Molekulare Marker in der Krebsvorsorge : Entwicklung eines Sandwich-ELISA zum Nachweis des humanen Papillomavirus Typ 45 Onkoprotein E7 und funktionelle Charakterisierung des Transmembranproteins TSPAN1/NET-1 hinsichtlich seiner Rolle bei der Entwicklung des Zervixkarzinoms

Hölters, Sebastian GND

Das Zervixkarzinom ist die dritt-häufigste Krebserkrankung der Frau weltweit und weist eine Sterblichkeitsrate von circa 50% auf. Voraussetzung für die Entwicklung des Zervixkarzinoms ist eine persistierende Infektion mit humanen Papillomaviren (HPV). Die derzeitig angewandten Methoden in der Krebsvorsorge, beruhen auf der zytologischen Bewertung der durch Abstriche entnommenen Zellen vom Muttermund und dem Nachweis auf DNA der humanen Papillomaviren, welche hauptverantwortlich für die Entstehung des Zervixkarzinoms sind. Aufgrund des niedrigen positiven Vorhersagewertes dieser Tests für den Nachweis von schwer-gradigen Präkanzerosen (CIN) und Karzinomen, ist es erforderlich unterstützende Nachweisverfahren für aussagekräftige molekulare Marker zu entwickeln. Dafür könnte sich der Nachweis der viralen Onkoproteine anbieten. Es wurde ein Sandwich-ELISA Verfahren zum Nachweis des humanen Papillomavirus Typ 45 (HPV45) Onkoproteins E7, auf der Basis von neu generierten monoklonalen Antikörpern, entwickelt. Mithilfe dieses Tests konnte das E7 Protein aus Zelllinien sowie Gewebematerial von Zervixkarzinomen nachgewiesen werden. Weiterhin wurden 223 Zelllysate, aus Zell-Abstrichen der Endo-und Ektozervix, untersucht. Dabei wurde eine von zwei Frauen mit HPV45 positiven leicht-gradigen CIN richtig erkannt aber auch fünf HPV-negative Frauen sowie zwei Frauen mit einem anderen HPV-Typ. Daraus resultiert, hinsichtlich der HPV-DNA-Bestimmung als Referenz Methode, eine Spezifität von 96,8% sowie eine Sensitivität von 14,3%. Hinsichtlich der histologisch positiven Befunde als Referenz, ergab sich eine Spezifität von 100% und eine Sensitivität von 50%. Dieses Ergebnis impliziert, dass durch den Nachweis des E7 Proteins anstelle von HPV-DNA ein höherer positiver Vorhersagewert in der Krebsvorsorge erzielt werden kann. Aufgrund der geringen Anzahl HPV45 positiver Proben ist die Validierung des entwickelten Sandwich-ELISA jedoch noch nicht abgeschlossen. Neben dem viralen Onkoprotein E7 ist das Transmembranprotein Tetraspanin 1 ein weiteres potentielles Markerprotein. Tetraspanin 1 wird in einer Subgruppe schwer-gradiger CIN sowie in Zervixkarzinomen überexprimiert. Um die Rolle von Tetraspanin 1 als Markerprotein zu prüfen sollte es im Hinblick auf die Zervixkarzinogenese näher charakterisiert werden. Dazu dienten die Zervixkarzinomzelllinien SiHa und HeLa als Modell. In immunhistochemischen Untersuchungen an Gewebematerial zeigte sich eine verstärkte Expression von Tetraspanin 1 in Zellen der Wachstumsfront einiger schwer-gradiger Neoplasien und Zervixkarzinome. Durch Invasionsversuche konnte gezeigt werden, dass Tetraspanin 1 eine gesteigerte Invasivität, beider Zervixkarzinomzelllinien, verursacht. Eine Veränderung der Zell-Matrix-Adhäsion in Abhängigkeit von Tetraspanin 1 konnte jedoch ausgeschlossen werden. Um die genauen Mechanismen für die erhöhte Invasivität zu untersuchen, wurden die Signalproteine focal adhesion kinase (FAK), Paxillin und die Protein Kinase B (Akt/PKB) im Rahmen der Integrin-vermittelte Signaltransduktion untersucht. Jedoch konnten keine Veränderungen im Phosphorylierungsstatus festgestellt werden was eine Steuerung der Invasion durch Tetraspanin 1 über diese Signalproteine ausschließt. Entgegen der gesteigerten Invasivität durch Tetraspanin 1 wurde eine verminderte Expression der Matrix Metalloproteinase MMP14 festgestellt, dieses Ergebnis muss jedoch, aufgrund der geringen Anzahl an Versuchen, in weiteren Untersuchungen noch bestätigt werden. Neben dem Einfluss von Tetraspanin 1 bei der Zellinvasion, wurde ebenfalls eine mögliche Beteiligung an der Zellproliferation untersucht. Hierbei zeigte sich jedoch kein Effekt durch Tetraspanin 1 hinsichtlich adhärenten sowie Zell-Matrix-Kontakt unabhängigen Wachstums. Durch Untersuchung des Mitogen-aktivierte Protein Kinase (MAPK) Signalweges über den Epidermalen Wachstumsfaktor Rezeptor (EGFR) wurde dieses Ergebnis auf Signaltransduktionsebene bestätigt. Auch wenn Tetraspanin 1 die Zellproliferation nicht beeinflusst, ist es mit der Zervixkarzinogenese assoziiert da es die Invasivität von Zervixkarzinomzellen erhöht. Weiterhin wird Tetraspanin 1 in einer Subgruppe schwer-gradiger, präkanzeröser Vorstufen verstärkt exprimiert. Aus diesen Gründen könnte Tetraspanin 1, als zelluläres Protein, einen weiteren molekularen Marker für die Krebsvorsorge des Zervixkarzinoms darstellen. Eine Steigerung der Spezifität und somit des positiven Vorhersagewertes in der Krebsvorsorge durch den Nachweis des viralen Onkoproteins E7 in Zellabstrichen erscheint realisierbar und könnte eventuell durch Tetraspanin 1 als nicht-viraler Marker weiter verbessert werden.

Cervical cancer is the third most common cancer among women worldwide and has a mortality of about 50%. Persistent infection with high-risk human papillomaviruses is a prerequisite for the development of cervical cancer. Currently used methods for primary cervical cancer screening are based on cytology and HPV-DNA detection. Owing to the low positive prediction value of these tests for the detection of precancers (CIN2/3) and cancer we aim to develop novel screening tests based on new molecular markers. Therefore we generated monoclonal antibodies and established a Sandwich-ELISA for the detection of the human papillomavirus type 45 (HPV45) oncoprotein E7. This test detects the HPV45 E7 protein in lysates from cervical cancer cell line and cervical cancer tissue. Furthermore lysates from 223 cervical smears were analysed. One of two patients with HPV45 positive low grade CIN, but also five women who were HPV-negative and two women with other HPV-types were detected. Consequently, the Sandwich-ELISA revealed a specificity of 96.8% and a sensitivity of 14.3% in comparison with HPV-genotyping as the reference method. Regarding the histology the Sandwich-ELISA revealed a specificity of 100% and a sensitivity of 50%. This data implies that the detection of the HPV oncoprotein E7 instead of HPV DNA may have a higher positive predictive value in a screening setting. Because of the low number of HPV45 positive specimens the validation of the assay is not yet finalized. In addition to HPV45 E7 the transmembrane protein tetraspanin 1 may also be a suitable molecular marker for the detection of CIN and cancers. Tetraspanin 1 is overexpressed in a subgroup of high grade cervical intraepithelial neoplasia and cervical cancer. To characterise the role of tetraspanin 1 in cervical carcinogenesis the cervical cancer cell lines SiHa and HeLa were used. Immunhistological analyses have shown overexpression of tetraspanin 1 at the growth front of high-grade neoplasia and cervical cancers. Invasion assays revealed an increased invasiveness of HeLa and SiHa after ectopic expression of tetraspanin 1. Tetraspanin 1 dependent changes in adhesion to extracellular matrix components could be excluded. To elucidate the mechanisms contributing to increased invasion, the integrin-mediated activation of focal adhesion kinase (FAK), paxillin and protein kinase B (Akt/PKB) was analysed. No tetraspanin 1 dependent alterations in integrin-mediated signalling were found. In contrast to the increased invasion due to tetraspanin 1 overexpression, a decreased expression of matrix metalloproteinase 14 (MMP14) was noted. Owing to the limited number of experiments these result must be confirmed. Furthermore the influence of tetraspanin 1 on cell proliferation was analysed. Tetraspanin 1 had no effect on adherent or cell-matrix-contact independent cell growth. This was confirmed by analysis of epidermal growth factor receptor and mitogen-activated protein kinase (MAPK) activation, which were also unaffected by tetraspanin 1. Even though cell proliferation is not affected by tetraspanin 1, its expression does increase cell invasion. Moreover, since the protein is strongly expressed in a subgroup of CIN2/3 and in most cancers, it is a further candidate molecular marker for cervical cancer screening.

Zitieren

Zitierform:

Hölters, Sebastian: Molekulare Marker in der Krebsvorsorge. Entwicklung eines Sandwich-ELISA zum Nachweis des humanen Papillomavirus Typ 45 Onkoprotein E7 und funktionelle Charakterisierung des Transmembranproteins TSPAN1/NET-1 hinsichtlich seiner Rolle bei der Entwicklung des Zervixkarzinoms. 2013.

Zugriffsstatistik

Gesamt:
Volltextzugriffe:
Metadatenansicht:
12 Monate:
Volltextzugriffe:
Metadatenansicht:

Grafik öffnen

Export