19F-Festkörper-NMR-Untersuchungen zur Orientierung und Dynamik des antimikrobiellen Peptids PGLa in Lipidmembranen

Sachse, Carsten

Das antimikrobielle Peptid PGLa (21 Aminosäuren) aus der Haut des Krallenfroschs Xenopus laevis ist für die Permeabilisierung von Bakterienmembranen verantwortlich. Als Ansatz zur Aufklärung seines Wirkmechanismus wurde die Orientierung der [alpha]-helikalen Peptidstruktur relativ zur Membran und ihre Dynamik mit Hilfe der sensitiven 19F-Festkörper-NMR anhand von fünf verschiedenen 4-CF3-Phenylglycin-Markierungen in orientierten Proben untersucht. Nach der Peptid-Festphasensynthese, der Aufreinigung durch RP-HPLC ihrer Identifizierung durch ESI- bzw. MALDI-Massenspektrometrie bestätigten CD-Spektroskopie und antimikrobielle Wachstumsassays sowohl den geringen strukturellen Einfluss der CF3-Phenylglycin-Substitutionen als auch die vergleichbare biologische Wirksamkeit der Analoga zum Wildtyp-PGLa, mit Ausnahme der Substitution an Position Ala8. Eine X2-Analyse der gesammelten 19F-Dipolaufspaltungen ergab die Orientierung der idealisierten PGLa [alpha]-Helix in Bezug auf orientierte Lipidmembranen. Interessanterweise wurden zwei unterschiedliche Zustände je nach experimentellen Bedingungen (Konzentration und Temperatur) und Membranumgebung (DMPC, DLPC, DPPC, DOPC, DMPC:DPMG, DMPG:DMPE, E. coli-Lipidextrakte) gefunden: 1. im S-Zustand (S = surface) bei niedriger Peptidkonzentration legt sich die PGLa-Helix parallel auf die Membranoberfläche, und die Lysin-Seitenketten sind vom hydrophoben Membraninneren weg gerichtet; 2. im T-Zustand (T = tilt) bei hoher Peptidkonzentration (Lipid-Peptid-Verhältnisse von 50:1 bis 20:1) neigt sich die Helix um 30° gegen die Membranebene und dreht sich 25° um ihre Achse. Ein derartiger T-Zustand wird in der vorliegenden Arbeit erstmals beschrieben, und eine plausible Erklärung für die 30°-Orientierung liefert ein Dimerisierungsmodell zweier gegeneinander verkippter antiparalleler PGLa-Helices auf der Membranoberfläche.

PGLa, a 21-residue member of the magainin family of antibiotic peptides isolated from frog skin of Xenopus laevis, is known to be responsible for permeabilizing bacterial membranes. In order to elucidate its mechanism of action, the orientation of the [alpha]-helical peptide structure with respect to the membrane and its dynamics were investigated by sensitive 19F-solid-state NMR measurements through five 4-CF3-phenylglycine labels in oriented samples. After solid-phase peptide synthesis, purification by RP-HPLC and their identification by ESI and MALDI mass spectrometry, CD spectroscopy confirmed the insignificant structural interference of the CF3-phenylglycine substitutions, and antimicrobial growth assays resulted in biological activity comparable to wild-type PGLa, with the exception of the substitution in position Ala8. A X2 analysis of 19F-dipolar couplings yielded the orientational state of the idealized PGLa helix with respect to the membrane surface of lipid membranes. Interestingly, this was found to differ depending on the experimental conditions (concentration and temperature) and membrane composition (DMPC, DLPC, DPPC, DOPC, DMPC:DPMG, DMPG:DMPE, E. coli-lipid extracts): 1. in the S-state (S = surface) at low peptide concentration the PGLa helix assumes a flat orientation on the membrane surface with the lysine side chains directed away from the hydrophobic membrane interior; 2. in the T-state (T = tilt) at high peptide concentration (lipid-to-peptide ratio from 50:1 to 20:1) the helix tilt changes by 30° relative to the membrane plane accompanied by a 25° rotation around its axis. The present thesis describes such a T-state for the first time, and a plausible explanation for the 30°-orientation may be provided by a dimeric model of two tilted PGLa helices aligned antiparallel and located on the membrane surface.

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Sachse, Carsten: 19F-Festkörper-NMR-Untersuchungen zur Orientierung und Dynamik des antimikrobiellen Peptids PGLa in Lipidmembranen. 2003.

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