Identification of Protein Tyrosine Phosphatases regulating FLT3 activity and of PTPs regulated by FLT3 ITD

Arora, Deepika

Die Akute Myeloische Leukämie (AML) ist eine der am häufigsten vorkommenden Formen der Leukämie. Etwas 90% der Erkrankten sind Erwachsene, während Kinder seltener von der Erkrankung betroffen sind. AML entsteht durch das klonale Wachstum myeloischer Zellen, welche stark proliferieren, aber nicht terminal differenzieren können. Dadurch akkumulieren sich unreife Zellen verschiedener myeloischer Differenzierungslinien. Rezeptortyrosinkinasen (RTK) sind wichtige Moleküle für die Regulation von Zellaktivitäten, und deshalb auch kritisch für die normale Zellentwicklung. Fms like tyrosine kinase-3 (FLT3) ist ein Mitglied der Klasse-III RTK Familie, und hat eine wichtige Funktion bei der normalen Differnzierung von Monozyten und B-Zellen. Mutationen im FLT3-kodierenden Gen, darunter Punktmutationen in der Tyrosinkinase-Domäne (TKD), oder interne Tandemduplikationen (ITD) vor allem in der Juxtamembran-Domäne, führen zur konstitutiven Aktivierung von FLT3. FLT3-Mutationen stellen den zweithäufigsten Typ genetischer Läsionen bei der AML dar. Über die Signaltransduktion von FLT3 und seiner mutierten Versionen ist schon viel bekannt. Wildtyp FLT3 aktiviert den RAS-MAPK- und den PI3K-AKT Signalweg, und FLT3 ITD aktiviert außerdem STAT5, was entscheidend für die Zelltransformation ist. Wie die FLT3 Aktivität im Detail reguliert wird, ist jedoch noch weitgehend unklar. Protein-Tyrosinphosphatasen (PTPs) sind Enzyme, die mit Tyrosinkinasen kooperieren, und die RTK Aktivität durch Dephosphorylierung regulieren können. Deshalb spielen sie wahrscheinlich eine wichtige Rolle für normale Zellfunktionen. Um potentielle Regulatoren der FLT3-Aktivität zu identifizieren, wurde ein shRNA-Screen für PTPs auf der Basis shRNA-kodierender lentiviraler Partikel durchgeführt. Der „Knockdown“ der Expression von PTPs wurde mittels shRNAs für 20 verschiedene PTP-Gene in murinen, myeloiden Zellen, sogenannten 32D-Zellen durchgeführt, welche Wildtyp FLT3 exprimierten. Die FLT3-Ligand (FL)-stimulierte Aktivität von ERK wurde als Messparameter für die Beeinflussung der FLT3-Aktivität benutzt. DEP-1 wurde in dem Screen als eine der potentiell die FLT3-Aktivität beeinflussenden PTPs identifiziert. Unterschiede in der FLT3-Signaltransduktion zwischen Zellen, die mit Kontroll-shRNA- exprimierenden Konstrukten transduziert worden waren, und solchen mit DEP-1 Knockdown wurden analysiert. Es wurde der Screeningbefund bestätigt, dass DEP-1-Depletion die FL-stimulierte ERK-Aktivierung erhöht. Ebenso war die Proliferation der Zellen erhöht. Weiterhin resultierte die DEP-1-Depletion in einer schwachen STAT5-Aktivierung und einer Hyperphosphorylierung von FLT3. Bemerkenswerterweise wurde eine Hyperphosphorylierung der Phosphotyrosin-Reste pY589 und pY591 nach DEP-1- Depletion beobachtet. Diese Phosphorylierungsstellen sind an der Aktivierung von STAT5 beteiligt. Die transiente Depletion von DEP-1 in der humanen AML-Linie THP-1 verursachte auch eine erhöhte FLT3-Phosphorylierung, in diesem Fall an den Phosphotyrosinen 589 und 599, und führte auch zu einer schwach erhöhten Aktivierung von ERK. DEP-1-depletierte 32D Zellen, welche Wildtyp FLT3 exprimierten, waren in der Lage zur FL-induzierten Koloniebildung in halbflüssigem Medium. Die FL-Abhängigkeit ist dabei ein klares Indiz für die Rolle der FLT3-Aktivität in diesem Prozess. Der Knockdown von DEP-1 war jedoch nur partiell transformierend. So löste die Injektion der DEP-1-depletierten Zellen in syngene Mäuse keine myeloproliferative Erkrankung aus. Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass DEP-1 die FLT3- Aktivität negativ reguliert. Der Verlust von DEP-1 könnte zur Transformation bei der AML beitragen, würde aber höchstwahrscheinlich kooperierende Mutationen erfordern, um zur Transformation in vivo zu führen. Ein weiterer Teil dieser Dissertation beschäftigte sich mit der Identifikation von PTPs, die möglicherweise im Rahmen der AML durch FLT3 ITD reguliert werden. Zu diesem Zweck wurde cDNA aus humanen AML-Blasten gewonnen, die entweder Wildtyp FLT3 oder FLT3 ITD exprimierten. Das Expressionsmuster von 92 humanen PTPs wurde für diese Zellen sowie auch für humane Zelllinien, die entweder Wildtyp FLT3 (EOL-1, THP-1 und RS4-11) oder FLT3 ITD (MV4-11) exprimierten, analysiert. 10 PTPs wurden für eine weitergehende Analyse ausgewählt, basierend auf Expressionsdifferenzen zwischen Wildtyp FLT3- oder FLT3 ITD-exprimierenden Blasten, oder auf Grundlage generell sehr hoher mRNA-Expression. Das mRNA-Expressionsprofil dieser 10 PTPs wurde in einem zweiten Set von AML-Blasten analysiert, sowie in 32D Zellen, die entweder kein FLT3, oder die beiden unterschiedlichen Versionen von FLT3 exprimierten. Aus diesen Untersuchungen wurde klar, dass FLT3 ITD die dualspezifische PTP DUSP6 in der Expression stimulieren kann. Auch die DUSP6 Proteinspiegel waren in 32D Zellen, die FLT3 ITD exprimierten, erhöht. Die FLT3 Kinase-Inhibitoren AG1295 und 1020 hemmten die DUSP6-Expression in den FLT3 ITD-exprimierenden murinen 32D-Zellen und humanen MV4-11-Zellen fast vollständig. Dies zeigte, dass die DUSP6-Expression in der Tat von der konstitutiven FLT3 ITD-Signalaktivität abhängig ist. Pharmakologische Inhibitoren des RAS-MAPK-Weges, des PI3K-AKT-Weges und von STAT5 wurden benutzt, um die Beteiligung dieser Signalwege an der DUSP6-Induktion zu prüfen. Während U0126, ein MEK-Inhibitor, die DUSP6-Expression stark verringerte, hatten Wortmannin und ein niedermolekularer STAT5-Inhibitor nur schwache Effekte. Die zusätzliche Analyse eines größeren Satzes von Affimetrix mRNA-Expressionsdaten, die in einer unabhängigen Studie in Rotterdam erhalten worden waren, zeigte, dass noch eine andere dualspezifische PTP, TNS1, offenbar durch FLT3 ITD reguliert wird. In diesem Fall war die Expression in Anwesenheit von FLT3 ITD verringert. Dieser Befund konnte in murinen 32D und Ba/F3-Zellen rekapituliert werden. Die beobachteten Veränderungen in der Expression bestimmter PTPs in Anwesenheit von FLT3 ITD könnten auf eine Rolle dieser Phänomene im Transformationsprozess hinweisen. Diese Möglichkeit wird gegenwärtig untersucht.

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Arora, Deepika: Identification of Protein Tyrosine Phosphatases regulating FLT3 activity and of PTPs regulated by FLT3 ITD. 2011.

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