Analysis and comparison of the glycoproteomic phenotype of TLR4- and TLR2-induced tolerance in human monocytes

Behnert, Andrea GND

Endotoxin tolerance of human monocytes contributes to sepsis-induced immunosuppression, a leading cause of sepsis-related deaths worldwide. Although several studies already demonstrated distinct alterations of cytokine expression, phagocytotic capability and expression changes of particular receptor- and glycoproteins to be linked with the tolerant state in human monocytes, no study investigated changes of the whole glycoproteome on a global level. Due to the fact that most membrane-bound receptors are glycosylated, the characterization of the tolerant monocyte cell state by glycoproteomics using tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) might reveal new and useful markers to distinguish tolerant from naϊve cells and can provide possible new targets for improving immune-modulatory therapies. In this doctoral thesis, (a) PAMPs binding to cell surface-expressed pattern recognition receptors (PRRs) (TLR4 agonist LPS, TLR2/1 agonist Pam3CSK and TLR2/6 agonist MALP2), (b) PAMPs binding to intracellular PRR (NOD- like receptor (NLR) ligands 1 and 2; iE-DAP and MDP) and (c) the alarmin S100A12, signaling via the receptor for advanced glycation endproducts (RAGE) and TLR4, were examined for their capability to induce the monocyte tolerant state. Qualitative and quantitative analysis of glycoprotein expression changes in purified monocytes of three different peripheral blood donors were assessed with and without LPS-, Pam3CSK- and MALP2-stimulation and analyzed in the naϊve and tolerant state. Tolerance was measured by restimulation with LPS of monocytes that were prestimulated with adjusted concentrations of either LPS, Pam3CSK or MALP2. Prestimulation with all three PRR agonists led to highly decreased expression of the pro-inflammatory cytokines TNF-α and IL-6, which is consistent with the cells entering a tolerant state. NLR ligands iE-DAP and MDP induced only weak pro-inflammatory responses in human monocytes and none of the NLR ligands demonstrated a reduction of TNF-α expression in subsequent LPS challenges. Commercially available S100A12, that was efficient in inducing pro-inflammatory activation of monocytic THP-1 cells, was found to be significantly contaminated with LPS, as revealed by Limulus Amebocyte-Lysate (LAL) test. Further experiments with endotoxin-free, granulocyte-derived, purified S100A12 induced neither a pro-inflammatory activation of human monocytes nor tolerance. Thus, only the glycoproteomes of LPS-, Pam3CSK- and MALP2-stimulated monocytes, that induced the tolerant state, were analyzed in a mass spectrometry approach. Comparable numbers of glycoproteins (1003, 966 and 1033) were identified in purified human monocytes from each of the three donors, respectively. Altogether, 1176 annotated proteins were identified, originating from various cellular organells. 898 of the 1176 identified glycoproteins were predicted to contain at least one transmembrane domain, demonstrating that a high number of membrane spanning glycoproteins has been found. The majority of the identified glycoproteins were annotated in Gene Ontology (GO) as “plasma membrane” associated including 202 CD antigens and 54 GPCRs. Stimulation of the purified human monocytes with LPS, Pam3CSK or MALP2 induced significantly differential expression levels of 135 glycoproteins. From 75 glycoproteins annotated to be involved in glycan processing and maturation, only 4 demonstrated significantly expression changes, indicating no major changes in the glycosylation of the proteins which might have affected enrichment and quantification during LC-MS/MS analysis. The largest subset of differentially expressed glycoproteins was again annotated as plasma membrane-resident glycoproteins comprising 35 significantly regulated CD antigens. KEGG pathway analysis revealed an enrichment of CD antigens involved in cell adhesion processes (e.g. ITGAV (CD51) and ICAM-1(CD54)). Interestingly, all three TLR agonists led to highly similar changes in the glycoproteomes of the stimulated cells. Resemblance of the glycoproteomic signature was higher among the different stimuli than between the three donors due to interindividual differences in glycoprotein expression (e.g. HLA molecules) and donor-dependent sample purity. 75 glycoproteins demonstrated significantly increased expression levels, with PD-L1 (CD274), ITGB8 and IL7R (CD127) among the most highly upregulated glycoproteins. Collectin 12 (COLEC12) and lysophosphatidic acid receptor 6 (LPAR6) displayed the strongest decrease in their expression out of 60 significantly down-regulated glycoproteins. Whereas upregulation of PD-L1 and IL7R expression in monocytes of septic patients is a well-described phenomenon in the literature, this study identifies, for the first time, strongly upregulated expression of ITGB8 in tolerant human monocytes. ITGB8 is involved in the activation of latent TGF-β, a cytokine which was shown to contribute to and to be expressed increased during sepsis-induced immunosuppression. Taken together, the tolerant monocyte cell state is accompanied by differential expression of a series of glycoproteins. Changes in the monocytes glycoproteome were highly similar in cases of TLR2- and TLR4-mediated tolerance and revealed possible new biomarkers of the tolerant monocyte state like ITGB8, which should be validated in future in vivio studies.

Eine hohe Zahl septischer Patienten entwickelt eine Immunsuppression, die zu den wichtigsten Gründen Sepsis bedingter Todesursachen zählt. Endotoxin Toleranz menschlicher Monozyten trägt entscheidend zur Sepsis induzierten Immunsuppression bei und eine Reihe von Studien konnte zeigen, dass dieses tolerante Zellstadium mit spezifischen Veränderungen der pro- und anti-inflammatorischen Zytokinexpression, phagozytotischen Aktivität und Expression bestimmter Rezeptor- und Glykoproteine auf Monozyten assoziiert ist. Bisher erfolgte jedoch noch keine Untersuchung des Glykoproteoms toleranter Monozyten auf globaler Ebene: Dies wäre jedoch ein vielversprechender Ansatz neue Biomarker des toleranten Zellstadiums zu entdecken, da der größte Teil der auf der Zelloberfläche-exprimierten Rezeptoren glykosyliert ist. Diese Biomarker könnten einerseits der Unterscheidung toleranter von naiven Zellen dienen, als auch mögliche neue pharmakologische Angriffspunkte darstellen. Die vorliegende Studie untersuchte die pro-inflammatorische Aktivierung und Toleranz-Induktion in aufgereinigten CD14+ Monozyten durch verschiedene bakterielle Zellwandbestandteile (PAMPs). Verwendet wurden (a) PAMPs, die an PRRs der Zelloberfläche binden (TLR4-Ligand LPS, TLR2/1-Ligand Pam3CSK, TLR2/6-Ligand MALP2), (b) PAMPs, die an intrazellulär lokalisierte PRRs binden (NOD-like receptor (NLR)-Liganden 1 und 2; iE-DAP und MDP) und (c) das von Granulozyten synthetisierte Alarmin S100A12, ein Agonist des Receptor for Advanced Glycation Endproducts (RAGE) und TLR4. Veränderungen des Glykoprotein-Expressionsmusters naiver und LPS-, Pam3CSK- und MALP2-stimulierter Monozyten wurden von drei unterschiedlichen Blutspendern mittels Tandem-Massenspektroskopie (LC-MS/MS) qualitative und quantitative erfasst und verglichen. LPS-Restimulation LPS-, Pam3CSK- und MALP2-(vor)stimulierter Monozyten führte zu einer signifikant verminderten Expression pro-inflammatorischer Zytokine (TNF-α, IL-6), ein Merkmal, dass sich die entsprechend stimulierten Monozyten im toleranten Zustand befinden. Beide NLR-Agonisten, iE-DAP und MDP, induzierten eine messbare pro-inflammatorische Aktivierung, resultierten jedoch im Gegensatz zu den oben genannten TLR-Agonisten nicht in der Abnahme der TNF-α Expression bei anschließender LPS-Restimulation. Kommerziell erhältliches S100A12, zeigte eine pro-inflammatorische Aktivierung monozytärer THP-1 Zellen. Allerdings bestätigte der Limulus Amöbozyten-Lysat (LAL)-Test eine messbare Kontamination mit LPS. LPS-freies, von Granulozyten-gewonnen und aufgereinigtes S100A12 zeigte weder ein pro-inflammatorische Aktivierung noch eine Toleranzinduktion in Monozyten. Daher wurden in der nachfolgenden Massenspektroskopischen Analyse nur die Glykoproteome naiver und LPS-, Pam3CSK- und MALP2-stimulierter Monozyten untersucht. Insgesamt wurden 1176 Glykoproteine der aufgereinigten Monozyten von annähernd allen vorhanden Zellkompartimenten identifiziert und eine vergleichbare Anzahl an Glykoproteinen (1003, 966 und 1033) von allen 3 Spendern detektiert. 898 der 1176 identifizierten Glykoproteine enthielten mindestens eine Transmembran Domäne, entsprechend gelang es eine hohe Zahl an Membran-überspannenden Glykoproteinen zu isolieren. Der größte Anteil identifizierter Glykoproteinen wurde mittels Gene Ontology (GO) als „plasma membrane“-assoziiert annotiert und enthielt 202 CD Antigene und 54 G-Protein gekoppelte Rezeptoren. Stimulation der Monozyten mit LPS, Pam3CSK und MALP2 führte zur signifikant veränderten Expression von 135 Glykoproteinen. Nur 4 von insgesamt 75 Glykoproteinen, annotiert als involviert in unterschiedlichen Schritten der Protein-Glykosylierung, zeigten eine signifikant veränderte Expression, weshalb von keiner Beeinflussung der Glykoprotein Anreicherung oder massenspektroskopischen Quantifizierung auszugehen ist. Glykoproteine der Plasmamembran bildeten auch die größte Gruppe signifikant regulierter Glykoproteine, darunter 35 CD Antigene. KEGG Analyse ergab eine Anreicherung von CD Proteinen involviert in Zelladhäsions Prozessen (z.B. ITGAV (CD51) und ICAM-1 (CD54)). Interessanterweise resultierte die Stimulation der Monozyten mit allen 3 TLR Liganden in sehr ähnlichen Veränderungen des Glykoproteoms. Die Ähnlichkeit der Glykoprotein-Expressionsmuster war sogar größer zwischen den einzelnen Stimuli als zwischen den verschiedenen Blutspendern, wozu einerseits interindividuelle Unterschiede der Glykoproteinexpression (z. B. der HLA Antigene) und andererseits die Spender-abhängige Reinheit der verwendeten Proben beitrugen. 75 Glykoproteine demonstrierten signifikant erhöhte Expressionsraten, wobei sich PD-L1 (CD274), ITGB8 und IL7R (CD127) unter den am stärksten herauf regulierten Glykoproteinen befanden. Collectin 12 (COLEC12) und Lysophosphatic acid receptor 6 (LPAR6) zeigten unter den insgesamt 60 herunter regulierten Glykoproteinen die stärkste Abnahme ihrer Expression. Während die erhöhte Expression von PD-L1 und IL7R auf Monozyten septischer Patienten, und ihr Beitrag zur Sepsis induzierten Immunsuppression, ein in der wissenschaftlichen Literatur bekanntes Phänomen ist, konnte die vorliegende Studie zum ersten Mal deutlich erhöhte Expressionsraten von ITGB8 zeigen. ITGB8 ist in der Aktivierung des latenten, immunsuppressiven TGF-β involviert und stellt somit ein möglichen neuen Glykoprotein-Biomarker des toleranten Status von Monozyten dar, der unter Umständen sogar von pharmakologischen Interesse sein könnte. Die Validität dieses möglichen neuen Biomarkers bleibt jedoch in weiteren in vivo Studien zu überprüfen.

Vorschau

Zitieren

Zitierform:

Behnert, Andrea: Analysis and comparison of the glycoproteomic phenotype of TLR4- and TLR2-induced tolerance in human monocytes. Jena 2018.

Zugriffsstatistik

Gesamt:
Volltextzugriffe:
Metadatenansicht:
12 Monate:
Volltextzugriffe:
Metadatenansicht:

Grafik öffnen

Rechte

Nutzung und Vervielfältigung:
Alle Rechte vorbehalten

Export