Degradation of aspartyl peptides : studies on the isomerization and enantiomerization of aspartic acid in model peptides by capillary electrophoresis and high performance liquid chromatography

De Boni, Silvia

Degradation pathways of peptides and proteins comprise chemical and physical instability. These processes can lead to loss of structure and physiological activity as well as to the formation of toxic degradation products. The present study was conducted in order to investigate the degradation of aspartyl peptides in acidic and alkaline media, specifically with respect to the isomerization and enantiomerization of the Asp residue. The tripeptides Phe-Asp-GlyNH2 and Gly-Asp-PheNH2 were used as model compounds. A capillary electrophoresis (CE) and a high performance liquid chromatography (RP-HPLC) method were developed for the analysis of the degradation products. Separations that were difficult to achieve with one technique proved to be easily accomplished by the other method. The degradation products were first identified by coinjection of reference substances. Additional on-line MS detection was performed for both techniques in order to unequivocally identify the compounds. Analysis of the MS spectra of the peptides allowed the assignment of the substances to the alpha-Asp or ß-Asp series. In order to quantify the compounds the CE assay was validated with respect of linearity, intraday and interday precision. The degradation of the model peptides and the formation of products were invetigated. At pH 2, the major degradation pathway was cleavage of the peptide backbone amide bonds yielding dipeptides and amino acids, C-terminal deamidation as well as formation of succinimidyl peptides. In alkaline medium (pH 10) both deamidation of the C-terminal amide as well as isomerization and concomitant enantiomerization of Asp were observed for the native amide as well as for the resulting deamidated tripeptides. Peptide, Proteine und Peptidomimetika können chemischen bzw. physikalisch-chemischen Abbauprozessen unterliegen. Diese können sowohl zu Strukturveränderungen und somit zum Funktionsverlust als auch zur Entstehung toxischer Abbauprodukte führen. Ziel der vorliegenden Arbeit waren Studien zu Abbauprodukten von Aspartylpeptiden in sauren und basischen Milieu, besonders aber zu Isomerisierung und Enantiomerisierung der Asparaginsäurereste. Die Tripeptide Phe-Asp-GlyNH2 und Gly-Asp-PheNH2 wurden als Modellverbindungen verwendet. Eine Kapillarelektrophorese (CE) und eine Hochleistungs-Flüssichromatographie (RP-HPLC) Methode zur Beurteilung des Abbaus von den Aspartyl-Modellpeptiden wurden entwickelt. Trennungen, die sich bei einer der Methoden als schwierig erwiesen, waren mit der jeweils anderen Methode erreichbar. Die Abbauprodukte der Tripeptide wurden zuerst durch Koinjektion von Referenzsubstanzen identifiziert. Sowohl für CE als auch für HPLC wurde zusätzlich online-MS Detektion durchgeführt, um die Identifizierung über koinjizierte Referenzsubstanzen zu bestätigen und vor allem, um unbekannte Abbauprodukte zu bestimmen. Die Analyse der MS-Spektren der Peptide erlaubte die Zuordnung der Abbauprodukte zur alpha-Asp- und ß-Asp-Reihe. Zur Quantifizierung der Abbauprodukte wurde die CE-Methode kalibriert und validiert. Der Verlauf des Abbaus der Modellpeptide und der Entstehung der Folgeprodukte wurde analysiert. Inkubation im Sauren führte hauptsächlich zur Hydrolyse der Peptidbindungen zu Dipeptiden und Aminosäuren, zu C-terminaler Deamidierung und zur Bildung von Succinimidyl-Peptiden. Bei pH 10 wurden sowohl für die nativen Amide als auch für die entstehenden deamidierten Tripeptide Isomerisierung und Enantiomerisierung von Asp beobachtet.

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De Boni, Silvia: Degradation of aspartyl peptides. studies on the isomerization and enantiomerization of aspartic acid in model peptides by capillary electrophoresis and high performance liquid chromatography. 2005.

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