Das Miz1-interagierende Protein TopBP1 : Identifizierung neuer Interaktionspartner und Untersuchungen zur Rolle bei der Zellzyklusregulation

Wollmann, Yvonne

Das Topoisomerase IIß-Bindeprotein (TopBP1) ist ein humanes Protein mit acht BRCT (BRCA1 Carboxyterminus)-Motiven, dass mit wichtigen zellulären Prozessen wie DNA-Schadensantwort, DNA-Replikation und Apoptose in Verbindung steht. Ein bekannter Interaktionspartner von TopBP1 ist der Transkriptionsfaktor Myc-interacting zinkfinger protein 1 (Miz1). Eine Fraktion von Miz1 ist in ungestressten Zellen an TopBP1 gebunden und dadurch inhibiert. DNA-Schädigungen führen zur Freisetzung von Miz1 aus dem Komplex mit TopBP1 und damit zur Aktivierung des Transkriptionsfaktors und zum Zellzyklusarrest. Gegenstand dieser Arbeit waren funktionelle Untersuchungen mit dem Ziel, neue Aspekte für die Aufklärung der Rolle von TopBP1 bei der Zellzykluskontrolle, insbesondere im Myc-Miz1-Regulationsnetzwerk, zu finden. Unter Berücksichtigung bekannter Daten über dieses Protein bzw. über strukturell ähnliche oder homologe Proteine aus anderen Organismen wurden zwei neue Protein-Protein-Interaktionen abgeleitet und die Wechselwirkungen in vitro und in vivo analysiert. TopBP1 besitzt mit der sechsten BRCT-Domäne eine Proteinregion, die homolog zu der Auto(ADP-Ribosyl)ierungsregion des Enzyms Poly(ADP-Ribose)Polymerase-1 (PARP-1) ist. PARP-1 bindet DNA-Strangbrüche und katalysiert anschließend eine Selbst-ADP-Ribosylierung sowie die Modifikation benachbarter Proteine. In dieser Arbeit konnte anhand von in vitro Bindungsassays die Interaktion von Proteinfragmenten von TopBP1 und PARP-1 gezeigt und die Interaktionsflächen der beiden Proteine auf die sechste BRCT-Domäne von TopBP1 und die Automodifikationsdomäne von PARP-1 eingegrenzt werden. Die in vivo Assoziation der endogenen Proteine konnte durch Koimmunopräzipitation nachgewiesen werden. Außerdem wurde gezeigt, dass TopBP1 in vitro durch PARP-1 ADP-ribosyliert wird. Durch diese posttranslationale Modifikation wird eine Möglichkeit aufgezeigt, wie die Bindungseigenschaften von TopBP1 bezüglich Miz1 verändert werden können, so dass es zur Freisetzung im Fall von DNA-Schädigung zur von Miz1 kommt. Aus anderen Eukaryoten wie Hefen oder Xenopus laevis ist die Beteiligung der entsprechenden TopBP1-homologen Proteine (Rad4/Cut5, Dpb11, Xmus101/cut5) an der Initiation der Replikation durch Interaktionen mit DNA-Polymerasen und dem Initiationsfaktor Cdc45 bekannt. In humanen Zellen ist die TopBP1-Expression in der S-Phase am größten und die Bindung von Pol [epsilon klein] bereits nachgewiesen. Dies legt die Vermutung nahe, dass diese Funktionen von TopBP1 evolutionär konserviert sind. In dieser Arbeit wurden Zellfraktionierungsversuche mit synchronisierten HeLa S3-Zellen durchgeführt, die zeigten, dass TopBP1 in humanen Zellen Chromatin-assoziiert vorliegt, wobei der TopBP1-Anteil in dieser Fraktion zu Beginn der S-Phase am größten ist. Weiterhin konnte durch Koimmunopräzipitation der endogenen Proteine eine Assoziation von TopBP1 und Cdc45 gezeigt werden. Ob die Bindung der beiden Proteine direkt erfolgt konnte im in vitro Bindeassay nicht eindeutig geklärt werden. Es ist möglich, dass TopBP1 und Cdc45 als Bestandteil eines Multiproteinkomplexes, was Replikationskomplexe darstellen, kopräzipitieren. Genexpressionstudien zeigten, dass sich die gezielte Abregulation der TopBP1-Expression in Ls174T-Zellen mit Hilfe von RNA-Interferenz, auf die Expression einer Gruppe von Genen auswirkt, die durch Miz1 nach DNA-Schädigung reprimiert wird. Damit beeinflusst TopBP1 genreprimierende Funktionen von Miz1, die auch durch Akt/14-3-3η reguliert werden, nicht jedoch durch Myc. Zu prüfen bleibt, ob TopBP1 und 14-3-3η diese Miz1-Funktionen kooperativ regulieren. Zellwachstumsversuche von TopBP1 knock down-Zellen zeigten keine Beeinträchtigung ihrer Proliferation in Abwesenheit von exogen induzierten DNA-Schäden im Vergleich mit Kontrollzellen. Werden diese Zellen mit dem genotoxischen Agens Adriamycin behandelt, ist die Koloniebildung bei TopBP1-Abregulation inhibiert. Zusammengefasst liefert diese Arbeit neue Hinweise für eine Beteiligung von TopBP1 an der Replikationsinitiation und für einen möglichen molekularen Mechanismus, über den die Freisetzung von Miz1 im Rahmen eine DNA-Schadensantwort bewirkt werden kann. Die experimentellen Daten zusammen mit aktuellen Literaturdaten zeigen außerdem, dass TopBP1 die Genrepression durch Miz1, die Teil der zellulären Reaktion auf DNA-Schäden ist, beeinflusst. Es bleiben offene Fragen zum Beispiel zu Faktoren oder Mechanismen, die in TopBP1 knock down-Zellen in Abwesenheit von DNA-Schäden Funktionen dieses Proteins komplementieren können und zu einem normalen Wachstum führen. Diese Fragen und die mögliche Rolle von TopBP1 als Protein, das durch Bindung und Freisetzung von Interaktionspartnern an der Koordination verschiedener zellulärer Prozesse teilnimmt, wird Gegenstand weiterführender Experimente sein.

Zitieren

Zitierform:

Wollmann, Yvonne: Das Miz1-interagierende Protein TopBP1. Identifizierung neuer Interaktionspartner und Untersuchungen zur Rolle bei der Zellzyklusregulation. 2005.

Zugriffsstatistik

Gesamt:
Volltextzugriffe:
Metadatenansicht:
12 Monate:
Volltextzugriffe:
Metadatenansicht:

Grafik öffnen

Export