Struktur und Funktion der Carboxy-terminalen Domäne des Transkriptionsfaktors CbfA aus Dictyostelium discoideum

Lucas, Jörg

Der C-Modul-bindende Faktor A (CbfA) aus Dictyostelium discoideum wurde durch seine Interaktion mit einem Teil des 3‘-untranslatierten Bereiches des Retrotransposons TRE5-A erstmalig beschrieben. Bisherige Arbeiten über CbfA zeigten eine Beteiligung dieses Faktors an der Regulation der multizellulären Entwicklung von Dictyostelium discoideum und sein Wirken als Transkriptionsfaktor. Es wurden mit Hilfe der Microarray-Technik 162 Gene identifiziert, die in der CbfA-depletierten Mutante JH.D im Vergleich zum Wildtyp differenziell exprimiert werden. Die erlangten Daten sind mit zwei durch RNA-Sequenzierung erstellten Transkriptomanalysen sowie punktuell mit quantitativen Reverse Transkriptase-PCR-Messungen verglichen worden. Ferner wurden anhand einer Microarray-Transkriptomanalyse die Funktionen der Carboxy-terminalen Domäne (CTD) von CbfA für die Regulation CbfA-abhängiger Gene untersucht. Die Experimente lassen auf eine vom Rest des Proteins unabhängige genregulatorische Funktion schließen. Zur weiteren Charakterisierung der CTD von CbfA wurde die Beteiligung des DNA-bindenden AT-Hakens an der genregulatorischen Aktivität sowie die Kernlokalisation der Carboxy-terminalen Domäne untersucht. Zur Strukturaufklärung der Carboxy-terminalen Domäne wurde ein Protokoll zur heterologen Expression und Aufreinigung großer Mengen CTD in Bakterien entwickelt. Die DNA-bindende Aktivität und Strukturierung der rekombinanten Proteindomäne konnte nachgewiesen werden. Des Weiteren wurde das Hefe Zwei-Hybrid-System zur Identifizierung von Interaktionspartnern der CTD verwendet. Dazu sind zwei komplexe cDNA-Bibliotheken erstellt worden, welche qualitativ als hochwertig charakterisiert werden konnten. Abschließend folgten Arbeiten hinsichtlich der Phylogenie der CbfA-Domänenstruktur und des paralogen Proteins CbfB innerhalb der Dictyosteliales.

The Dictyostelium discoideum C-module-binding factor A (CbfA) was discovered by its interaction with a part of the 3’-untranslated region of the retrotransposon TRE5-A. Previous studies on CbfA showed an involvement of this protein in the regulation of multicellular development of D. discoideum and its function as a transcription factor. Experiments in this work using the microarray technology showed 162 genes to be differentially expressed between the wild type AX2 and the CbfA-depleted mutant JH.D. Microarray data were compared with results obtained from two RNA sequencing experiments and in part to quantitative reverse-transcription PCR measurements. The function of the carboxy-terminal domain (CTD) of CbfA in the regulation of CbfA-dependent genes was investigated by microarray analysis. These experiments emphasize the function of carboxy-terminal domain of CbfA as an independent gene-regulatory entity. To further characterise the CTD of CbfA, the involvement of the DNA-binding AT-hook in the gene regulatory activity was investigated. A nuclear localisation site within the carboxy-terminal domain was experimentally verified. To determine the structure of CbfA’s CTD a protocol to express and purify large amounts of the protein in bacteria was developed. The functionality (i.e. DNA-binding activity) and the structuring of the recombinant domain were confirmed. Additionally the yeast two-hybrid system was used to search for proteins that intact with the CTD in vivo. Two high-quality cDNA libraries were generated from D. discoideum cells. Finally the molecular phylogeny of the domain structure of CbfA and its paralogous protein CbfB was investigated within the dictyostelid clade.

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Lucas, Jörg: Struktur und Funktion der Carboxy-terminalen Domäne des Transkriptionsfaktors CbfA aus Dictyostelium discoideum. 2010.

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