Die Weschselbeziehung zwischen Aktivierung und Ligandenbindung in HCN2-Schrittmacherkanälen

Thon, Susanne

HCN-Kanäle sind hyperpolarisationsaktivierte Kationenkanäle und werden durch zyklische Nukleotide moduliert. Mit Hilfe der Patch-Clamp-Technik sowie konfokaler Patch-Clamp-Fluorometrie wurden elektrophysiologische und optische Daten zum Aktivierungs- und Bindungsverhalten von HCN2-Kanälen erforscht. Dabei zeigte sich, dass die spannungsabhängige Aktivierung von HCN2-Kanälen sowohl den EC50-Wert als auch den Hill-Koeffizienten für die cAMP-Bindung beeinflusst. Außerdem wurde festgestellt, dass die cAMP-induzierte Aktivierung durch stärkere Hyperpolarisation beschleunigt wurde, während sich die Deaktivierung nach Abwaschen von cAMP stark verlangsamte. Experimente mit dem fluoreszierenden Liganden fcAMP zeigten, dass die Ligandendissoziation nach Abwaschen des Liganden in nicht-aktivierten Kanälen wesentlich schneller als in aktivierten Kanälen verläuft. Durch globale Approximation von Aktivierungs- und Bindungsdaten mittels eines Markov-Modells wurde festgestellt, dass bei einer Spannungsaktivierung von -130 mV Zustände in denen null, zwei oder vier Liganden pro Kanal gebunden sind, gegenüber einfach- oder dreifachligandierten Zuständen bevorzugt werden. Die Bindung des zweiten, dritten und vierten Liganden in aktivierten Kanälen zeigt eine Kooperativität in der Sequenz positiv-negativ-positiv, was eine Organisation der Untereinheiten als zwei funktionelle Dimere nahelegt. Mittels eines Austauschexperiments mit dem physiologischen Liganden cAMP durch den fluoreszierenden Liganden fcAMP konnte gezeigt werden, dass die Hälfte der cAMP-Moleküle bei einer Spannungsaktivierung von -130 mV extrem langsam dissoziieren, was wahrscheinlich der Grund für die stark verlangsamte Deaktivierung nach Abwaschen von cAMP ist. Die ligandenbedingte Aktivierung in HCN2-Kanälen ist ein sehr komplexer kooperativer Prozess. Zyklonukleotidbindungsdomänen agieren auf unterschiedliche Weise, obwohl sie isoliert vom transmembranären Anteil des Kanals eine vierfach symmetrische Struktur haben.

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Thon, Susanne: Die Weschselbeziehung zwischen Aktivierung und Ligandenbindung in HCN2-Schrittmacherkanälen. 2012.

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