Entwicklung einer Methode für die in vitro Fermentation von Nahrungsbestandteilen und Untersuchungen zur Charakterisierung der Fermentationsprodukte
Die in vitro Fermentation ist ein geeignetes Hilfsmittel für die Analyse von Nahrungsmittelinhaltsstoffen hinsichtlich ihrer physiologischen Effekte im Dickdarm. Ziel dieser Arbeit war es, die one-batch-in vitro-Fermentation nach Barry et al. [1995] (alte Fermentationsmethode – AFM) durch eine vorherige Simulation der Prozesse des oberen Verdauungstraktes zu modifizieren (neue Fermentationsmethode – NFM), um eine Anpassung an die in vivo Bedingungen zu erreichen. Gewonnene Fermentationsüberstände (FÜ) wurden chemisch und biologisch charakterisiert und anschließend miteinander verglichen. Die Fermentationsmethoden wurden parallel, mit Komponenten pflanzlicher Nahrungsmittel als Testsubstanzen durchgeführt. Es wurden frische Faecesproben von jeweils 3 gesunden Spendern gesammelt und zu gleichen Teilen für die beiden Methoden verwendet. Die 24-stündige AFM wurde bei 37°C und unter anaeroben Bedingungen durchgeführt. Als Fermentationsmedium diente ein anaerober Kaliumphosphatpuffer. Die zusätzliche Simulation der Verdauungsprozesse des Magens und Dünndarms, mit der Einhaltung einer organspezifischen Simulationsdauer, der Addition eines Verdauungssekretes und der Einstellung eines entsprechenden Milieus (pH-Wert, O2-Atmosphäre), erfolgte in Anlehnung an das von Molly et al. [1993] entwickelte, kontinuierliche in vitro Fermentationssystem (SHIME-Modell) unter Verwendung eines Nährmediums. Nach Beendigung der Fermentation wurden die pH-Werte der Suspensionen gemessen und die FÜ gewonnen. Mittels Gaschromatographie erfolgte die Konzentrations-bestimmung kurzkettiger Fettsäuren (SCFA) und Gallensäuren (GS) sowie chemisch-photometrisch die Bestimmung der Ammoniakkonzentration. Die Modifikation des Wachstums und des Metabolismus humaner Kolonkarzinomzellen (HT29), nach Inkubation mit den FÜ, wurde mit dem DAPI- & CTB-Assay sowie die Induktion genotoxischer Schäden, nach Inkubation mit den FÜ, mit dem Comet Assay bestimmt. Die Fermentation der Testsubstanzen nach Durchführung der NFM führte gegenüber der AFM zu niedrigeren pH-Werten mit doppelt bis dreifachen SCFA- und Ammoniakkonzentrationen, welche im Vergleich zum Blank jedoch geringere Unterschiede zeigten. Die Addition des intestinalen Extraktes führte zu erhöhten GS-gehalten in den nach der NFM gewonnenen FÜ, welche testsubstanzabhängige Unterschiede in der Menge gebildeter, sekundärer GS aufwiesen. Die Inkubation der HT29-Zellen mit FÜ der NFM führte zu einer stärkeren Inhibierung des Wachstums und des Metabolismus sowie zu einer Steigerung der genotoxischen Schadwirkung. Im Vergleich zum Blank, erzielten die nach Durchführung der AFM gewonnenen FÜ allerdings einen z.T. deutlich stärkeren Effekt als die FÜ der NFM. Für die Anpassung von in vitro Fermentationssystemen an in vivo Bedingungen ist eine vorherige Simulation des oberen Verdauungstraktes, v.a. bei der Untersuchung komplexer Lebensmittel, von hoher Bedeutung. Prozesse des Kolons können dadurch besser untersucht und verstanden werden. So ermöglichte z.B. die Addition des intestinalen Extraktes eine Analyse der Bildung sekundärer GS durch eine testsubstanzabhängige Steigerung der Darmfloraaktivität. Aufgrund der schnellen Durchführung einer one-batch-in vitro-Fermentation, mit der Beobachtung testsubstanzabhängiger Effekte über einen Zeitraum von 24h, erwies sich die Verwendung eines Nährmediums mit zusätzlich fermentierbaren Komponenten, v.a. für Untersuchungen in zellulären Testsystemen, als eher nachteilig. Zusätzlich erschwerte es den Vergleich mit den nach der AFM gewonnenen FÜ, weshalb sich Effekte einer zusätzlichen Simulation der Prozesse des oberen Verdauungstraktes nur bedingt feststellen ließen. Daher sollte zukünftige die Durchführung der NFM mit einem komponentenarmen Zellkulturmedium oder Salzpuffer erfolgen.
The in vitro fermentation is an appropriate tool for observing and analyzing physiological effects of food compounds in the large intestine. The aim of the present work was to modify the one-batch-in vitro-fermentation method from Barry et al. [1995] (“old” fermentation method – OFM) with a previous simulation of the processes of the upper digestive tract to adapt the system to in vivo conditions (“new” fermentation method – NFM). Fermentation supernatants were collected, chemically and biologically characterized and compared. The fermentation methods were carried out at the same time with test substances from plant foods. Fresh human faeces were collected from three healthy volunteers and were used in equal portions for both methods. The OFM lasted 24 h at 37°C and under anaerobic conditions using an anaerobic potassium phosphate buffer for the dilution of test substances and inoculum. The additional upper digestive tract simulation of the NFM, with the observance of an organ-specific duration of simulation, the addition of pancreatic and bile liquid (“intestinal extract”), the regulation of organ-specific luminal conditions (pH-value, oxygen atmosphere) and the use of a growth medium based on practices Molly et al. [1993] developed in a multi-stage continuous culture system (SHIME-Model). Upon completion of the fermentation resulting pH-values were measured and supernatants were obtained. Short chain fatty acid (SCFA) and bile acid concentrations were determined gas chromatographically as well as ammonia concentrations by a chemical photometric method. The modification of cell growth and metabolism of human colon carcinoma cells (HT29) by the supernatants were analyzed with the DAPI- and CTB-Assay, while the induction of genotoxic damage was analyzed with the comet assay. The fermentation of the test substances according to the NFM resulted in decreased pH-values with 2-3 fold higher concentrations of SCFA and ammonia but with smaller differences to the blank control compared to the OFM. Because of the addition of the “intestinal extract” there were high amounts of bile acids in the supernatants from the NFM with test substance-dependent varieties in secondary bile acid formation. The incubation of the HT29-cells with supernatants from the NFM resulted in a stronger inhibition of cell growth and metabolism as well as a stronger induction of genotoxic damage compared to supernatants from the OFM. However the results achieved by the test substances of the OFM showed thereby a stronger effect in relation to the blank control compared with the test substances of the NFM, which partially could obtain no additive effects in the comparison to the blank control. A previous simulation of the upper digestive tract is important to adapt the in vitro fermentation system to in vivo conditions, especially for the investigation of complex foods, and can help understanding the processes of the colon. Thus for example the addition of the “intestinal extract” enables the analysis of secondary bile acid formation by the gut flora as a function of test substance fermentation. Due to the fast execution of a one-batch-in vitro-fermentation, with the observation of test substance-dependent effects during one period of 24 h, the use of a growth medium with additionally fermentable components proved as rather unfavorably, particularly for investigations in cellular test systems. Finally the use of the media aggravated the equation of both methods, why the influence of an additional simulation of the stomach and the small intestine couldn’t be evaluated. Therefore the future performance of the NFM should take place with a component-poor medium or salt buffer.