Synthese funktionalisierter Bisenolcarbonsäureester zur selektiven Markierung von Esterasen und zur Inhibierung von Oxidasen

Richter, Phillipp

Caulerpenin, ein Bisenolcarbonsäureester, ist der Hauptsekundärmetabolit der Grünalgenspezies Caulerpa spp. Diese Alge besteht aus einer einzigen makroskopischen Zelle mit mehreren Zellkernen. Durch diesen Aufbau würde bei einer Verwundung der Zelle das gesamte Cytosol in das umgebende Medium austreten, da keine Zwischenwände einen kompletten Verlust verhindern. Bei Verletzung der Alge wird Caulerpenin enzymatisch in einen 1,4-Dialdehyden mit Michaelakzeptorsystem, das Oxytoxin 2, überführt. Diese sehr reaktive Dialdehyd reagiert anschließend mit den Proteinen des Cytosols, um ein Biopolymer zu formen, das provisorisch die Wunde verschließt. Diese besondere Wundverschlussreaktion wurde benutzt, um eine Esterasen-selektive molekulare Sonde nach dem Activity-based-protein-profiling zu erstellen. Im Gegensatz zu dem Naturstoff Caulerpenin wurde jedoch die sekundäre Acetatgruppe, die für die Bildung des Michaelakzeptorsystemes verantwortlich ist, nicht mit in das Molekül integriert. Dadurch konnte der Verbindung die Protein-polymerisierenden Eigenschaften entzogen werden, sodass eine bessere Eignung für die Proteinanalytik gewährleistet wurde. Das dafür benötigte fluoreszente Bienolacetat wurde in einer sechsstufigen Synthese hergestellt. Inkubationen dieses Bisenolacetat mit verschiedenen Esterasen sowie Lipasen und anschließender Gelelektrophorese zeigten, dass ausschließlich Esterasen markiert wurden, obwohl LC-MS Messungen zeigten, dass beide Enzymklassen das Bisenolacetat in den Protein-reaktiven Dialdehyden überführten. Verlängert man die Carbonsäurereste zu Capronaten bzw. Stearaten, welche in einer analogen Synthese wie das Bisenolacetat hergestellt wurden, konnte keine Veränderung der Selektivität beobachtete werden. Bisenolcapronate markierten die gleichen Esterasen wie Bisenolacetate und das stark verlängerte Bisenolstearat zeigt keinerlei Markierung von Lipasen und/oder Esterasen. Die Sequenzierung einer mit dem Bisenolacetat inkubierten Schweineleberesterase bewies den postulierten Markierungsmechanismus über eine Pyrrolringbildung am Amin des Lysins mit dem 1,4-Dialdehyden. Insgesamt acht der 35 Lysine an der Schweineleberesterase wurden modifiziert und waren auf der Innenseite der Esterase lokalisiert, welche ebenfalls die aktive Tasche des Enzymes beherbergte. Dies bewies die Notwendigkeit der aktiven Hydrolyse des Bisenolacetates durch die Esterase. Zusätzlich zu diesen Wechselwirkungen mit Hydrolasen wurde der Einfluss verschiedener Bisenolcarbonsäureester auf Oxidasen untersucht. Bisenolacetate hemmten Xanthinoxidase aus Kuhmilch und Lipoxygenase aus menschlichen polymorphonukleären Leukozyten (PMNL). Durch das Aufstellen einer Substanzbibliothek aus Bisenolestern verschiedener Carbonsäuren und verschiedener Seitenketten am Butadiensystem und dem Naturstoff Caulerpenin konnten Struktur-Wirkungsmechanismen aufgestellt werden. So hemmten die Bisenolester der Capron- und Stearinsäure schlechter 5 Lipoxygenase als die entsprechenden Bienolacetate. Wird die Seitenkette am Butadiensystem abgesättigt bzw. entfernt, verlieren die Bisenolacetate fast komplett ihre inhibierenden Eigenschaften. Das hier vorgestellte Bisenolacetat mit ungesättigter n-Petinyl Substitution zeigte dabei einen unterschiedlichen IC50-Wert wie der Naturstoff Caulerpenin (11,8 µM und 4,2 µM) gegenüber isolierter 5 Lipoxygenase, wobei in den zellbasierten Assays ähnliche IC50-Wert detektiert wurden (5,1 µM und 5,9 µM bei PMNL ohne hinzugefügte Arachidonsäure bzw. 21,0 µM und 18,8 µM bei PMNL mit hinzugefügter Arachidonsäure). Beiden Bisenolacetaten lag zudem ein unterschiedlicher nicht-redoxaktiver Inhibierungsmechanismus zugrunde. So hemmt das hier vorgestellte Bisenolacetat ausschließlich 5-Lipoxygenase in einem reversiblen und kompetitiven (bezogen auf Arachidonsäure) Mechanismus; wohingegen Caulerpenin teilreversibel und unkompetitiv (bezogen auf Arachidonsäure) 5-, 12- und 15 Lipoxygenase inhibiert. Xanthinoxidase aus Kuhmilch wurde mit einem IC50-Wert von 5,5 µM durch ein Bisenolacetat mit ungesättigter Seitenkette ähnlich stark in ihrer Aktivität gehemmt werden wie der Naturstoff Caulerpenin (3,9 µM). Die Verlängerung der Säureketten ergab, wie bei der Lipoxygenase, eine Erhöhung des IC50-Werts, jedoch verblieb die hemmende Wirkung fast vollständig, wenn die Seitenkette entfernt wurde.

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Richter, Phillipp: Synthese funktionalisierter Bisenolcarbonsäureester zur selektiven Markierung von Esterasen und zur Inhibierung von Oxidasen. 2015.

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