G-Protein-gekoppelte Rezeptoren in Aspergillus fumigatus

Föge, Martin GND

Der saprophytisch lebende filamentöse Pilz Aspergillus fumigatus ist in der Lage, eine Vielzahl verschiedener Habitate zu besiedeln und wird daher mit einem breitem Spektrum an Stimuli konfrontiert. A. fumigatus ist ebenso in der Lage, den Menschen zu kolonisieren und dabei lebensbedrohliche Infektionen wie die Invasive Aspergillose in immunsupprimierten Patienten auszulösen. Daher wird A. fumigatus auch als bedeutendstes opportunistisches, über die Luft verbreitetes fungales Pathogen bezeichnet und dient als Modellorganismus für pilzliche Pathogene. Zur Wahrnehmung der sich ständig ändernden Umweltbedingungen verwendet dieser Ascomycet eine Reihe von Signaltransduktionssystemen, die ihm die Ausbildung einer geeigneten physiologischen Antwort ermöglicht. Intensive Forschung führte zur Identifikation von Genen, die mutmaßlich an diesen Signaltransduktionen beteiligt sind, jedoch ist das Wissen über Rezeptoren, die für die Auslösung dergleichen verantwortlich sind, bislang begrenzt. Von allen bekannten verschiedenen Varianten von Rezeptoren bilden die Sieben-Transmembrandomänen (7-TMD)-Rezeptoren die Gruppe mit der größten Anzahl und Diversität. Da die von ihnen ausgelöste Signaltransduktion von zytoplasmatisch lokalisierten G-Protein-Komplexen vermittelt wird, werden sie auch als G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) bezeichnet. Gegenwärtig ist wenig bekannt über die Funktion oder mögliche Liganden der 15 putativen GPCR-kodierenden Gene, welche im Genom von A. fumigatus kodiert sind. Um Erkenntnisse über den Einfluss auf die Steuerung fungaler Wachstums- und Entwicklungsprozesse sowie deren Bedeutung für die Pathogenität zu gewinnen, ist es wichtig die GPCRs zu charakterisieren. In der vorliegenden Arbeit werden die wichtigsten Resultate der durchgeführten Studien zur Funktion von GPCRs präsentiert. Zu Beginn wurde die genomweite Deletion von 13 putativen GPCR-Genen durchgeführt. Es fiel auf, dass die Deletion von einzelnen GPCRs den Wachstumsphänotyp in den jeweiligen Mutantenstämmen unter Standardkultivierungsbedingungen im Vergleich zum Wildtyp kaum beeinflusste. Weitere Tests zeigten, dass die meisten GPCR-Deletionsstämme eine Reduktion der Sporenbildung aufwiesen, wohingegen der Stamm ΔgprG eine erhöhte Anzahl an Sporen bildete. Dies wurde durch das Resultat kontrastiert, dass der Stamm ΔgprG gleichzeitig als einziger durch eine Reduktion des radialen Wachstums verglichen mit dem Wildtyp charakterisiert war. Die Analyse der Auskeimungsrate wurde mit Hilfe eines neu entwickelten Verfahrens durchgeführt, welches auf der Fixierung mit Formaldehyd und nachfolgender Anfärbung der Zellwand mit Calcofluor White für Fluoreszenzmikroskopie-gestützte Bildauswertung basierte. So konnte gezeigt werden, dass der Defekt im radialen Wachstum nicht auf verzögerter Auskeimung beruhte. Durch die Zugabe des Signaltransmittermoleküls cAMP konnte der Phänotyp des radialen Wachstums revertiert und Wildtyp-Level erreicht werden. Dies führte zum Schluss, dass der Stamm ΔgprG vermutlich einen konstitutiv niedrigeren cAMP-Spiegel aufweist. Desweiteren konnte gezeigt werden, dass der Stamm ΔgprG weniger extrazelluläre Matrix bildete. Dies war unabhängig von der Inokulationsdichte und war auch nicht auf verminderte Biomassebildung in Flüssigkulturen, welche generell Wildtyp-Niveau erreichten, zurückzuführen. Zusätzlich wurde eine Suche nach möglichen Liganden für die GPCRs in A. fumigatus durch Verwendung des Biolog-Systems durchgeführt. Im Zuge der Analysen des Wachstums in Gegenwart verschiedener Metabolite zeigte sich, dass einzelne Bedingungen zu verändertem Wachstum von GPCR-Deletionsstämmen führten. Dies ließ den Schluss zu, dass die Deletion von GPCRs es A. fumigatus nicht mehr ermöglichte, spezielle Metabolite wahrzunehmen. Besonders die Anwesenheit aromatischer Substanzen wie Phenylalanin führten zu einer erhöhten Biomassebildung des Stammes ΔgprG verglichen zum Wildtyp. Dies erlaubte die Formulierung eines Funktionsmodells für GprG, wonach dieser als Rezeptor für aromatische Liganden fungiert, welche antagonistisch auf diesen GPCR wirken und damit das Wachstum in ihrer Gegenwart blockieren. Um einen Zusammenhang zwischen einzelnen GPCR-Molekülen und ihren designierten G-Protein-Untereinheiten herzustellen, wurde eine Protein-Protein-Interaktionsstudie auf Basis des Split-Ubiquitin-Systems für zukünftige Arbeiten etabliert, um die Bildung von Rezeptor-spezifischen Signaltransduktionskomplexen nachzuweisen. In der Zusammenfassung lässt sich sagen, dass GPCRs in A. fumigatus eine Funktion als Nährstoffsensoren haben und einen Einfluss auf die Steuerung von Wachstum und Sporulation, gezeigt am Beispiel von GprG, besitzen. Dieser ist vermutlich an der Sensierung aromatischer Substanzen beteiligt. Desweiteren konnten neue Methoden für die Arbeiten mit diesem filamentösen Pilz etabliert werden. Grundsätzlich scheinen die hier vorgestellten Ergebnisse die Vermutung zu bestätigen, dass Signaltransduktionen in A. fumigatus einen redundanten Charakter haben, was diesem wichtigen opportunistischen Pilz ermöglicht, eine fein abgestimmte Antwort auf Umweltreize zu generieren.

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Föge, Martin: G-Protein-gekoppelte Rezeptoren in Aspergillus fumigatus. Jena 2016.

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