Selektive Detektion von Hepatozyten und Sinusoidalen Leberendothelzellen in einem Zellsheetlayersystem durch Antikörper-basierte Immunfluoreszenz

Xie,Ting

Humane primäre Hepatozyten werden häufig zur Untersuchung von Arzneimitteltoxizitäten, Arzneimittel-Clearance und Arzneimittel-Wechselwirkungen verwendet. Aufgrund der schnellen Dedifferenzierung der Zellen in zweidimensionalen Kulturen geht der Leberphänotyp und die Leberfunktion verloren und eine langfristige Kultivierung ist nicht möglich. Aus diesem Grund werden häufig 3D- Zellkultursysteme verwendet, die die in vivo Leberphysiologie besser imitieren können. In der Arbeitsgruppe wurde ein Zellsheetlayersystem (CSL) entwickelt, welche Leberläppchen nachahmen und mit Hepatozyten und sinuosidalen Leberendothelzellen besiedelt werden können. Die Herstellung erfolgt durch die 3D-µcontact-printing-Methode. Das Kultivieren von Zellen in diesen dreidimensionalen Strukturen kann zu phänotypischen und funktionellen Verbesserungen bei den kokultivierten Zelltypen führen. Das Ziel der vorliegenden Bachelorarbeit war die Entwicklung einer Antikörper-basierten Immunfluoreszenzdetektionsmethode, durch die Hepatozyten und sinuosidale Leberendothelzellen (LSECs) auf einem Zell-Sheet-Layer-System (cell-sheet-layer, CSL) durch Farbstoff-markierte Antikörper und Laserscanningmikroskopie selektiv detektiert werden können. Dies dient zur besseren Charakterisierung des Zellsheetlayer-Kokultursystems. Zu diesem Zweck wurden primäre upcyte® Hepatozyten (pHeps) und primäre upcyte® LSECs verwendet, welche aufgrund gentechnischer Modifikationen länger proliferieren können. Mit der 3D-µ-contact-printing-Methode wurden Zellsheetlayer hergestellt. Verschiedene Antikörper (AK)-Kombinationen wurden getestet und die Immunfluoreszenzdetektionsmethode konnte erfolgreich mit einem monoklonalem anti-Albumin-AK zur Detektion der Hepatozyten sowie einem monoklonalem anti CD31-AK zur Detektion der LSECs in einer 2D-Kokultur etabliert werden. Zuvor konnte gezeigt werden, dass die selektive Detektion der Hepatozyten und LSECs mit folgenden AK-Kombinationen nicht möglich war: polyklonaler anti Albumin AK (Heps)/ monoklonaler anti CD31-AK (LSECs) und monoklonaler anti AAT-1-AK (Heps)/ monoklonaler anti CD31-AK (LSECs). Der Grund hierfür waren jeweils unspezifische Bindungen der AK an beide Zelltypen. Die Ergebnisse zeigen, dass bei der selektiven Detektion von verschiedenen Zelltypen in einem Kokultursystem auf Unspezifität der verwendeten AK geachtet werden muss und die spezifischen Antigene sorgfältig ausgewählt werden müssen.

Human primary hepatocytes are often used to study drug toxicities, drug clearance and drug interactions. Due to the rapid dedifferentiation of cells in two-dimensional cultures, the liver phenotype and liver function are lost and long-term cultivation is not possible. For this reason, 3D cell culture systems are often used to imitate the in vivo liver physiology. In our team a cell sheet layer system (CSL) was developed, which mimics liver lobules and can be colonized with hepatocytes and liver sinuosidal endothelial cells. The production is done by the 3D-µcontact-printing method. The cultivation of cells in these three-dimensional structures can lead to phenotypic and functional improvements in the co-cultured cell types. The aim of the present bachelor thesis was the development of an antibody-based immunofluorescence detection method for the selective detection of hepatocytes and liver sinuosidal endothelial cells (LSECs) on a cell-sheet-layer (CSL) system using dye-labelled antibodies and laser scanning microscopy. With this technique the cell sheet layer-coculture system can be better characterized. For this purpose, primary upcyte® hepatocytes (pHeps) and primary upcyte® LSECs were used, which can proliferate longer due to genetic modifications. Cell sheet layers were produced using the 3D µ-contact-printing method. Various antibody (Ab) combinations were tested and the immunofluorescence detection method was successfully established with a monoclonal anti-albumin-Ab for hepatocyte detection and a monoclonal anti-CD31-Ab for LSEC detection in a 2D coculture. Previously it was shown that selective detection of hepatocytes and LSECs was not possible with the following Ab combinations: polyclonal anti albumin Ab (Heps)/ monoclonal anti CD31-Ab (LSECs) and monoclonal anti AAT-1-Ab (Heps)/ monoclonal anti CD31-Ab (LSECs). This was due to unspecific binding of Abs to both cell types. The results show that the non-specificity of a Ab must always be tested in a coculture system to selectively detect different cell types in a coculture system and in addition, antigens must be carefully selected.

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Xie, Ting: Selektive Detektion von Hepatozyten und Sinusoidalen Leberendothelzellen in einem Zellsheetlayersystem durch Antikörper-basierte Immunfluoreszenz. Ilmenau 2020.

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