Der Einfluss von SRC-Kinasen auf die Signaltransduktion des Interleukin-33-Rezeptors in Mastzellen

Löhn, Tobias

Interaktionen zwischen dem Zytokin Interleukin-33 und seinem Rezeptor IL-33R sind bis dato vor allem an Mastzellen und Typ-2-T-Helferzellen (Th2-Lymphozyten, Th2­Zellen) untersucht worden. Durch ihre pathogenetische Rolle u.a. in Tiermodellen des Asthma bronchiale, der rheumatoiden Arthritis sowie der Atherosklerose deuteten sie bereits auf eine hohe klinische Relevanz hin. Dennoch ist die Signaltransduktion des IL-33R aktuell nur unzureichend erforscht. Die Bindung von IL-33 an seinen Rezeptor bewirkt über die Assoziation intrazellulärer Adapterproteine eine Aktivierung diverser MAP-Kinasen (engl. mitogen-activated protein kinases) wie ERK1/2, JNK1/2 und p38 sowie des Transkriptionsfaktors NF-.B. Diese Signalprozesse führen letztendlich zur Initiierung zelltyp-spezifischer Effektorfunktionen wie z.B. der Sekretion von Entzündungsmediatoren und proinflammatorischer Zytokine durch Mastzellen. Drube et al. konnten 2010 in ihrer Studie zeigen, dass die biologische Funktion des IL-33R von der Aktivität der Rezeptortyrosinkinase c-Kit, welche auf Mastzellen konstitutiv exprimiert wird, abhängig ist: Die Kostimulation mit dem c-Kit-Liganden stem cell factor (SCF) ist für die vollständige Aktivierung der IL-33R-vermittelten Signaltransduktion und Zytokinsekretion notwendig. Als strukturelle Basis für diese Interaktion konnte die Formation eines Rezeptorkomplexes, bestehend aus c-Kit, IL-33R und dem IL-1­receptor-accesory protein (IL-1RAcP), identifiziert werden. Der genaue Mechanismus dieser Rezeptorinteraktion ist jedoch noch nicht aufgeklärt worden. Src-Kinasen aus der Gruppe der Non-Rezeptor-Tyrosinkinasen spielen eine bedeutende Rolle in der Signaltransduktion diverser Mastzell-Rezeptoren wie c-Kit und dem hochaffinen Immunglobulin-E-Rezeptor FceRI. Aus diesem Grund ist im Rahmen dieser Arbeit der hypothetische Einfluss von Src-Kinasen auf das von Drube et al. beschriebene, gemeinsam vom IL-33R und c-Kit ausgehende Signalnetzwerk in Mastzellen untersucht worden. Zur Bearbeitung der Fragestellung dieser Arbeit sind zunächst Voruntersuchungen mit Hilfe der Mastzellline HMC-1, welche u.a. eine konstitutiv aktive c-Kit-Mutante exprimieren, durchgeführt worden. Die Erkenntnisse dieser Voruntersuchungen konnten auf primäre, in vitro ausdifferenzierte murine Mastzellen (engl. bone marrow derived mast cells, BMMCs) übertragen werden. Zur Analyse der c-Kit-Aktivierung als Voraussetzung für die Beteiligung von Src-Kinasen an den untersuchten Signalprozessen erfolgten äquivalente Experimente mit c-Kit-defizienten kitW-sh/w-sh-BMMCs sowie mit kitD814V-transgenen BMMCs, welche die konstitutiv aktive c-Kit-Mutante D814V exprimieren. Der Spezifitätsnachweis erfolgte mittels IL-33R­defizienten il-33r-/--BMMCs. Bezug nehmend auf frühere Publikationen wurden die verwendeten Zellen mit IL-33 und SCF (jeweils als Einzel-bzw. Kostimulation) stimuliert und anschließend die Phosphorylierung diverser intrazellulärer Signalproteine mittels Western Blot detektiert sowie die Sekretion von IL-6 bzw. IL-8 mit Hilfe eines spezifischen ELISA gemessen. Durch die jeweilige Präinkubation mit dem spezifischen Src-Kinase-Inhibitor SU6656 konnte der zu untersuchende Einfluss von Src-Kinasen auf die IL-33R-/c-Kit-Signaltransduktion charakterisiert werden. Die Ergebnisse der Untersuchungen dieser Arbeit zeigen, dass wichtige Bestandteile der IL-33R-Signaltransduktion in Mastzellen wie ERK1/2, JNK1/2, NF-.B sowie der Proteinkinase-B-/Akt-Signalweg durch Src-Kinasen aktiviert werden. Ebenso wird eine IL-33-induzierte Phosphorylierung der c-Kit-Tyrosinreste 719 (murin) bzw. 721 (human) durch Src-Kinasen vermittelt. Als Voraussetzung für die Beteiligung von Src-Kinasen an der IL-33R-Signaltransduktion konnte die Aktivierung von c-Kit durch SCF identifiziert werden. Src-Kinasen stellen somit erst nach Prästimulation von c-Kit mit SCF einen Bestandteil des IL-33R-Signalings dar. Auch die beispielhaft für IL-33R-vermittelte Mastzell-Effektorfunktionen untersuchte Sekretion von IL-6 erfolgt lediglich nach Kostimulation mit SCF unter Beteiligung von Src-Kinasen. Src-Kinasen spielen somit eine wesentliche Rolle nicht nur in der Initiierung und Regulierung eines von dem Zytokinrezeptor IL-33R sowie der Rezeptortyrosinkinase c-Kit gemeinsam ausgehenden Signalnetzwerkes, sondern auf diesem Weg auch in der Induzierung von IL-33R-vermittelten Mastzell-Effektorfunktionen. Dysregulationen derartiger komplexer Signalkaskaden spielen somit möglicherweise eine Rolle in der Entstehung verschiedener Krankheitsprozesse und lassen Src-Kinasen aus diesem Grund als einen hypothetischen pharmakologischen Angriffspunkt erscheinen. Notwendig sind hierzu neben der Identifizierung der exakt beteiligten Src-Kinase und ihrer genauen Position innerhalb des beschriebenen Signalnetzwerkes auch entsprechende in-vivo-Experimente am Tiermodell.

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Löhn, Tobias: Der Einfluss von SRC-Kinasen auf die Signaltransduktion des Interleukin-33-Rezeptors in Mastzellen. 2012.

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