Funktionelle Charakterisierung fluoreszenzmarkierter Agonisten an zyklisch-Nukleotid aktivierten Ionenkanälen

Die Nukleotide cAMP und cGMP sind intrazelluläre, sekundäre Botenstoffe und agieren unter anderem als Agonisten an zyklisch-Nukleotid ktivierten (CNG)-Ionenkanälen. Somit besitzen die kleinen Signalmoleküle eine Schlüsselstellung in der Entwicklung von Rezeptorpotentialen im visuellen und olfaktorischen System, indem diese durch Bindung an die Ionenkanäle eine Aktivierung hervorrufen. Dabei ist cAMP der native Ligand der olfaktorischen CNGA2:A4:B1b-Kanäle, jedoch besitzt cGMP eine höhere scheinbare Affinität. Durch die ebenfalls hohe Affinität an den homotetrameren CNGA2-Kanälen wurde in vorherigen Studien ein fluoreszierender Ligand (fcGMP) entwickelt, welcher einen Farbstoff enthält, der mithilfe eines Aminoethylthio-Linkers an Position 8 des Nukleotides verbunden ist. Bei der konfokalen Patch-clamp Fluorometrie (cPCF) wird die Aktivierung synchron zur Bindung gemessen (Biskup et al. 2007). Hierbei wurde eine große Anzahl an neuen Liganden synthetisiert und mittels elektrophysiologischer Methoden die Wirkung auf CNG-Kanäle, welche in Xenopus laevis Oozyten heterolog exprimiert wurden, charakterisiert. Dabei wurden sowohl die scheinbare Affinität als auch die kinetischen Eigenschaften in der inside-out Konfiguration ermittelt. Für die Bestimmung weiterer Kennwerte, wie Bindung, Helligkeit und Fluoreszenzspektren diente die cPCF. Um die publizierten cPCF Experimente (Biskup et al. 2007) auf Einzelmoleküllevel zu beobachten, benötigt es neue Liganden mit verbesserter Affinität und photophysikalischen Eigenschaften. Um die Affinität und die molekulare Helligkeit eines fluoreszierenden Liganden zu optimieren, wurden drei Möglichkeiten verfolgt.