Enzymassays mit Kapillarelektrophorese

Abromeit, Hans GND

CE-basierte Assays wurden sowohl für SIRT1 als auch für die 5 Lipoxygenase entwickelt und angewendet. Für SIRT1 wurden zwei potentielle nichtpeptidische Substrate basierend auf der Grundstruktur des Aminosäurederivates Lys(Ac) synthetisiert. N-terminal am Lys(Ac) wird neben dem in peptidischen Substraten genutzten Amid auch ein Amin zur Verknüpfung einer chromophoren Gruppe vom Enzym akzeptiert, wie auch über Dockingstudien bestätigt wurde. In dem CZE Assay konnten das Substrat, das korrespondierende deacetylierte Produkt, das Koprodukt Nikotinsäureamid sowie der interne Standard erfolgreich getrennt und quantifiziert werden. FASI wurde zur Sensitivitätserhöhung als Stackingmethode implementiert. Die bestimmten enzymkinetischen Parameter liegen in vergleichbarer Größenordnung mit entsprechenden Substraten der Literatur. Durch Inhibitoren wurde die Umsetzung des Substrats verringert. Für den 5-Lipoxygenase-Assay wurden sowohl eine CD-basierte MEKC- als auch eine CD-basierte MEEKC-Methode entwickelt. Neben dem internen Standard PGB1 konnten sieben Analyte in zwanzig respektive zehn Minuten getrennt werden. HC-FASS wurde als Stackingmethode etabliert. Für die MEKC-Methode wurden sechs Faktoren mittels chemometrischer Methoden in Bezug auf Auflösung und Migrationszeit optimiert. Inkubationsproben führten bei der univariant entwickelten MEEKC-Methode zu einem Matrixpeak. Sowohl in der MEKC als auch in der MEEKC konnte der hydrophile CYP-Metabolit 20-OH-LTB4 detektiert werden, welcher in der routinemäßig eingesetzten HPLC-UV/VIS-Methode nicht erfasst werden kann. Ein Ersatz der kieselgelbasierten C18-Phase zur Festphasenextraktion durch einen polymerbasierten schwachen Anionenaustauscher führte zu Verbesserungen der Wiederfindungsraten bezüglich der HPLC-Methode. Die Peakflächen der CE-Methoden vergrößerten sich in ausgeprägterem Maße. Die Stackingeffizienz korelliert direkt mit Elektrolytrückständen in der Probe.

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Abromeit, Hans: Enzymassays mit Kapillarelektrophorese. 2014.

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