Neuronale Differenzierung embryonaler Stammzellen der Maus

Theurer, Philipp

Embryonale Stammzellen differenzieren spontan in Körperzellen aller drei Keimblätter, wobei Neurone nur einen sehr kleinen Teil der Gesamtzellpopulation darstellen. Ziel der Arbeit war daher die Etablierung eines Protokolls für die gerichtete in-vitro-Differenzierung embryonaler Stammzellen der Maus vor Ort im institutseigenen Labor. Es sollte ein Instrument bereitgestellt werden, das auch dann die Untersuchung von Neuronen ermöglicht, wenn aus den embryonalen Stammzellen aufgrund einer letalen genetischen Veränderung keine lebensfähigen Tiere für die Isolation von Primärneuronen erzeugt werden können. Auch bei Krankheiten des Nervensystems, die durch sehr heterogene genetische Veränderungen hervorgerufen werden, soll die aufwändige Erzeugung der entsprechend zahlreich erforderlichen Versuchstiere mit den verschiedenen Veränderungen umgangen werden können. Das neu etablierte Protokoll erfordert zunächst die Vermehrung der embryonalen Stammzellen (R1-Klon) im undifferenzierten Zustand. Anschließend erfolgt eine zweitägige Kultur in Suspension oder in hängenden Tropfen mit einem serum- und retinsäurehaltigen Nährmedium. Nach weiteren 6 Tagen Kultur ohne Retinsäure werden die entstandenen Embryoidkörperchen auf adhäsiven Zellkulturschalen ausplattiert. Um den Anteil der neuronalen Vorläuferzellen zu erhöhen, folgt ein Selektionsschritt mit einem Selektionsmedium über 9 Tage. Die Induktion der neuronalen Differenzierung wurde durch Bestimmung der Konzentration von Nestin, einem Markerprotein neuronaler Vorläuferzellen, mittels Western Blot quantifiziert. Es zeigte sich dabei eine Abhängigkeit von der Retinsäurekonzentration und dem Anteil an fetalem Kälberserum während der Differenzierung. Bei Verwendung von Retinsäure in einer Konzentration von 5x10-7 mol/l und einem Anteil an fetalem Kälberserum von 5% wurde die maximale Nestinkonzentration in den Embryoidkörperchen beobachtet. Die aus den nestinpositiven Zellen hervorgegangenen Zellen wurden anhand der charakteristische Morphologie in Kombination mit dem immunzytologischen Nachweis der neuronenspezifischen Markerproteine β3-Tubulin, Neurofilament 68 und 200 kD, Mikrotubuli-assoziiertes Protein 2 und Synaptophysin als Neurone identifiziert.

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Theurer, Philipp: Neuronale Differenzierung embryonaler Stammzellen der Maus. 2011.

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