Terminus der katalytischen p110-
Untereinheit statt.
Um den Einfluß der Autophosphorylierung auf die Lipidkinase-Aktivität der PI-3-
Kinase-Isoformen ??und ??zu analysieren, wurden Mutanten erzeugt, deren phosphorylierter
Serin-Rest durch Aspartat bzw. Glutamat ersetzt war. Es zeigte sich, dass diese einer
Phosphorylierung entsprechende Einführung einer negativen Ladung bei der PI-3-Kinase ?
zur Hemmung der Lipidkinase-Aktivität führte, während die Lipidkinase-Aktivität der PI-3-
Kinase ??nicht beeinflusst wurde. Für die PI-3-Kinase ??konnte durch den Vergleich der
Lipidkinase-Aktivität des präphosphorylierten Enzyms mit der Aktivität der nicht präphosphorylierten
PI-3-Kinase ??bestätigt werden, dass die Autophosphorylierung der p110?-Untereinheit
keinen Einfluß auf die Lipidkinase-Aktivität des Enzyms hat. Folglich unterscheidet
sich die an einem homologen Serin-Rest der p110-Untereinheit stattfindende Autophosphorylierung
der PI-3-Kinase-Isoformen ??und ??bezüglich ihrer biochemischen Charakteristika wie
Metallionen-Abhängigkeit und Stimulierbarkeit und führt zu unterschiedlichen Effekten auf
Zusammenfassung 99
die Lipidkinase-Aktivität dieser Enzyme. Weiterhin kann ein Abschaltmechanismus als
generelle Funktion der Autophosphorylierung von Klasse I PI-3-Kinasen zumindest für die
PI-3-Kinase ??ausgeschlossen werden.
Zur Untersuchung des Mechanismus der Autophosphorylierung der PI-3-Kinase-
Isoformen ??und ??wurden C-terminale Peptide der jeweiligen p110-Untereinheit verwendet.
Diese Peptide konnten weder durch die entsprechende PI-3-Kinase phosphoryliert werden,
noch beeinflussten sie die Autophosphorylierung des jeweiligen Enzyms. Darüber hinaus
konnte mit Hilfe einer Kinase-inaktiven p110?-Mutante ausgeschlossen werden, dass die
Autophosphorylierung der PI-3-Kinase ??über einen Transphosphorylierungs-Mechanismus
verläuft. Beide Befunde sprechen dafür, dass die Phosphorylierungsreaktionen der PI-3-
Kinase-Isoformen ??und ??spezifischer Protein-Protein-Interaktionen bedürfen. Dies ist für die
Suche nach Phosphorylierungssubstraten von Bedeutung.
Um die in vivo-Proteinkinase-Aktivität der PI-3-Kinase ??anhand ihrer Autophosphorylierung
zu charakterisieren, wurden dbt-cAMP-differenzierte HL-60-Zellen verwendet,
in denen durch Stimulation mit dem chemotaktischen Faktor fMLP PI-3-Kinase ?-abhängige
Signalwege ausgelöst werden können. Dennoch konnte keine fMLP-stimulierte in vivo-Autophosphorylierung
der p110?-Untereinheit nachgewiesen werden.
Zusammengefaßt kann festgestellt werden, dass sich die G-Protein-sensitiven PI-3-
Kinase-Isoformen ??und ??hinsichtlich der untersuchten biochemischen Charakteristika der
Autophosphorylierung wie Metallionen-Abhängigkeit, Regulierbarkeit und funktioneller
Bedeutung signifikant unterscheiden. Somit könnte die Proteinkinase-Aktivität dieser
Lipidkinasen eine wichtige Determinante für eine Isoform-spezifische Signaltransduktion
sein.
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Eigene Publikationen 122
EIGENE PUBLIKATIONEN
Originalarbeiten
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Breitweg-Lehmann, E., Czupalla, C., Storm, R., Kudlacek, O., Schunack, W., Freissmuth, M.,
Nürnberg, B. (2002) Activation and inhibition of G proteins by lipoamines. Mol. Pharmacol.,
66(3), in Druck.
Just, H., Stefan, E., Czupalla, C., Nürnberg, B., Nanoff, C., Freissmuth, M. (2002) Beyond G
proteins: the role of accessory proteins in G protein-coupled receptor signalling. Trends Drug
Res., in Druck.
Goetze, S., Bungenstock, A., Czupalla, C., Eilers, F., Stawowy, P., Kintscher, U., Spencer-
Hänsch, C., Graf, K., Nürnberg, B., Fleck, F., Law, R.E., Gräfe, M. (2002) Leptin-induced
migration of endothelial cells is Akt- and MAPK-dependent and inhibited by PPAR?-ligands.
In Revision.
Czupalla, C., Culo, M., Müller, E.-C., Brock, C., Wetzker, R., Spicher, K., Krause, E.,
Nürnberg, B. (2002) Isoform-specific regulation of phosphoinositide 3-kinase protein kinase
activity. In Vorbereitung.
Czupalla, C., Nürnberg, B., Krause, E. (2002) Analysis of class I phosphoinositide 3-kinase
autophosphorylation sites by mass spectrometry. In Vorbereitung.
Brock, C., Schaefer, M., Reusch, H.P., Czupalla, C., Schulz, A., Michalke, M., Spicher, K.,
Schultz, G., Nürnberg, B. (2002) In vivo-imaging reveals a dual role for receptor-released G??
dimers in direct activation of heterodimeric phosphoinositide 3-kinase ?. In Vorbereitung.
Kurzfassungen von Kongressbeiträgen
Breitweg-Lehmann, E., Czupalla, C., Leschke, C., Storm, R., Schunack, W., Nürnberg, B.
(1999) Low molecular weight G-protein activators interact selectively with Gi-proteins. Arch.
Pharm. Pharm. Med. Chem., 332(1), 62.
Maier, U., Babich, A., Czupalla, C., Macrez, N., Illenberger, D., Nürnberg, B. (1999):
Regulation of phosphoinositide-3-kinase by G proteins. Fifth International Dahlem
Symposium on “Cellular Signal Recognition and Transduction”. Berlin, 14.-16.10.1999, S34.
Eigene Publikationen 123
Czupalla, C., Breitweg-Lehmannn, E., Schunack, W., Nürnberg, B. (2000) Low molecular
G-protein modulators inhibit activation of HL-60 cells by chemoattractants. Naunyn-
Schmiedeberg’s Arch. Pharmacol., 361(4), R53.
Czupalla, C., Maier, U., Nürnberg, B. (2001) Receptor-regulated protein kinase activities of
heterodimeric class I phosphoinositol-3-kinases. Naunyn-Schmiedeberg’s Arch. Pharmacol.,
363(4), R54.
Brock, C., Reusch, H.P., Czupalla, C., Schulz, A., Michalke, M., Schultz, G., Nürnberg, B.,
Schaefer, M. (2001) Dual role for G???in activation of PI-3-kinase ?. Fachbereich Humanmedizin,
Universitätsklinikum Benjamin Franklin der Freien Universität Berlin, Jahrbuch
2001, S326.
Czupalla, C., Culo, M., Müller, E.-C., Krause, E., Nürnberg, B. (2001) Isoform-spezifische
Regulation der Autophosphorylierung von Klasse I PI-3-Lipidkinasen. Fachbereich Humanmedizin,
Universitätsklinikum Benjamin Franklin der Freien Universität Berlin, Jahrbuch
2001, S327.
Schulz, A., Czupalla, C., Schimmelpfennig, K., Krause, G., Schunack, W., Nürnberg, B.,
Spicher, K. (2001) In vitro Gi-Protein-stimulierende Lipoamine hemmen rezeptorunabhängig
Gi-Proteine in intakten Zellen. Fachbereich Humanmedizin, Universitätsklinikum Benjamin
Franklin der Freien Universität Berlin, Jahrbuch 2001, S333.
Czupalla, C., Brock, C., Müller, E.-C., Schaefer, M., Krause, E., Nürnberg, B. (2001)
Regulation of phosphoinositide 3-kinase ??by G proteins. Sig. Trans., 1, 154.
Lebenslauf 124
LEBENSLAUF
Persönliche Angaben
Name: Cornelia Czupalla
Geburtsdatum und -ort: 27.08.1970 in Erfurt
Eltern: Ruthild Czupalla, geb. Edler, und Frieder Czupalla
Familienstand: ledig
Staatsangehörigkeit: deutsch
Schule
1977 - 1987 Polytechnische Oberschule „Ho Chi Minh“, Erfurt
1987 - 1989 Erweiterte Oberschule „G.E. Lessing“, Erfurt
30.06.1989 Allgemeine Hochschulreife
Ausbildung
1989 - 1990 Vorpraktisches Jahr mit Berufsausbildung zum Elektromonteur,
VEB Erfurt Electronic
1990 - 1992 Studium der Elektrotechnik (Spezialisierungsrichtung Biomedizinische
Technik und Biokybernetik),
Technische Universität Ilmenau
1992 - 1997 Studium der Pharmazie,
Friedrich-Schiller-Universität Jena
01.09.1994 Erster Abschnitt der Pharmazeutischen Prüfung
08.04.1997 Zweiter Abschnitt der Pharmazeutischen Prüfung
05/97 - 04/98 Praktisches Jahr in der Nordapotheke, Erfurt, und in der Apotheke des
Universitätsklinikums „Benjamin Franklin“, Berlin
28.07.1998 Dritter Abschnitt der Pharmazeutischen Prüfung
13.08.1998 Approbation als Apothekerin
06/98 Beginn der Dissertationsarbeit am Institut für Pharmakologie der Freien
Universität Berlin (geschäftsführender Direktor: Prof. Dr. G. Schultz)
Stipendien
08/95 - 04/97 Stipendiatin der Studienstiftung des Deutschen Volkes
06/98 - 10/99 Stipendiatin des Graduiertenkollegs „Signalketten in lebenden Systemen“
Danksagung 125
DANKSAGUNG
An erster Stelle möchte ich mich bei Herrn Prof. Dr. Dr. Bernd Nürnberg für die intensive
Betreuung der Arbeit, zahlreiche wissenschaftliche Anregungen und Diskussionen bedanken.
Herrn Prof. Dr. Günter Schultz danke ich für seine Unterstützung und wissenschaftliche
Förderung, insbesondere für die Möglichkeit, meine Dissertationsarbeit am Pharmakologischen
Institut der Freien Universität in Berlin durchführen zu können.
Mein besonderer Dank gilt Herrn Dr. Eberhard Krause für die Einführung in die Massenspektrometrie,
für die wissenschaftliche Begleitung der MALDI-MS-Messungen, die ich bei
ihm am Forschungsinstitut für Molekulare Pharmakologie in Berlin durchführen konnte,
sowie für zahlreiche stimulierende Diskussionen.
Bei Herrn Prof. Dr. Claus Liebmann sowie Herrn Prof. Dr. Reinhard Wetzker möchte ich
mich für die Bereitschaft bedanken, die Arbeit vor der Biologisch-Pharmazeutischen Fakultät
der Friedrich-Schiller-Universität Jena zu vertreten.
Herrn Dr. Karsten Spicher danke ich für die Einführung in molekularbiologische
Arbeitstechniken und die Konstruktion von Baculoviren. Bei Herrn Dr. Udo Maier bedanke
ich mich für die experimentelle Einführung in Aktivitätsuntersuchungen von PI-3-Kinasen.
Aleksei Babich, Carsten Brock, Andreas Schulz und Aliaksei Shymanets bin ich für die sehr
gute und vielfältige Zusammenarbeit verbunden. Herrn Miran Culo danke ich besonders für
sein großes Engagement. Frau Heidemarie Lerch und Herrn Jürgen Malkewitz bin für die
hervorragende technische Unterstützung dankbar. Bei Frau Christine Laugwitz möchte ich
mich für die stets rasche Hilfe bei logistischen Problemen bedanken.
Frau Majbrit Hjerrild, Süddänische Universität Odense, danke ich für die Hilfe bei der
Phosphoaminosäure-Analyse. Frau Dr. Eva-Christina Müller, Max-Delbrück-Zentrum für
Molekulare Medizin Berlin, danke ich für die Tandem-massenspektrometrischen Messungen.
Selbständigkeitserklärung
Ich erkläre, dass ich die vorliegende Arbeit selbständig und nur unter Verwendung der
angegebenen Hilfsmittel und Literatur angefertigt habe.
Erklärung zur Bewerbung
Hiermit erkläre ich, dass ich mich mit der vorliegenden Arbeit an keiner anderen Hochschule
um den akademischen Grad Doctor rerum naturalium beworben habe und dass ich weder
früher noch gegenwärtig die Eröffnung eines Verfahrens zum Erwerb des o.g. akademischen
Grades an einer anderen Hochschule beantragt habe.

