Generierung B-Zell-Rezeptor retrogener Mäuse

Freitag, Jenny Franziska

Die Generierung retrogener (rg) Mäuse wurde erstmals im Jahr 2006 von Holst et al. für TZRs beschrieben. Wir waren an der Generierung B-Zell rg Mäuse interessiert, mit dem Ziel, die Bedeutung Antigen-spezifischer B-Lymphozyten im Modell der G6PI-induzierten Arthritis näher zu untersuchen. Als Modell-BZR für die erstmalige Generierung BZR rg Mäuse entschieden wir uns für den gut charakterisierten Lysozym-spezifischen BZR MD4, einem membrangebundenem IgM (Igμmem). Allgemein können mithilfe der rg Methode zwei oder mehr Proteine von einem über ein 2A-Peptid verbundenen, multizistronischen retroviralen Vektor durch retroviral-vermittelten Stammzellgentransfer in Mäusen exprimiert werden. Dabei ermöglicht das selbst-spaltende 2A-Peptid die stöchiometrische Expression der Zielproteine, was vor allem bei koexprimierten Molekülen von enormer Bedeutung ist. Für die Generierung der MD4 rg Mäuse, wurden die Lysozym-spezifische Igμmem- und Igκ-Kette über eine Furin- und nachfolgende FMDV-2A-Peptidsequenz miteinander verbunden. Die Effizienz der vom Furin bzw. der 2A-Protease vermittelten Spaltung wurde im Western Blot mit μH- und κ-spezifischen Antikörpern untersucht. Weiterhin konnte der rg MD4 BZR erfolgreich auf der Zelloberfläche der rag-defizienten Pro-B-Zelllinie R5B exprimiert werden. Die Analyse der rekonstituierten Wildtypmäuse zeigte, dass der rg MD4 BZR vorwiegend intrazellulär, nicht jedoch auch der Zelloberfläche der B-Lymphozyten exprimiert wurde. Darüber hinaus konnten IgMb+eGFP+ Zellen detektiert werden, die vermutlich chimäre Rezeptoren darstellen. Schließlich wurden rag-/- Mäuse mit dem rg BZR rekonstituiert, um eine mögliche Konkurrenz mit endogenen BZRs sowie die Bildung chimärer Rezeptoren zu unterbinden. Hier konnte der rg MD4 BZR in nur geringer Frequenz intrazellulär und – in Übereinstimmung mit dem vorherigen Ergebnis – nicht auf der Zelloberfläche der analysierten B-Lymphozyten detektiert werden. Zusammenfassend wurde in der vorliegenden Doktorarbeit versucht, die neuartige Methode der Generierung retrogener Mäuse auf B-Zell-Rezeptoren anzuwenden. Jedoch scheint dieser Ansatz zur in vivo Expression von B-Zell-Rezeptoren nicht geeignet zu sein.

The generation of retrogenic (rg) mice has been described for various T cell receptors. We were especially interested in the generation of BCR rg mice to further investigate the role and importance of antigen-specific B cells in the G6PI-induced arthritis model, where B (and T) cells are necessary for disease induction. To determine if the retrogenic approach is also suitable for the generation of B cell rg mice, we set out to generate a novel mouse model using well characterized BCRs such as anti-HEL MD4. We assumed that analysing these B cell rg mice would help to evaluate and to better understand this novel technique, as their transgenic counterparts are well characterized, e.g. in aspects of tolerance induction. By using the rg approach, two or more proteins can be expressed from a single 2A peptide-linked multicistronic retroviral vector in mice through retrovirus-mediated stem cell gene transfer, while the 2A peptide allows for the stoichiometric expression of target proteins which is crucial for protein co-expression. Attempting to generate anti-HEL IgMmembrane (Igμmem) rg mice, HEL-specific Igκ and Igμmem chains were linked via a furin cleavage site followed by a FMDV-2A peptide sequence to build recombinant MD4 that was ligated into a retroviral based target vector. Western Blot analysis using κ- and μ-chain specific antibodies showed correct cleavage of the furin – 2A peptide. Furthermore, we could show in vitro surface expression of the recombinant anti-HEL Igμmem BCR by transducing the rag-deficient cell line R5B. By reconstituting wildtype mice, we were only able to detect the rg BCR intracellularly but not on the surface of B cells. Finally, we reconstituted rag-/- mice to assess the expression of the rg MD4 BCR in these mice and to rule out possible competition by endogenous BCRs. From our findings, the rg MD4 BCR was detectable in very low frequencies intracellularly and absent on the surface of the analysed cells comparable to our previous results. Overall we aimed at generating a novel BCR rg mouse model and for the first time BCR-expression in vivo.

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Freitag, Jenny Franziska: Generierung B-Zell-Rezeptor retrogener Mäuse. 2015.

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