Elektromigrationsverfahren in der Peptidanalytik : Trennung von diastereomeren Peptiden mittels Kapillarelektrochromatographie und Entwicklung eines kapillarzonenelektrophoretischen Enzym-Assays für Sirtuine

Ludewig, Ronny GND

Diese Arbeit gliedert sich in drei Hauptteile, wobei im ersten Teil die CEC Trennung von diastereomeren Peptiden unter Verwendung von Monolith Kapillaren untersucht wurde. Die Bestimmung verwandter Substanzen des ACTH Analogons Tetracosactid mittels CZE MS sowie die Entwicklung eines CZE basierten Assays von Sirtuin Enzymen wurden im zweiten und dritten Teil durchgeführt. Auf der Basis von Laurylmethacrylat resp. Acrylamid und Acrylamidobuttersäure wurden Monolith Kapillaren durch in situ Polymerisation in Gegenwart eines Porogens synthetisiert. Die Trennung von isomeren Aspartyl Peptiden wurde in Abhängigkeit der stationären und mobilen Phase mittels CEC untersucht. Beide hergestellten Monolithformen zeigen bessere Trennungen von Aspartyl Peptiden im Vergleich zur HPLC oder CZE. Weitere diastereomere Peptide, darunter Tetracosactid und sein Diastereomer D Lys16-Tetracosactid, konnten mittels CEC unter Verwendung des RP Monolithen gut getrennt werden. Das ACTH Analogon Tetracosactid wurde durch CZE UV und CZE MS analysiert, um eine Information über potentielle Verunreinigungen zu erhalten. Im Bereich der CZE UV führte der Zusatz von Diethylentriamin zu einer verbesserten Trennung bekannter Verunreinigungen von der Hauptsubstanz. Neben diesen Verunreinigungen wurden zehn Peptid Fragmente, welche 8 bis 22 Aminosäuren enthalten, durch CZE ESI MS in den zwei untersuchten Tetracosactid Chargen ermittelt. Ausgehend von der Aminosäuresequenz des p53-Proteins in den Positionen 379 bis 383, welches ein endogenes Substrat für Sirtuine ist, wurden Fmoc-Lys-Lys(Ac)NH2, Fmoc-Arg-His-Lys-Lys(Ac)NH2 und Fmoc-Lys-Lys(Ac)-LeuNH2 und deren nicht acetylierte Analoga mittels Festphasenpeptidsynthese hergestellt. Es gelang die Trennung aller sechs Peptide und Nicotinamid, welches als Nebenprodukt der Enzymreaktion entsteht, in einem sauren Natriumphosphatpuffer mittels CZE. Ein pH-vermitteltes Stacking wurde zur Erhöhung der Detektionsempfindlichkeit angewendet. Die CZE Trennung wurde für die Ermittlung kinetischer Daten der Sirtuine SIRT1 und SIRT2 validiert. Verschiedene Emzyminhibitoren wurden erfolgreich an beiden Situinen getestet. Dieser Enzym Assay ist für die Bestimmung der Sirtuin Aktivität und das Screening von Inhibitoren für Sirtuine geeignet.

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Ludewig, Ronny: Elektromigrationsverfahren in der Peptidanalytik. Trennung von diastereomeren Peptiden mittels Kapillarelektrochromatographie und Entwicklung eines kapillarzonenelektrophoretischen Enzym-Assays für Sirtuine. 2011.

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