Zelluläres Sepsismodell : Untersuchung septischer Veränderungen am in vitro- Modell embryonaler Stammzellen der Maus im Vergleich zu septischen Veränderungen in vivo

In dieser Arbeit werden molekulare und zelluläre Veränderungen anhand eines in-vitro- Modells des Embryoid Body [EB] der murinen embryonalen Stammzell-[ES]-Linie CGR8 im Kontext der Sepsis untersucht. Zum Vergleich mit in- vivo Verhältnissen wurde Serum und Herzgewebe von Mäusen mit den Ergebnissen der ES verglichen. Die EB’s differenzieren spontan in immunkompetente Zellen. Als Oberflächenantigene wurden CD45, CD68, CD11b und F4/80 nachgewiesen. Um die ES und die Mäuse unter septischen Bedingungen auf ihre Reaktion zu testen, wurde ein starker inflammatorischer Reiz durch Escherichia coli [E.coli] gesetzt. Bei den EB’s wurde die „Multiplicity of Infection“ [MOI], bei den Mäusen die „Peritoneal Contamination and Infection“ [PCI] mit einer Faces-Suspension genutzt. Die potentiell immunkompetenten Zellen der EB’s sind zur Phagozytose fähig. Dieses konnte mit Hilfe von Green fluorescent protein [GFP]/Red fluorescent protein [RFP] -markierten E.coli als „Köder“ gezeigt werden. Desweiteren ließ sich die Phagozytose durch das Spindelzellgift Cytochalasin D unterbinden. Auch klinikrelevante Keime mit Extendend Spectrum Lactamasen-[ESBL]-Resistenz wurden im Modell phagozytiert. DCF- Untersuchungen mit Mäuseserum an den EB’s zeigten eine Zunahme der Reaktive-Oxygen-Spezies [ROS]. Auch Herzgewebe von Mäusen zeigte in der Immunhistochmie eine erhöhte ROS-Produktion während einer schweren Sepsis. Eine Erhöhung der NOX2-Genexpression konnte im Herzgewebe mittels PCR und bei den EB’s mit dem Western Blot nachgewiesen werden. Als Quelle der NOX2 wurden residente myokardiale Makrophagen im Herzgewebe sowohl mit Hilfe der Immunhistochemie als auch duch eine erhöhte CD11b-Genexpression in der PCR ausgemacht. Auch die EB’s zeigten in-vitro eine erhöhte NOX2- Genexpression nach inflammatorischem Reiz. Die EB’s überlebten die Sepsisinduktion durch MOI keine 24h. Während der Sepsisinduktion nahm die Vitalität der schlagenden Areale der EB’s ab und es konnte ein Anstieg des cardialen Troponins [cTN-I] nachgewiesen werden. Anschließend wurde Procalcitonin [PCT] als Marker der Sepsis in frühen Stadien getestet. Das PCT wurde nach inflammatorischem Reiz sehr schnell in den Überständen der EB’s positiv. Desweiteren konnten erhöhte Zytokinkonzentrationen in den Überständen der EB’s und der Mäuseseren nachgewiesen werden. Sowohl proinflammatorische Zytokine wie das Interleukin 6 [IL-6], Tumor-nekrose-Faktor α [TNF-α] und Monocyte-Chemotactic protein- 1 [MCP-1] als auch anti-inflammatorische Zytokine wie Interleukin 10 [IL-10] und Interleukin 12 [IL-12] zeigten Signifikanzen. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die EB’s als potentielles in-vitro Sepsismodell geeignet sind, da der multifaktorielle molekulare und zelluläre Ablauf der Infektion durch gram- negative Bakterien anhand dieses Modells nachvollzogen werden konnten. Die EB’s könnten also in zukunftigen Studien der Sepsis als tierversucharme Alternative genutzt werden.