Functional consequences of natural and synthetic polyploidization of Nicotiana attenuata and N. obtusifolia- special focus on expressed anti-herbivore response

Polyploidie ist ein häufiges Phänomen im Pflanzenreich. Geschätzte 30 bis 80% der bekannten Arten sind polyploid (Meyers and Levin, 2006; Rieseberg and Willis 2007). Desweiteren haben auch Duplikationen einzelner Chromosomen die Evolution diploider Spezies beeinflusst (Sidow 1996; Kellis et al. 2004). Eine beträchtliche Anzahl an Pflanzen, die als klassische diploide Arten galten, wie z.B. Arabidopsis und Mais, werden heute als ursprünglich polyploid betrachtet (The Arabidopsis Genome Initiative, 2000; Wolfe, 2001; Cui et al., 2006). Jüngste Ergebnisse deuten darauf hin, dass Polyploidie zu Änderungen in der Genexpression führen kann (durch Gen-Dosis-Effekte, Beeinflussung regulatorischer Wechselwirkungen und durch genetische und epigenetische Veränderungen), was oft zu neuen phänotypischen Variationen führt und eine Anpassung an ein breites Habitatsspektrum und an ungünstige Umgebungsbedingungen erlaubt. Diese phänotypische Vielfalt verleiht polyploiden Organismen evolutionäre und ökologische Vorteile gegenüber ihren Elternspezies. Die Gattung Nicotiana bietet viele Vorteile für die Untersuchung von Polyploidie, nicht nur wegen des gut beschriebenen phylogenetischen Stammbaums [die Gattung umfaßt 75 Arten von denen 35 als allopolyploid beschrieben sind (Chase et al., 2003; Clarkson et al., 2004)] sondern auch wegen ihrer umfassend untersuchten Ökologie. N. quadrivalvis (Nq) und N. clevelandii (Nc) sind allopolyploide Arten, die durch Amphidiploidie aus den zwei diploiden Vorfahren N. attenuata (Vater) und N. obtusifolia (Mutter) vor etwa zwei Mio. Jahren entstanden sind (Chase et al., 2003). Nq und Nc wurden bereits in mehreren Studien verwendet um den Einfluß von Polyploidie auf die Evolution polygener Verteidungsstrategien (Lou and Baldwin, 2003; Qu et al., 2004; Wu et al., 2006) und auf Veränderungen der Genomgröße zu untersuchen (Leitch et al.,2008). Dabei kamen die Autoren zu dem Schluss, dass die Evolution von Nq und Nc mit einer Vergrößerung des Genoms von 2.5 bzw. 7.5% und einer massiven Umgestaltung der elterlichen polygenetischen Verteidigungsmechanismen einherging (die spezifische Signalantwort von Na auf bestimmte Herbivoren wurde in abgeänderter Form in Nq erhalten, während sie in Nc größtenteils verloren ging; das väterliche TPI-Gen hingegen ging sowohl in Nq als auch in Nc verloren). Ob diese Veränderungen jedoch direkt nach der Polyploidisierung oder erst im Verlauf der folgenden zwei Mio. Jahre aufgetreten waren blieb ungewiß. Aus diesem Grund simulierten wir die Allopolyploidie von Nc und Nq durch die Herstellung synthetischer polyploider Linien: der allotetraploiden N. ×obtusiata (N ×o) [N. attenuata (Na) (als Vater) × N. obtusifolia (No) (als Mutter)] und der jeweils autotetraploiden Nachkommen von Na (NaT) und No (NoT). Im ersten Teil meiner Arbeit (Kapitel I) untersuchten wir die genetischen, genomischen und phänotypischen Veränderungen der synthetischen auto- und allopolyploiden im Vergleich zu den diploiden Elternarten (Na und No) und den natürlichen Allotetraploiden Nq und Nc. DNA-„Fingerabdruck“-Profile (durch UP-PCR) ergaben, dass die fünf N×o-Linien ähnliche aber nicht identische Profile aufwiesen. Synthetische und natürliche Polyploidie hatte einen Dosis-abhängigen Effekt auf die Genomgröße (gemessen in den Samen), wobei allerdings nur Nq mit der Genomvergrößerung in Beziehung stand. Analysen auf zellulärer Ebene ergaben, dass die N×o -Linien intermediäre Phänotypen ihrer Elternspezies aufwiesen. Sowohl Allo- als auch Autotetraploidisierung hatten einen Dosis-Effekt auf Samenmasse und Trockenbiomasse (außer bei NaT), allerdings hatten sie keinen Einfluß auf die Stammhöhe zur Zeit der ersten Blüte. Nc wies väterliche (Na) zelluläre Phänotypen auf aber vererbte mütterliche (No) Biomasse und Samenmasse, während hingegen Nq mütterliche (No) zelluläre Phänotypen aber vererbte väterliche (Na) Muster von Biomasse und Samenmasse zeigte. In einer Hauptkomponenten-Analyse gruppierte Nq aufgrund der ähnlichen Samenmasse, der Stammlänge und der Genomgröße mit den N×o -Linien. Dieselben Eigenschaften unterschieden Nc, No und Na von Nq und den N×o -Linien, wobei die Biomasse Na von N×o - und den Nq-Linien trennte und NaT näher mit Nq und den N×o -Linien gruppierte als mit Na. In diesem Kapitel konnten wir zeigen, dass sowohl Allo- als auch Autotetraploidie beträchtliche morphologische, genetische und genomische Veränderungen hervorrufen, von denen viele zumindest in einer der natürlichen Polyploiden Arten erhalten wurden. Wir betrachten daher sowohl natürliche als auch synthetische Polyploide als gut geeignet um die Evolution adaptiver Merkmale zu untersuchen. Im zweiten Teil meiner Arbeit (Kapitel II) untersuchten wir die Expression Herbivorie-induzierter Gene von Na und No in den synthetischen Auto- und Allopolyploiden um allgemein zu verstehen wie die Expression von Genen, die komplexe polygene Merkmale regulieren, durch Polyploidisierung beeinflußt wird. Die Applikation oraler Sekrete (OS) von Manduca sexta auf mechanisch verwundete Blätter von Na führt u.a. zu einer schnellen Akkumulation von Transkripten der Gene „wound-induced protein kinase” (WIPK), „lipoxygenase 3“ (LOX3), „non-expressor of pathogenesis-related 1“ (NPR1) und „jasmonate-resistant 4“ (JAR4). Diese transkriptionelle Antwort korreliert mit einer Akkumulation von Jasmonsäure (JA), Jasmonsäure-Isoleucin (JA-Ile) und Trypsin-Protease-Inhibitoren (TPIs). In No hingegen reduzierten die oralen Sekrete NPR1-Transkripte und erhöhten die Mengen an Salicylsäure (SA), welche der Wirkung von JA und der JA-abhängigen Verteidigung entgegenzuwirken schien. OS-induzierte N×o-Linien produzierten große Mengen der uniparentalen Transkripte Na-WIPK, No-LOX3, No-JAR4 und Na-TPI aber nur geringe Mengen von Na- und No-NPR1. Na- und No-NPR1 Transkripte korrelierten mit einer Zunahme von SA und einer Abnahme von JA, was erneut auf einen SA/JA-Antagonismus in den allopolyploiden Kreuzungen hinweist. Eine Behandlung der N×o-Linien mit Methyljasmonat induzierte die Transkripte von LOX3, JAR4 und TPI von beiden Eltern in ähnlichem Ausmaß, was darauf hindeutet, dass das beobachtete uniparentale Expressionsmuster nach OS-Induktion nicht auf eine spezifische Inaktivierung von Genen zurückzuführen ist. Bezüglich der TPI-Aktivität entsprachen die N×o-Linien 1 und 2 Na, während die Linien 3 bis 5 eher mit No vergleichbar waren. Dies legt nahe, dass synthetische Neo-Allopolyploide die Expression der elterlichen und für die Verteidigung relevanten Gene rasch neu anpassen um diverse Verteidigungsantworten gegen Herbivoren hervorzubringen. Wir folgern daraus, dass solche Expressionsänderungen von Genen mit Schlüsselfunktionen und post-transkriptionelle Vorgänge eine adaptive Radiation während der allopolyploiden Artbildung begünstigen.