Schaltverhalten einzelner homo- und heterotetramerer olfaktorischer CNG-Kanäle

Eberhard, Melanie

CNG-Kanäle sind ligandengesteuerte nichtselektive Kationenkanäle, die durch die direkte Bindung zyklischer Nukleotide (z.B. cAMP, cGMP) aktiviert werden. Es sind tetramere Proteine deren vier Untereinheiten sich um eine zentrale Pore anordnen. Jede Untereinheit besteht aus 6 transmembranalen Segmenten, besitzt eine Porenregion, die an der Bildung der Kanalpore beteiligt ist und trägt eine C-terminale CN-Bindestelle. Es sind verschiedene Typen von Untereinheiten bekannt. Die α- und die β-Untereinheiten. Lediglich die α-Untereinheiten sind in der Lage auch alleine, funktionelle Kanäle zu bilden. In der Natur liegen CNG-Kanäle zumeist als heterotetramere Proteine vor. CNG-Kanäle sind weit verbreitet, sowohl in Vertebraten als auch in Invertebraten, wo sie in sensorischen und nichtsensorischen Zellen vorkommen. Der vorliegenden Arbeit liegen elektrophysiologische Messungen des klonierten homotetrameren CNGA2-Kanals des olfaktorischen Sensorneurons des Rindes, sowie des klonierten heterotetrameren CNGA2:A4:B1b-Kanals des olfaktorischen Sensorneurons der Ratte zugrunde. Die Kanäle wurden in einem heterologen System (Xenopus laevis) exprimiert. Ziel dieser Arbeit war es, ein gültiges Modell zur Beschreibung der beiden Kanäle zu bestimmen. Für den homotetrameren CNGA2-Kanal sind bereits einige Modelle in der Literatur beschrieben wurden (Li und Lester, 1999; Nache et al., 2005; Biskup et al., 2007). Über den heterotetrameren CNG-Kanal ist bisher nur sehr wenig in der Literatur bekannt. Es wurden sowohl makroskopische als auch Einzelkanaleigenschaften untersucht, um ein gültiges Modell für die verwendeten CNG-Kanäle zu erstellen. Bei der Auswertung der Messdaten konnten eine Reihe neuer und bereits bekannter Eigenschaften des Kanals identifiziert werden. Die ermittelten Amplituden-Histogramme geben Aufschluss über eine stabile Leitfähigkeit des Kanals bei steigenden Liganden-Konzentrationen und verdeutlichen durch die Zunahme der Offenwahrscheinlichkeit ihre Bedeutung als Ursache für den Anstieg der Dosis-Wirkungs-Kurve bei steigenden cGMP-Konzentrationen. Mittels Offen- und Geschlossenzeit-Histogrammen wurden Zeitkonstanten bestimmt, mit deren Hilfe eine Aussage über die Anzahl an offenen und geschlossenen Zuständen eines gültigen Modelles getroffen werden konnten. Die Überprüfung der bereits bestehenden Modelle für den homotetrameren CNGA2-Kanal zeigte dann auch, dass zwei offene Zustände nicht ausreichend genug sind um den Kanal adäquat zu beschreiben. Das aus der Literatur bekannte 3CL-Modell (Nache et al., 2005) beruhte auf makroskopischen Strömen, konnte aber die Einzelkanaldaten ebenfalls gut beschreiben. Ein Log Likelihood von ca. 65.000 zeigte, dass das Modell am geeignetsten von allen getesteten Modellen zur Beschreibung des Kanals ist. Das komplexe Schaltverhalten der registrierten Einzelkanalströme des heterotetrameren CNG-Kanals erschwerten eine umfassende Auswertung. Durch eine geringe Amplitudenhöhe des geöffneten Kanals und ein geringes Signal/Rausch-Verhältnis wurden bei der Idealisierung der Daten vermehrt falsche Öffnungs- und Schließungsereignisse gewertet. Dadurch sind besonders die kurzen Offen- und Geschlossenzeiten fehlerbehaftet. Durch eine separate Analyse der offenen und geschlossenen Kanalamplitude konnte die Stabilität der Leitfähigkeit des Kanals bei steigender Liganden-Konzentration nachgewiesen werden und die zunehmende Offenwahrscheinlichkeit als Ursache für den Anstieg der Dosis-Wirkungs-Kurve identifiziert werden. Die weitere Analyse des Kanalverhaltens erfolgte rein deskriptiv, weshalb von der Erstellung eines Modells für den heterotetrameren CNG-Kanal abgesehen wurde. Beide untersuchten CNG-Kanäle zeigten Auffälligkeiten in ihrem Kanalverhalten. Der homotetramere CNGA2-Kanal zeigte in 2 % der gesamt registrierten Messzeit ein deutlich erhöhtes offenes Kanalrauschen. Es ließen sich drei verschiedene Gating-Modi mit unterschiedlichen offenen Kanalamplituden bestimmen. Diese erhöhten Rauschamplituden traten ohne eine Änderung der Messbedingungen auf und deuten auf eine geänderte Leitfähigkeit des Kanals hin. Der heterotetramere CNG-Kanal zeigte neben der geringen offenen Kanalamplitude zusätzlich Ein-, Zwei- und Mehr-Punkt Ereignisse von deutlich größerer Amplitude bei geöffnetem Kanal, die als Nadeln imponierten. Sie traten mit relativ großer Regelmäßigkeit auf, nahmen jedoch nicht durch steigende Liganden-Konzentration an Häufigkeit zu. Dieses sehr heterogene Verhalten der offenen Kanalamplitude des heterotetrameren CNG-Kanals ist wahrscheinlich durch die Zusammensetzung der unterschiedlichen Untereinheiten bedingt. Der homotetramere CNGA2-Kanal wurde hinreichend gut mit dem 3CL-Modell beschrieben, wodurch gezeigt werden konnte, dass Ergebnisse aus makroskopischen Strömen auch auf Einzelkanäle anwendbar sind. Der heterotetramere CNG-Kanal lässt nur eine deskriptive Beschreibung zu.

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Eberhard, Melanie: Schaltverhalten einzelner homo- und heterotetramerer olfaktorischer CNG-Kanäle. 2012.

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