Caspase-4-Aktivitätsassay mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie : eine sensitive Methode für die direkte Bestimmung in der Zellkultur am Beispiel der Chorionkarzinom-Zelllinie JEG-3

Bingel, Anne Theresa GND

Ziel dieser Arbeit war die Etablierung einer neuen Herangehensweise an die fluorimetrische Caspase-4-Aktivitätsbestimmung, unter Verwendung der RP-HPLC. Es sollte am Beispiel der Caspase-4 in adhärent wachsenden, humanen Chorionkarzinomzellen der Zelllinie JEG-3 gezeigt werden, dass eine direkte Aktivitätsmessung der Caspase-4 in der Zellkultur erfolgen kann, unter Verwendung des Zellkulturüberstands und des membrangängigen Caspase-4-Substrats (Ac-LEVD-AFC). Das Substrat diffundierte in die Zellen und wurde dort von aktiver Caspase-4 umgesetzt. Das abgespaltene fluoreszierende AFC diffundierte in den Zellkulturüberstand. Anschließend erfolgte darin die Konzentrationsbestimmung des AFC nach vorheriger chromatographischer Auftrennung von anderen fluoreszierenden Bestandteilen. Ein spezifischer membrangängiger Caspase-4-Inhibitor übte einen reduzierenden Effekt auf die Caspase-4-Aktivität der JEG-3-Zellkultur. Durch einen Pan-Caspase-Inhibitor sank diese noch weiter. Der Anteil an freigesetztem AFC, der in den Zellen verblieb, war 2,5-fach geringer. Dessen Bestimmung war fehlerbehafteter. AFC fluoreszierte maximal bei 490 nm, wurde es bei 400 nm angeregt. Das intakte Caspase-4-Substrat wies in diesem Bereich eine nicht zu vernachlässigende Fluoreszenz auf. Die chromatographische Auftrennung von AFC und Caspase-4-Substrat machte eine Messung am Fluoreszenzmaximum von AFC ohne Störsignale möglich. Der Wechsel zu einer Gradientenelution erbrachte eine bessere Quantifizierung im niedrigen Konzentrationsbereich (bis zu 0,2 pmol/ml), unter Verlängerung der Elutionszeit von freiem AFC. Bei der Lagerung der Zellkulturüberstände zeigte sich eine nicht-enzymatische AFC-Freisetzung, die erst nach sechs Stunden Lagerung bei Raumtemperatur signifikant war, bei -20°C-Lagerung nach sieben Tagen.

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Bingel, Anne: Caspase-4-Aktivitätsassay mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie. eine sensitive Methode für die direkte Bestimmung in der Zellkultur am Beispiel der Chorionkarzinom-Zelllinie JEG-3. Jena 2017.

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