Identifizierung und funktionelle Charakterisierung von putativen Seneszenzgenen auf Chromosom 4q und 10p in Bezug auf das HPV-induzierte Zervixkarzinom

Liesenfeld, Melanie

Prädisponierend für die Entstehung eines Zervixkarzinoms ist die persistierende Infektion mit humanen Papillomaviren (HPV), insbesondere den Hochrisiko-Typen (HR) 16 und 18. Von 100 infizierten Frauen entwickeln circa 1 - 2 Frauen ein Zervixkarzinom. Dieses geht in der Regel aus einer prämalignen Neoplasie (cervical intraepithelial neoplasia, CIN) hervor. Hierbei unterscheidet man leichtgradige (CIN1) und schwergradige (CIN2/3) Neoplasien, die auch unbehandelt abheilen können. Mit steigendem Dysplasiegrad wird jedoch die Wahrscheinlichkeit größer, ein Zervixkarzinom zu entwickeln. Bis heute werden daher die meisten CIN2 und alle CIN3 operativ entfernt. Zusätzlich zur Infektion mit einem HR-HPV-Typ sind genetische Veränderungen der befallenen Zelle für die Tumorentstehung entscheidend. Durch vorangegangene Mikrozell-vermittelte Chromosomentransfer-Analysen wurde der Verlust der chromosomalen Regionen 4q35.1-qter und 10p14-15 kausal mit dem Prozess der Immortalisierung in Verbindung gebracht. Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war darauf aufbauend die spezifische Identifikation und Validierung putativer Tumorsuppressorgene, welche gegenüber CIN im Zervixkarzinomen (CxCa) signifikant schwächer exprimiert werden. Dazu wurden Gefrierschnitte ausgewählter CIN3 und CxCa angefertigt und dysplastische bzw. Tumorareale mikrodissektiert. Aus den Proben wurde die RNA isoliert und die Quantität sowie die Qualität der RNA bestimmt. Nach dem Umschreiben der RNA in cDNA und deren Markierung konnten Whole Human Genome Micorarrays hybridisiert werden. Es fanden sich 19 verringert exprimierte Gene, die mittels real-time PCR validiert wurden. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurden neun der 19 identifizierten Gene funktionell charakterisiert. Um den Gentransfer optimal zu gewährleisten, erfolgte die Etablierung einer Transduktionsmethode auf Basis von Lentiviren. Der lentivirale Vektor in Verbindung mit weiteren Plasmiden, die die Gene für die Produktion von Lentiviren trugen, wurden in die Verpackungszelllinie HEK293T transfiziert. Für die funktionellen Analysen wurden geeignete Zelllinien und primäre Zellen (Fibroblasten und Keratinozyten) stabil transduziert. Im Vordergrund stand die Induktion von Seneszenz durch Genkomplementation. Um die Seneszenzinduktion einzelner Gene zu überprüfen, wurden die Zellen dem Seneszenz-assoziierten Galactosidase-Assay unterzogen. Im Ergebnis der Seneszenz-Tests zeigten die Gene SORBS2 und TLR3 nach Transduktion in Fibroblasten und Keratinozyten eine deutlich größere Anzahl seneszenter Zellen als in der Negativ-Kontrolle (Leervektor und Mock-Transduktion). Hingegen konnte in immortalen Zelllinien Seneszenz nicht induziert werden. Möglicherweise ist die Expression mehrerer Gene notwendig, um die multiplen Aberrationen zu komplem entieren. Eine weitere funktionelle Charakteristik von Tumorsuppressorgenen ist der negative Einfluß auf das Zellwachstum. In Abhängigkeit vomWachstumsverhalten der transduzierten Zellen erfolgte nach mehreren Tagen die Analyse der Proliferation mittels MTT-Assay. Der Proliferationstest brachte nach der Expression bestimmter Gene erste Hinweise auf ein verringertes Wachstum in einzelnen Zelllinien. So zeigten die Gene DIP2C, IL15RA und WDR37 einen negativen Einfluß auf das Zellwachstum, SORBS2 und TLR3 verlangsamten diesen Prozess ebenfalls. Mit der Seneszenzinduktion und Proliferationsreduktion zeigten die Gene SORBS2 und TLR3 typische Eigenschaften von Tumorsuppressorgenen. Dies deutet darauf hin, dass der Verlust dieser beiden in der chromosomalen Region 4q35 lokalisierten Gene mit Immortalität in Verbindung gebracht werden kann.

A predisposing factor for the development of cervical cancer is a persistent infection with human papillomavirus (HPV), especially the high-risk types (HR) 16 and 18. About 1-2 % of HPV-infected women develop cervical cancer. The cancer arises usually from a pre-malignant neoplasia (cervical intraepithelial neoplasia, CIN). These CINs, which principally can disappear without treatment are classified into mild (CIN1) and severe (CIN2/3) neoplasia. With increasing degree of dysplasia, however, the probability to develop a cervical cancer also increases. To date, therefore, most CIN2 and all CIN3 lesions are surgically removed. In addition to the infection with an HR-HPV type, genetic changes in the infected cell are crucial for tumour development. On the basis of previous micro cell mediated chromosome transfer analyses the chromosomal regions 4q35.1-qter and 10p14-15 were characterised as relevant for immortalisation. Taking this into account one aim of this work was the identification and validation of putative tumour suppressor genes which are expressed at a significantly reduced level in the cervical carcinoma (CxCa) than in CIN. For this purpose, frozen sections of selected CIN3 and CxCa were prepared and dysplastic and tumour areas micro dissected, respectively. RNA was isolated from the tissue specimens and quantity as well as quality of the RNA measured. After reverse transcription of the RNA into cDNA this was hybridised on Whole Human Genome Mircoarrays. Nineteen genes in the region of interest showing down-regulation were validated using real-time PCR. In the second part of the work nine out of the 19 identified genes were characterised functionally. To ensure that gene transfer occured optimally, a transduction method based on lentiviruses was established. The lentiviral vector in combination with other plasmids, which containing the genes for lentiviral production, were transfected into the packaging cell line HEK293T. Various cell lines and primary cells (fibroblasts and keratinocytes) were stably transduced for the functional assays. With the background knowledge that the genes were located in chromosomal regions, the loss of which yielded immortality, the focus was on the induction of senescence by gene complementation. In order to check the induction of senescence, transduced cells were fixed and a senescence-associated galactosidase assay was performed. After transduction of the genes SORBS2 and TLR3 into fibroblasts and keratinocytes the results of the senescence tests showed a clearly larger number of senescent cells than in the negative controls (empty vector and mock transduction). More over, neither SORBS2 nor TLR3 could induce senescence in immortalised cell lines. It may be postulated that the expression of several genes is necessary to complement multiple aberration. Furthermore, another typical property of tumour suppressor genes is a negative influence on proliferation. After several days, depending on the growth behaviour of the cells, analysis of proliferation was carried out using MTT-assay. The proliferation test performed after the expression of certain genes brought the first indications of reduced growth in some cell lines. The genes DIP2C, IL15RA and WDR37 had a negative influence on cell growth, and SORBS2 and TLR3 also slowed the process. With the induction of senescence and the reduction of proliferation, SORBS2 and TLR3 revealed typical characteristics of functional tumour suppressor genes. This points to the fact that the loss of these two genes, both of which are localised in the chromosomal region 4q35, can be associated with immortality.

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Liesenfeld, Melanie: Identifizierung und funktionelle Charakterisierung von putativen Seneszenzgenen auf Chromosom 4q und 10p in Bezug auf das HPV-induzierte Zervixkarzinom. 2012.

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