Analyse des Verhaltens von Stammzellen und Plazentagewebe in Konfrontationskulturen

Röhler, Carolin

Hintergrund: Die Angiogenese und Vaskulogenese sind vielfach Gegenstand aktueller Forschungen, da man sich durch ein besseres Verständnis dieser Vorgänge erhofft, verschiedene Krankheiten wie Karzinome, chronische Entzündungen oder verschiedene Augenerkrankungen besser behandeln zu können. So gibt es bereits seit 2004 Medikamente, welche zur Tumorbehandlung eingesetzt werden, da sie an verschiedenen Stellen die Tumorangiogenese und damit das Tumorwachstum hemmen. Ebenfalls erforscht werden Mechanismen, die es verschiedenen Geweben ermöglichen, in anderes Gewebe einzuwachsen; ein Vorgang der physiologisch in der Schwangerschaft ist, jedoch auch bei bösartigen Tumoren auftritt. Ziel der Arbeit: Ziel der Arbeit war es, den Einfluss von Trophoblastgewebe auf das Wachstum und die Differenzierung von EBs zu untersuchen, das Invasions- und Migrationverhalten von reifem Plazentagewebe der maternalen oder fetalen Seite, immortalisierten Trophoblastzellen und Chorionkarzinomzellen nachzuvollziehen und die Wirkung verschiedener pro- und antiangiogene Substanzen zu testen. Methoden: Die Konfrontationskultur aus murinen EBs („Embryoid Bodys“) und multizellulären Tumorsphäroiden (MCTS) ist zur Untersuchung der Vaskulogenese und Angiogenese und der Invasion von Tumorzellen bereits etabliert. Diese Arbeit untersucht die Konfrontation der EBs mit MCTS aus Zellen der Chorionkarzinomzelllinie JEG-3 und Zellen der immortalisierten Trophoblastzelllinie HTR8/SVneo und die Konfrontation der EBs mit Plazentagewebe, welches aus verschiedenen Stellen der Plazenta entnommen wurde. Untersucht wurde der Einfluss der MCTS auf die Differenzierung der murinen Stammzellen in Gefäßstrukturen und auf das Wachstum der EBs. Weiterhin wurde geprüft, ob es eine Invasion der Trophoblastzellen in die EBs und eine Migration der MCTS-Zellen auf den EB gibt. Außerdem wurde der Einfluss verschiedener, von EB oder Ko-Kulturpartner sezernierter Zytokine auf die Größe und Differenzierung untersucht. Schließlich wurden EBs verschiedenen Alters immunhistochemisch gegen die spezifische alpha-Kette des IL-6-Rezeptors gefärbt. Es wurden 6 Tage alte EBs mit JEG-3-Sphäroiden, HTR8/SVneo-Sphäroiden und Plazentastückchen maternaler und fetaler Seite in hängenden Tropfen 3 Tage lang mit je 30µl Medium kokultiviert. Weiterhin wurden andere 6 Tage alte EBs 3 Tage lang in hängenden Tropfen mit IL-2, IL-6, IL-11 und VEGF behandelt. Nach Fixierung der Kontroll-EBs und der Ko-Kulturen aus EB und MCTS bzw. Plazentafragment erfolgte die Färbung gegen PECAM-1 (CD31) und anschließend eine Untersuchung und Aufnahme am CLSM. Die aufgenommenen Bilder wurden genau untersucht und Auffälligkeiten wurden beschrieben. Es erfolgte eine quantitative und qualitative Ausmessung der an PECAM-1 erkennbaren Gefäßstrukturen. Weiterhin wurden die Fläche der EBs und die Fläche, die auf den EBs von invadierten Trophoblastzellen eingenommen wurde, bestimmt und migrierte Trophoblastzellen wurden gezählt. Außerdem wurden die Bilder von gegen den IL-6-Rezeptor gefärbten EBs ausgewertet und die Fläche der IL-6-Rezeptoren wurde gemessen. Ergebnisse: Es zeigte sich, dass durch die Ko-Kultivierung mit HTR8/SVneo- oder JEG-3-Sphäroiden die Quantität der Angiogenese nicht beeinflusst werden konnte. Durch die Zugabe von VEGF zur Ko-Kultur aus EB und JEG-3-Sphäroid war die Angiogenese sogar geringer als in der Kontrolle. Die Gefäße der EBs in der Ko-Kultur mit HTR8/SVneo-Sphäroiden und JEG-3-Sphäroiden mit und ohne VEGF-Zugabe waren außerdem signifikant plumper als die Kontrollen und die der JEG-3-Sphäroide mit VEGF-Zugabe auch deutlich kürzer. Die Angiogenese wurde also durch die Trophoblastzellen bei Zusatz von VEGF eher gestört als induziert. Neben den Auswirkungen auf die Angiogenese konnte ein Einwachsen der Trophoblastzellen beobachtet werden. Während nur in wenigen Sphäroid-Ko-Kulturen die Trophoblastzellen invasiv in EBs einwachsen, wird die Integrität der EBs von den Zotten der Plazentastückchen vielfach durchbrochen. Durch die große Zottenfläche gibt es weit mehr Angriffspunkte dafür. In allen Versuchen konnten vom Sphäroidzellverband losgelöste und auf den EB migrierte Trophoblastzellen beobachtet werden. Außerdem waren EBs von Ko-Kulturen in allen Versuchen kleiner als die jeweiligen Kontrollen, während die EBs der Ko-Kultur mit Plazentagewebe der maternalen und der fetalen Seite der Plazenta signifikant größer waren. Möglicherweise haben die Tumorzellen die EBs teilweise lysiert, oder sie haben zumindest Nährstoffknappheit bedingt, wohingegen die Plazentazellen das Wachstum der EBs vielleicht durch Wachstumsfaktoren sogar gefördert haben. Für IL-6 konnte, anders als für VEGF, keinen Einfluss auf die Angiogenese nachgewiesen werden. IL-2 und IL-11 zeigten geringe qualitative, jedoch keine quantitativen Effekte. Keines dieser Interleukin hatte einen Einfluss auf die Größe der EBs. Die Expression des IL-6-Rezeptors in EBs wurden frühestens ab Tag 8 beobachtet. Schlussfolgerung: Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass IL-6 keinen Einfluss auf die Angiogenese während der Tage der Ko-Kultivierung haben kann, da der Rezeptor erst später exprimiert wird.

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Röhler, Carolin: Analyse des Verhaltens von Stammzellen und Plazentagewebe in Konfrontationskulturen. 2015.

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