Oxidationsabhängiger Abbau der Proteintyrosinphosphatase PTP1B durch Calpain als regulatorischer Mechanismus

Trümpler, Antje

Die Regulation zellulärer Signalwege erfolgt unter anderem über die kontrollierte Aktivität von Proteintyrosinkinasen und Proteintyrosinphosphatasen (PTP). Letztere sind in der Lage, phosphorylierte Tyrosinreste zu dephosphorylieren und damit die Signaleigenschaften und gegebenenfalls die Aktivität der Substrate zu verändern. Die Kontrolle der PTP-Aktivität wiederum erfolgt auf vielen Ebenen. Hierzu gehören, je nach PTP, Expression und Protein- stabilität, kovalente Modifikationen, wie Phosphorylierung oder SUMOylierung, zelluläre Lokalisation und Interaktion mit regulatorischen Proteinen, sowie die Dimerisierung. Ein weiterer Faktor ist die Oxidation des in klassischen PTP deprotoniert vorliegenden Cysteins, das für die Katalyse der Dephosphorylierungsreaktion notwendig ist. Die Oxidation dieses Cysteins durch erhöhte zelluläre Spiegel an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) geht mit einer (zumeist reversiblen) Inaktivierung der PTP einher. Sie ist zum Beispiel im Falle der Stimulation von Zellen mit mitogenen Faktoren, zum Beispiel Insulin, für die vollständige Rezeptoraktivierung notwendig. Zu den weiteren Stimuli, die eine PTP-Oxidation in der Zelle auslösen können, gehört die Bestrahlung mit UV-A- und UV-B-Licht. Infolge einer UV- Behandlung von Zellen erfolgt neben der oxidativen Hemmung zudem auch ein Calpain- abhängiger Abbau von verschiedenen PTP, der mit einer Liganden-unabhängigen EGFR-Aktivierung einhergeht. Die Integration der Calpain-Aktivierung und PTP-Oxidation führt zu einem weiteren regulatorischen Eingriff in die PTP-Aktivität. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit erfolgte eine genauere Charakterisierung dieses neuen Regulationsmechanismus. Es gelang, die Abbaubedingungen von PTP-Oxidation und gleichzeitiger Calpain-Aktivierung in vitro mit aufgereinigten Proteinen zu rekonstruieren. Hierfür wurde PTP1B als Modell gewählt, da diese PTP bereits sehr gut charakterisiert ist und bereits Kristallstrukturen der verschiedenen Oxidationszustände aufgeklärt sind. Es konnte gezeigt werden, dass die reversible Oxidation des katalytischen Cysteins Voraussetzung für die Spaltung durch Calpain ist. Eine Hauptspaltstelle innerhalb der katalytischen Domäne wurde identifiziert, deren Spaltung zu einer dauerhaften Inaktivierung der Phosphatase führt. Darüber hinaus wurde eine erhöhte Bindung der oxidierten PTP1B an Calpain, unabhängig von dessen Aktivierungszustand, detektiert. Darauf basierend und mit Hilfe verschiedener Mutanten konnte folgendes Modell der oxidationsspezifischen Spaltung entwickelt werden: 1.) Die Konformationsänderungen infolge der Oxidation führen zu einer verstärkten Bindung der PTP an Calpain, an einer Domäne jenseits des katalytischen Zentrums. 2.) Aktives Calpain spaltet dadurch die oxidierte PTP deutlich effizienter, wobei die Spaltung an der dem katalytischen Zentrum abgewandten Seite der PTP erfolgt. 3.) Eine Mutationsanalyse ergab, dass die Primärsequenz in der Umgebung der Spaltstelle von untergeordneter Bedeutung für die Effizienz der Spaltung ist. Eine weitere Untersuchung des identifizierten Regulationsprinzips in UV-bestrahlten Zellen war aufgrund der instabilen Resultate nicht möglich. Es ist denkbar, dass noch unbekannte Gegenregulations-Mechanismen in das System eingreifen und diese dringend näher untersucht werden müssen. Mit Hilfe von Calpain-negativen Zellen gelang es jedoch, eine aktivierende Funktion des Calpains im Insulin-Signalweg zu zeigen. Die Insulinstimulierte Aktivierung der Signalmoleküle AKT und S6-Kinase war in Abwesenheit von Calpain-4 stark reduziert. Obwohl eine Rolle in diesem System noch nicht nachgewiesen werden konnte, wäre der oxidationsspezifische PTP-Abbau durch Calpain ein möglicher Mechanismus, mittels dessen Calpain die Signalweiterleitung moduliert. Eine weiterführende Untersuchung dieses Phänomens kann möglicherweise Zusammenhänge zwischen Calpain und der Deregulation der Insulin-Signalübertragung beim Diabetes mellitus aufdecken.

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Trümpler, Antje: Oxidationsabhängiger Abbau der Proteintyrosinphosphatase PTP1B durch Calpain als regulatorischer Mechanismus. 2010.

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