Metallchalkogenide in Vesikeln Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt dem Rat der Chemisch-Geowissenschaftlichen-Fakultät der Friedrich-Schiller-Universität Jena von Diplom-Chemiker Theodor Alpermann geboren am 06.06.1980 in Frankfurt/Oder Gutachter: 1. Prof. Dr. Wolfgang Weigand, FSU Jena 2. Prof. Dr. Alfred Fahr, FSU Jena 3. Ph.D. Pierre-Alain Monnard, University of Southern Denmark Tag der ö.entlichen Verteidigung: 14. Oktober 2011 Was wir wissen, ist ein Tropfen; was wir nicht wissen, ist ein Ozean. (Sir Isaac Newton) Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis Abbildungsverzeichnis IX Abkürzungsverzeichnis XIII 1 Einleitung 1 1.1 Vesikel -Modelle für biologische Kompartimente . . . . . . . . . . . . . . 1 1.1.1 Eigenschaften und Anwendungen von Vesikeln . . . . . . . . . . . 1 1.1.2 Liposomen............................... 4 1.1.3 Polymersomen ............................. 4 1.1.4 VesikelalsZellmodelle ........................ 5 1.1.5 Vesikel mit Metallchalkogenid-Nanopartikeln . . . . . . . . . . . . 6 1.2 Hypothesen zur Chemischen Evolution und der Entwicklung ersten Lebens 6 1.2.1 „Ursuppen“-Hypothese ........................ 7 1.2.2 RNA-Welt-Hypothese ......................... 8 1.2.3 Chemoautotropher Ursprung des Lebens . . . . . . . . . . . . . . 8 1.3 Zielstellungen................................. 12 2 Eisenhaltige Phospholipidvesikel (Liposomen) 14 2.1 Vorbemerkungen ............................... 14 2.2 Einschluss von Fe2+-IoneninLiposomen .................. 15 2.2.1 Vorüberlegungen ........................... 15 2.2.2 Untersuchungen zur Stabilisierung von Fe2+-Ionen......... 16 2.2.3 Experimente zur Herstellung Fe2+-haltiger Liposomen . . . . . . . 20 2.2.4 Quanti.zierung von intravesikulärem Eisen . . . . . . . . . . . . . 21 2.2.5 Fe2+-haltige Liposomen mit Reverse-Phase-Evaporation . . . . . . 22 2.2.6 Fe2+-haltige Liposomen mit Filmhydratisierung-Extrusion . . . . 26 2.2.7 Diskussion -Einschluss von Fe2+-IoneninLiposomen . . . . . . . 29 2.3 FällungvonFeSinLiposomen........................ 31 2.3.1 Herstellung FeS-haltiger Liposomen . . . . . . . . . . . . . . . . . 31 2.3.2 Untersuchungen zur FeS-Fällung in Liposomen . . . . . . . . . . . 32 2.3.3 Diskussion-FeSinLiposomen.................... 38 2.4 Magnetische Liposomen -Magnetoliposomen . . . . . . . . . . . . . . . . 41 2.4.1 Motivation ............................... 41 2.4.2 Liposomen mit intravesikulär generiertem Magnetit . . . . . . . . 41 2.4.3 Liposomen mit Magnetit-Nanopartikeln . . . . . . . . . . . . . . . 46 2.4.4 Diskussion -Zugänge zu Magnetoliposomen . . . . . . . . . . . . 47 3 Eisenhaltige Polymervesikel (Polymersomen) 49 3.1 Vorbemerkungen ............................... 49 3.2 Einschluss von Fe2+-IoneninPolymersomen ................ 50 3.2.1 Charakterisierung von Fe2+-haltigen Polymersomen . . . . . . . . 50 3.2.2 Diskussion -Fe2+-haltigePolymersomen .............. 55 3.3 FällungvonFeSinPolymersomen...................... 56 3.3.1 Herstellung und Stabilität von FeS-haltigen Polymersomen . . . . 56 3.3.2 Spektroskopische Verfolgung der Bildung von FeS in Polymersomen 58 3.3.3 Lokalisierung des FeS-Niederschlags in Polymersomen . . . . . . . 60 3.3.4 Reversibilität der FeS-Fällungsreaktion in Polymersomen . . . . . 70 3.3.5 Diskussion -FeS-haltige Polymersomen . . . . . . . . . . . . . . . 74 3.4 Alternative Zugänge zu metallsul.dhaltigen Polymersomen . . . . . . . . 79 3.4.1 Polymervesikel mit Fe2+-Ionen und H2S bei niedrigem pH-Wert . 79 3.4.2 Polymervesikel mit internem Thioacetamid und Metallsalzen . . . 80 3.4.3 Polymervesikel mit FeS-Nanopartikeln . . . . . . . . . . . . . . . 84 3.5 EisenoxidhaltigePolymervesikel....................... 86 3.5.1 Motivation ............................... 86 3.5.2 PolymersomenmitintravesikulärgebildetenMagnetit-Nanopartikeln 87 3.5.3 Polymersomen mit stabilisierten Magnetit-Nanopartikeln . . . . . 88 3.5.4 Diskussion -Magnetithaltige Polymersomen . . . . . . . . . . . . 92 3.6 Exkurs:Magnetit-Nanopartikel ....................... 94 3.6.1 Motivation ............................... 94 3.6.2 Solvothermische Herstellung von Magnetit-Nanopartikeln . . . . . 94 3.6.3 Charakterisierung von Magnetit-Nanopartikeln . . . . . . . . . . . 95 3.6.4 Diskussion............................... 97 4 Einschluss weiterer Übergangsmetalle in Polymersomen 98 4.1 Motivation................................... 98 Inhaltsverzeichnis 4.2 NickelhaltigePolymersomen ......................... 99 4.2.1 Vorbemerkungen ........................... 99 4.2.2 Entwicklung einer Methode zur Quantifzierung von Ni2+-Ionen . . 99 4.2.3 Herstellung und Charakterisierung Ni2+-haltiger Polymersomen . 100 4.2.4 Herstellung und Charakterisierung NiS-haltiger Polymersomen . . 102 4.3 CadmiumhaltigePolymersomen .......................108 4.3.1 Vorbemerkungen ...........................108 4.3.2 Herstellung und Charakterisierung Cd2+-haltiger Polymersomen . 109 4.3.3 Herstellung und Charakterisierung CdS-haltiger Polymersomen . . 110 4.3.4 Diskussion -CdS-haltige Polymersomen . . . . . . . . . . . . . . . 120 4.4 KupferhaltigePolymersomen.........................123 4.4.1 Vorbemerkungen ...........................123 4.4.2 Herstellung und Charakterisierung Cu2+-haltiger Polymersomen . 123 4.4.3 Herstellung und Charakterisierung CuS-haltiger Polymersomen . . 125 4.5 Diskussion -Übergangsmetallhaltige Polymersomen . . . . . . . . . . . . 127 5 Untersuchungen zu Eisensul.den 133 5.1 Motivation...................................133 5.2 Herstellung und Charakterisierung von amorphem FeS . . . . . . . . . . 134 5.3 Herstellung und Charakterisierung von Pyrit FeS2 ............. 135 5.4 Untersuchungen zur Reaktion von FeS und H2S ..............137 5.4.1 Vorbemerkungen ...........................137 5.4.2 Durchführung und Analyse der Reaktionsprodukte . . . . . . . . 137 5.4.3 Untersuchungen zum H2-EinschlussinPyrit ............138 5.4.4 Diskussion...............................139 5.5 Untersuchungen zur Reduktion von DMSO durch das FeS/H2S-System . 141 5.5.1 Vorbemerkungen ...........................141 5.5.2 DurchführungundBeobachtungen . . . . . . . . . . . . . . . . . 141 5.5.3 Quantitative Bestimmung des DMS-Gehaltes mittels GC . . . . . 142 5.5.4 Analyse der festen Reaktionsprodukte . . . . . . . . . . . . . . . . 146 5.5.5 DiskussionundAusblick.......................148 6 Zusammenfassung 151 7 Experimenteller Teil 155 7.1 ChemikalienundMethoden .........................155 7.2 Vorschriften..................................159 Literaturverzeichnis 168 Anhang 176 Danksagung..................................... 176 Eigene wissenschaftliche Verö.entlichungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 178 Publikationen ................................. 178 Poster .....................................178 Vorträge.................................... 179 Selbständigkeitserklärung .............................180 Supplement ..................................... 181 Abbildungsverzeichnis Abbildungsverzeichnis 1 Schematische Darstellung eines Liposoms und eines Polymersoms . . . . 2 2 a: Packungsparameter P,b:StrukturvonPOPC.............. 3 3 Herausbildung von zellulären Strukturen im Eisen-Schwefel-Welt-Szenario 10 4 Prinzip eines kompartimentierten Pionier-Metabolismus . . . . . . . . . . 12 5 Prinzip der Herstellung FeS-haltiger Liposomen . . . . . . . . . . . . . . 15 6 (a) Absorption von Fe2+-PDC-Lösungen; (b) graphische Ermittlung der Fe2+-PDC-Komplexzusammensetzung.................... 18 7 Fe2+-PDC-Komplexzusammensetzung -Methode der molaren Verhältnisse 19 8 E.ekt von EDTA und H2S auf Fe2+-PDC-Lösungen............ 20 9 StrukturvonTRITONX100 ........................ 22 10 PrinzipderRVE ............................... 23 11 PCS von extrudierten, Fe2+-PDC-Komplex-haltigen Liposomen . . . . . . 27 12 Cryo-TEM-Aufnahmenvonextrudierten,Fe2+-PDC-Komplex-haltigenLi­ posomen.................................... 28 13 StrukturvonTween80............................ 30 14 UV/Vis-spektroskopischeVerfolgungderReaktiondesFe2+-PDC-Komplexes innerhalb und außerhalb von Liposomen mit H2S ............. 33 15 Cryo-TEM-Aufnahmen von Fe2+-und potenziell FeS-haltigen Liposomen 35 16 Cryo-TEM-AufnahmenvonFe2+-PDC-Komplex-haltigenLiposomennach InkubationmitNaHS-Lösung ........................ 36 17 Cryo-TEM-AufnahmenvonFe2+-haltigenLiposomennachInkubationmit NaHS-Lösung................................. 37 18 Cryo-TEM-Aufnahmen von Fe2+-haltigen Liposomen nach externer Zu- gabeeinerFeS-Suspension .......................... 37 19 Aufnahmen von Fe2+-haltigen RVE-Liposomen nach Lagerung an einem Supermagnet ................................. 42 20 Cryo-TEM-Aufnahmen von RVE-Liposomen nach Inkubation mit NH3 undLagerunganLuft ............................ 43 21 Cryo-TEM-Aufnahmen von RVE-Liposomen nach Inkubation mit NH3 undLagerunganLuft ............................ 44 22 Cryo-TEM-Aufnahmen von RVE-Liposomen nach Inkubation mit NH3 undLagerunganLuft ............................ 45 23 Cryo-TEM-Aufnahmen von FHE-Liposomen nach Inkubation mit NH3 und Lagerung an Luft . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46 24 Struktur von block-1,2-Polybutadien-polyethylenoxid . . . . . . . . . . . 49 25 Lichtmikroskopische Aufnahme einer mittels GPC aufgereinigten Poly­ mersomendispersion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51 26 Cryo-TEM-Aufnahme von extrudierten, mit TRIS-Pu.er beladenen Po­ lymersomen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51 27 Fe2+-Gehalt in aufgereinigten, Fe2+-PDC-haltigen Polymersomendisper­ sionen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53 28 Prinzip der Generierung von FeS in aufgereinigten, Fe2+-haltigen Poly­ mersomen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56 29 Verfärbung einer FeCl2-haltigen Polymersomendispersion im Verlauf der H2S-Begasung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57 30 UV/Vis-Spektrum von aufgereinigten, Fe2+-PDC-haltigen Polymersomen (a) und dessen zeitliche Veränderung nach H2S-Inkubation (b) . . . . . . 59 31 Nachweis der intravesikulären Generierung von FeS in Polymersomen . . 61 32 Inhibierender Ein.uss von EDTA auf die FeS-Fällung aus dem Fe2+-PDC- Komplex . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62 33 Lichtmikroskopische Aufnahmen von aufgereinigten, Fe2+-PDC-haltigen Polymersomen, .xiert auf Objektträger, vor und nach Inkubation mit H2S 63 34 TEM-Aufnahmen von eingetrockneter Probe aufgereinigter, Fe2+-PDC­ haltiger Polymersomen nach Inkubation mit H2S . . . . . . . . . . . . . . 64 35 Cryo-TEM-Aufnahmen von aufgereinigten, 500 mM FeCl2-haltigen Poly­ mersomen vor und nach Inkubation mit H2S . . . . . . . . . . . . . . . . 66 36 Prinzip der REM und REM-Aufnahme von aufgereinigten, Fe2+-PDC­ haltigen Polymersomen nach Inkubation mit H2S . . . . . . . . . . . . . 68 37 REM-Aufnahmen von potenziell FeS-haltigen Polymersomen bei unter­ schiedlichen Anregungsenergien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69 38 REM-EDX-Spektrumvon aufgereinigten,Fe2+-haltigen Polymersomennach Inkubation mit H2S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70 39 REM-ESMA von FeS-und CdS-haltigen Polymersomen bei unterschied­ licher Lagerung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72 40 Abhängigkeit der S2--Konzentration von der H2S-Konzentration bei pH 7,4 76 Abbildungsverzeichnis 41 Cryo-TEM-Aufnahmen von PB-PEO-Polymersomen nach Inkubation mit NH3 und Lagerung an Luft . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88 42 Cryo-TEM-Aufnahmen von (a) Magnetit-Nanopartikeln und (b), (c) Po­ lymersomen mit Magnetit-Nanopartikeln . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90 43 Cryo-TEM-Aufnahmen von Polymersomen mit Magnetit-Nanopartikeln . 91 44 Cryo-TEM-Aufnahmen von Polymersomen mit Membran-deformierenden Magnetit-Nanopartikeln . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91 45 Pulver-Röntgendi.raktogramm von Magnetit-Nanopartikeln . . . . . . . 95 46 TEM-Aufnahme von Magnetit-Nanopartikeln . . . . . . . . . . . . . . . 96 47 (a): Struktur von Ni2+-Dimethylglyoxim und (b): Ni2+-Gehalt in aufge­ reinigten, Ni2+-haltigen Polymersomendispersionen . . . . . . . . . . . . 101 48 Experimente-Schema zum Nachweis der intravesikulären Bildung von NiS in aufgereinigten, Ni2+-haltigen Polymersomendispersionen . . . . . . . . 103 49 UV/Vis-spektroskopische Verfolgung der NiS-Fällung in Polymersomen . 105 50 Cryo-TEM-Aufnahmen von aufgereinigten, Ni2+-haltigen Polymersomen vor und nach Inkubation mit H2S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106 51 Cryo-TEM-Aufnahmen von aufgereinigten, Ni2+-haltigen Polymersomen nach Inkubation mit H2S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107 52 Wellenlänge der CdS-Absorptionskante in Abhängigkeit von der Partikel­ größe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108 53 Mittels FAAS bestimmter Cd2+-Gehalt in aufgereinigten, Cd2+-haltigen Polymersomen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 110 54 Graphische Ermittlung der CdS-Absorptionskante aus UV/Vis-Spektrum CdS-haltiger Polymersomen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111 55 UV/Vis-Spektren zur zeitlichen Verfolgung der CdS-Fällung in Polymer­ somen und in als Vergleich in Lösung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112 56 pH-Abhängigkeit der Partikelgröße von intravesikulär gebildetem CdS . . 114 57 Abhängigkeit der Partikelgröße von intravesikulär gebildetem CdS vom Mischungsverhältnis mit H2S-Lösung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115 58 Abhängigkeit der Partikelgröße von intravesikulär gebildetem CdS von der CdCl2-Startkonzentration und dem pH-Wert . . . . . . . . . . . . . . 116 59 Cryo-TEM-Aufnahmen von aufgereinigten, Cd2+-haltigen Polymersomen 117 60 Cryo-TEM-Aufnahmen von aufgereinigten, Cd2+-haltigen Polymersomen nach Inkubation mit wässriger H2S-Lösung . . . . . . . . . . . . . . . . . 118 61 Cryo-TEM-Aufnahmen von aufgereinigten, Cd2+-haltigen Polymersomen nach Inkubation mit wässriger H2S-Lösung................. 119 62 Mittels FAAS bestimmter Kupfergehalt in aufgereinigten, Cu2+-haltigen Polymersomen................................. 124 63 UV/Vis-spektroskopischeVerfolgungderCuS-Fällung:(a)inCu2+-haltigen Polymersomen und (b) aus einer 0,8 mM CuCl2-Lösung.......... 125 64 Verfolgung des Fällungskinetik über Veränderungen der optischen Dichte für Cd2+-und Cu2+-haltigePolymersomen................. 130 65 Röntgenpulverdi.raktogramm von aufgereinigtem Pyrit aus der Reaktion von FeS und S8 ................................ 136 66 (a) Schematische Darstellung der Extraktion von DMS aus einer Probe der Reaktionslösung und (b) Beispiel-Gaschromatogramm von DMS in Toluen..................................... 143 67 DMS-Ausbeute der Reduktionsreaktion von DMSO durch FeS/H2S bzw. H2S....................................... 145 68 PXRD-Di.raktogrammderReaktionsproduktederDMSO-Reduktionmit FeS sowie mit FeS/H2S............................ 147 69 (a)REM-AufnahmeFeS-haltigerPolymersomen,(b)Cryo-TEM-Aufnahme vonLiposomenmitMagnetit-Nanopartikelnund(c)Cryo-TEM-Aufnahme einesCdS-haltigenPolymersoms....................... 152 70 Berechnung des internen Volumens von Liposomendispersionen . . . . . . 182 71 Massenspektrum des Rückstands aus FeS-Polymersomendispersionen . . 183 Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis acac Acetylacetonat BET Brunauer-Emmett-Teller BSE Rückstreu-Elektronen (back-scatter electrons) CH2Cl2 Dichlormethan CHCl3 Chloroform Cryo-TEM Cryo-Transmissionselektronenmikroskopie DBSO Dibenzylsulfoxid dimegly Dimethylglyoxim DMS Dimethylsul.d DMSO Dimethlysulfoxid DNS Desoxyribonukleinsäure DPSO Diphenylsulfoxid DTA Di.erenzthermoanalyse EDTA Dinatriumsalz der Ethylendiamintetraessigsäure EDX Energie-dispersive Röntgenstrahlung EE Einschlusse.zienz ESMA Elektronenstrahl-Mikroanalyse FAAS Flammen-Atomabsorptionsspektroskopie FHE Filmhydratisierungs-Extrusions-Methode FID Flammenionisationsdetektor GC Gaschromatographie ggf. gegebenenfalls GPC Gelpermeationschromatographie min Minuten MS Massenspektrometrie NP Nanopartikel(n) PB-PEO 1,2-Polybutadien-polyethylenoxid block-Copolymer PCS Photon Correlation Spectroscopy PDC Pyrazin-1,2-dicarbonsäure PDI Polydispersitätsindex phen 1,10-Phenanthrolin PL Phospholipide POPC 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-phosphatidylcholin PXRD Röntgenpulverdi.raktometrie (powder X-ray di.raction) REM Rasterelektronenmikroskopie RNA Ribonucleic acid (Ribonukleinsäure) RVE Reverse-Phase-Evaporation-Methode SE Sekundär-Elektronen TAA Thioacetamid TEM Transmissionselektronenmikroskopie TG Thermogravimetrie THF Tetrahydrofuran TREG Triethylenglykol TRIS Tris(hydroxmethyl)-aminomethan TRIS-HCl 100 mM TRIS-HCl-Pu.er mit pH 7,4 u.U. unter Umständen v.a. vor allem 1 Einleitung Vesikel sind synthetische Kompartimente, die sowohl Anwendung in der Biotechnologie, Pharmazie und Medizin als auch als Modell für biologische Kompartimente .nden [1]. Insbesondere Lipidvesikel (Liposomen) sind aus Membranen aufgebaut, die lebenden Zellen strukturell sehr ähneln. Darum sind sie für Untersuchungen von Membranprozes­sen sowie für die Simulation von grundlegenden zellulären Vorgängen äußerst attraktiv. Vesikel .nden überdies bei der Konstruktion von so genannten Minimal-bzw. semi­synthetischen Zellen Anwendung [2]. Solche Untersuchungen sollen zur Aufklärung der wesentlichen Komponenten und Prinzipien zellulären Lebens beitragen und bei der Iden­ti.zierung der (über)lebensnotwendigen, nicht-redundanten Ausstattung einer lebenden Zelle helfen. Es wird letztenendes angestrebt, eine arti.zielle (Minimal-)Zelle zu erzeu­gen, die von einem einfachen, plausibel präbiotischen Anfangsstadium ausgehend alle oder zumindest einzelne Eigenschaften von Leben, also Sto.wechsel, Reproduktion und Anpassungsfähigkeit, entwickelt [1]. Die Untersuchungen können auch Hinweise auf die Funktionsweise und Gestalt von einfachen Protozellen als mögliche Vorläufer erster Zel­len und somit ersten Lebens auf der Erde liefern. Hierbei wird ein anderer Ansatz verfolgt als bei der vor kurzem publizierten Generierung eines arti.ziellen Bakteriums [3]. Dort wurde zunächst computergestützt eine künstli­chen DNS aus Bruchstücken eines Bakteriengenoms erzeugt. Anschließend erfolgte die TransplantationdieserDNSineineBakterienzelleohneErbinformation,jedochmitkom­pletter Zellausstattung. Bei diesem Experiment wurde allerdings nur Leben aus Leben gescha.en und somit nicht im Sinne der semi-synthetischen Zelle die Entwicklung einer nicht komplett ausgestatteten Protozelle untersucht. 1.1 Vesikel -Modelle für biologische Kompartimente 1.1.1 Eigenschaften und Anwendungen von Vesikeln Vesikel sind zellähnliche Strukturen, bei denen ein wässriges Tröpfchen vollständig von einer semipermeablen Membran eingeschlossen wird. Die Vesikelmembran wird von am­phiphilen Molekülen mit einer geeigneten Molekülstruktur aufgebaut, die es ermöglicht, dass sich die Moleküle unter bestimmten Bedingungen in geschlossenen Kompartimen­ten mit einer Doppelschicht organisieren (s. Abb. 1). Es gibt verschiedene amphiphi­le, vesikelbildende Molekülklassen, z.B. Phospholipide (PL), langkettige Carbonsäuren Abb. 1: links (a): Schematische Darstellung eines aus Phospholipidmolekülen aufgebauten Li­posoms (aus [4]) und rechts (b): Schematische Darstellung eines Polymersoms, das aus einem Copolymer mit einer hydrophilen (blau) und einer hydrophoben (rot) Einheit aufgebaut ist (aus [5]) (Fettsäuren) und auch block-Copolymere. All diesen Molekülen ist ein langkettiger hy­drophober Teil und eine hydrophile bzw. geladene Kopfgruppe eigen. Für die Fähigkeit, Vesikel zu bilden, ist das Größenverhältnis zwischen dem hydrophoben Teil und der hydrophilen Kopfgruppe entscheidend. Dieses wird durch den so genannten Packungs­parameter P beschrieben: P = V · a-1 · l-1 Dabei ist V das Volumen des hydrophoben Teils, a der Flächenbedarf der hydrophi­len Kopfgruppe und l die Länge der hydrophoben Kette als Normale zur Fläche der Kopfgruppe (vgl. Abb. 2a). Der Packungsparameter sowie die Wölbung der Grenz.ä­che zwischen hydrophilem und hydrophobem Teil bestimmen die geometrische Form des einzelnen amphiphilen Moleküls und dirigieren damit die Anordnung vieler solcher Moleküle in eine bestimmte selbstorganisierende Struktur [6]. Bei einem Packungspa­rameter von 12 < P < 1 ordnen sich die Amphiphile in Doppelschichten an, was die Bildung von Vesikeln ermöglicht. Die thermodynamisch treibende Kraft bei dem Pro­zess der Selbstorganisation ist dabei die Verminderung der Grenz.ächenenergie zwischen dem hydrophoben Teil des isolierten Amphiphils und umgebendem Wasser [6]. Dieses Phänomen ist auch unter dem Namen „hydrophober E.ekt“ bekannt [7]. Für die Generierung von Vesikeln ist zudem die Temperatur von Bedeutung. So lassen sichstabileVesikelausPhospholipidennuroberhalbdersogenannten„Phasenübergangs­temperatur“ herstellen. Oberhalb dieser Temperatur be.nden sich die Moleküle in der 1.1 Vesikel -Modelle für biologische Kompartimente Abb. 2: links (a): Veranschaulichung des Packungsparameters P von amphiphilen Molekülen (aus [6]) und rechts (b): Strukturformel von POPC Phospholipidmembran im .üssigkristallinen Zustand, der für eine höhere Beweglichkeit der Moleküle und somit für die notwendige Flexibilität der Membran sorgt. Unterhalb der Phasenübergangstemperatur be.nden sich PL im so genannten Gelzustand, in dem die Moleküle in der Membran deutlich starrer und weniger beweglich sind. Weitere wichtige Parameter sind, insbesondere für amphiphile Moleküle mit ionischer Kopfgruppe, die Ionenstärke bzw. für protonierbare Lipide der pH-Wert. Je nach pKS ­/pKB-Wert der amphiphilen Moleküle bzw. deren funktionellen Gruppen können saure Gruppen deprotoniert oder basische Gruppen pH-abhängig protoniert werden. In Ab­hängigkeit vom pH-Wert kann sich damit die Anordnung der amphiphilen Moleküle in der Vesikelmembran und die Ausrichtung an der Membranober.äche deutlich verän­dern. Das unter anderem aus Eidotter oder Sojabohnen gewonnene POPC (1-Palmitoyl­2-oleoyl-sn-glycero-phosphatidylcholin; Struktur s. Abb. 2b) besitzt beispielsweise eine zwitterionische Kopfgruppe mit einer Phosphatgruppe und einem quartären Ammoniu­mion, deren Orientierung an der Membranober.äche sich pH-abhängig verändern kann. Daraus resultiert eine pH-abhängige Membranpermeabilität und auch Stabilität von POPC-Liposomen [8,9]. Fettsäuren wie z.B. Ölsäure bilden Vesikel überhaupt nur in einem engen pH-Bereich von ungefähr pH 7 -9. Es wird angenommen, dass die Vesikel aus einem Gemisch von deprotonierten und protonierten Fettsäuremolekülen aufgebaut sind [1]. Bei niedrige­rem pH-Wert .ndet eine Phasentrennung der vollständig protoniert vorliegenden Säure statt, bei hohen pH-Werten bilden sich Mizellen aus der vollständig deprotonierten Fett­säure. Zusätzlich wird die Vesikelbildung noch durch andere Faktoren wie Gegenionen, Temperatur und Konzentration beein.usst [1]. 1.1.2 Liposomen Liposomen repräsentieren einen bedeutenden Typ von Vesikeln. Sie sind üblicherweise aus natürlich vorkommenden Phospholipiden wie POPC, manchmal auch aus rein syn­thetischen PL aufgebaut (s. Abb. 1a). Phospholipide können aufgrund ihrer Struktur und ihren amphiphilen Eigenschaften im wässrigen spontan Vesikel in einem Größenbe­reich von ca. 20 nm bis zu 10 µm bilden [8,10]. Da Liposomen meist aus natürlichen PL aufgebaut sind, die auch in zahlreichen Biomembranen vorkommen, ähneln sie struk­turell in gewisser Weise Zellen, was ihre mannigfaltige Verwendung als Zellmodell be­gründet (s. Kapitel 1.1.4). Liposomen können verschiedenste Materialien je nach deren Löslichkeits-Eigenschaften im wässrigen Inneren oder auch in der Membran einschließen. Aus diesem Grund .nden Liposomen vielfältige Anwendung, z.B. in der Verkapselung und dem Transport von physiologisch relevanten Substanzen bzw. Arzneisto.en (drug delivery) [11]. Zudem können so genannte superparamagnetische, meist mit Magnetit­Nanopartikeln(Magnetit-NP)beladeneLiposomenalsRöntgenkontrastmittel,Kontrast­mittel in der Kernspintomographie oder auch als Anti-Tumor-Reagenz eingesetzt wer­den [11–13]. In letzterem Fall reichern sich Liposomen nach der Verabreichung aufgrund der erhöhten Sto.wechselaktivität in den Krebszellen an. Mittels eines auf den Tumor gerichteten Wechselmagnetfeldes können die Magnetit-Partikel dann erwärmt werden, was den Tod umgebender Tumorzellen zur Folge hat [14]. Allerdings weisen Liposomen im Allgemeinen eine nur moderate chemische und mechanische Stabilität auf und sind auch nur sehr begrenzt lagerbar [5]. Diese Einschränkungen können durch den Einsatz anderer vesikulärer Systeme wie Polymersomen (s. nächstes Kapitel) verringert werden. Liposomen sind durch eine Vielzahl von Methoden generierbar. So zählen u.a. die Erzeu­gung in wässrigen Dispersionen von Phospholipiden mittels Ultraschall und die Hydra­tisierung eines Phospholipid.lms mit einem wässrigen Medium (Film-Hydratisierungs-Methode) zu Standardmethoden. Des weiteren sind die Injektion einer alkoholischen oder etherischen Lösung des Phospholipids in ein wässriges Medium und die sogenannte Reverse-Phase-Evaporation-Methode (RVE) (s.S. 22) neben vielen anderen Methoden bekannt [15]. 1.1.3 Polymersomen Eine strukturell ganz andere vesikelbildende Substanzklasse stellen bestimmte amphi­phile block-Copolymere dar, die so genannte Polymersomen bilden können (s. Abb. 1b). 1.1 Vesikel -Modelle für biologische Kompartimente Derartige Vesikel wurden erstmals 1995 beschrieben [16]. Polymersomen können in ver­gleichbaren Größen wie Liposomen hergestellt werden, weisen im Vergleich zu Liposo­men allerdings eine deutlich dickere Membran, bedingt durch die höheren Molmassen, auf. Aufgrund der rein synthetischen Natur der Polymere können dabei Parameter wie Molmasse und Zusammensetzung (z.B. Diblock-, Triblock-oder Multiblock-Copolymere verschiedener Einheiten) innerhalb bestimmter Grenzen für die Vesikelbildung beliebig variiert werden. So können unter anderem durch das Einstellen der Molmasse die mecha­nischen Eigenschaften der Membran und deren Permeabilität kontrolliert bzw. durch die Art des verwendeten Polymers die Ober.äche der Polymersomen mit unterschiedlichsten biochemisch relevanten funktionellen Gruppen versehen werden [5]. Auch Polymersomen eignen sich analog zu Liposomen für den Einschluss von hydrophilen Substanzen im Ve­sikelinneren und hydrophoben Substanzen in der Vesikelmembran. Zudem ist es durch den Einbau von Gruppen, die auf äußere Stimuli reagieren, möglich, Polymersomen ge­zielt durch z.B. pH-Veränderungen, UV-Licht oder Oxidationsmittel abzubauen. Dies ist insbesondere für die gesteuerte Freisetzung von eingeschlossenen Substanzen inter­essant [5]. Polymersomen sind prinzipiell analog den Herstellungsmethoden für Liposomen zugäng­lich. Die Bildungsgeschwindigkeit der Vesikel ist jedoch, bedingt durch die Flexibilität der Polymerketten, meist niedriger. 1.1.4 Vesikel als Zellmodelle Als sehr einfaches Zellmodell spielen Vesikel eine wichtige Rolle, da mit ihnen einzelne, meist isolierte Prozesse aus der Fülle intrazellulärer Vorgänge erforscht werden können. Die Untersuchungen, bei denen aufgrund der Ähnlichkeit zu natürlichen Membranen oft Phospholipide (z.B. POPC) eingesetzt werden, sollen zur Verbesserung des Verständnis­sesvonintrazellulärenbiochemischenReaktionenunterdenbesonderenBedingungender Kompartimentierung, d.h. in einer abgeschlossenen Mikroumgebung, dienen. So wurden in Vesikeln die DNS-Polymerase-Kettenreaktion, die enzymatische Synthese der amphi­philen Membrankomponenten sowie in mehreren Fällen die Expression von Proteinen er­folgreich durchgeführt (zusammengefasst in [1]). Trotz faszinierender Ergebnisse bei der Simulation von einzelnen, zellulären Vorgängen sind diese Untersuchungen nur modell­haft. Dies liegt u.a. in fehlenden Membrantransportmöglichkeiten zur Aufrechterhaltung der Reaktionen begründet. Als Konsequenz daraus kommen die erforschten intrazellu­lären Prozesse in der Regel schon nach kurzer Zeit zum Erliegen. Dieses Problem kann durch den Einsatz von membranständigen Transportenzymen umgangen werden [17]. 1.1.5 Vesikel mit Metallchalkogenid-Nanopartikeln Neben den bereits in der Medizin Anwendung .ndenden Magnetit-haltigen Liposomen (s. Kapitel 1.1.2) bietet die Kompartimentierung von photohalbleitenden Metallchalko­geniden ein vieversprechendes Forschungsfeld. Ziel dabei ist der Einschluss eines elek­tronenübertragenden Systems in einem Kompartiment, das als eine Art Mikroreaktor angesehen werden kann. Es wurden bereits von verschiedenen Gruppen die photokatalytisch aktiven Metallchal­kogenide CdS [18–23] und TiO2 [24] in Liposomen eingeschlossen. Die photokatalytische Aktivität von CdS und TiO2 konnte anhand eines Elektronentransports bei Bestrahlung von einem intravesikulären Elektronendonor zu einem extravesikulären Elektronenak­zeptor belegt werden [18–20,24]. Diese Untersuchungen sind auch für die generelle Mo­dellierungvonpotenziellenVorläufernvonprimordialenProtozellen(s.nächstesKapitel) von Relevanz. Das kompartimentierte elektronenübertragende System könnte dabei zur Aufrechterhaltung eines primitiven Metabolismus in einer Art Protozelle dienen. Dies wird für das verkapselte TiO2 vorgeschlagen, das als Modell für eine frühe Photosynthese angesehen werden kann [24]. Hingegen fehlen bisher Untersuchungen zu kompartimen­tierten mineralischen Systemen wie FeSx (x = 1,2) und Montmorillonit, die womöglich ebenfalls eine wichtige Rolle bei der Entstehung ersten Lebens spielten (s. Kapitel 1.2.3). 1.2 Hypothesen zur Chemischen Evolution und der Entwicklung ersten Lebens „Chemische Evolution“ wird als der Prozess der Synthese von biochemischen Bausteinen wie z.B. Aminosäuren, Fettsäuren und Nucleinsäurebasen aus einfachen, auf der Urer­de vorhandenen Molekülen unter präbiotischen Bedingungen de.niert [25]. Der Aufbau von immer komplexeren, hochmolekularen Strukturen aus diesen Bausteinen durch eine Vielzahl heute kaum mehr rekonstruierbarer Prozesse führte schließlich zur Entstehung ersten Lebens (Biogenese) [26]. Die Beantwortung der Frage, wie und in welchen Stufen der Prozess der Biogenese auf der Erde vor ca. 3,8 Milliarden Jahren erfolgte, stellt eine kaum zu bewältigende Heraus­forderung für die Naturwissenschaften dar. Schließlich handelt es sich bei der Biogenese 1.2 Hypothesen zur Chemischen Evolution und der Entwicklung ersten Lebens um ein Ereignis, das unter bisher nur ungenügend bekannten Bedingungen ablief. So kann die Zusammensetzung der Uratmosphäre und die damit verbundenen Redoxbedin­gungen auf der Urerde vor ca. 3,8 Milliarden Jahren nur grob extrapoliert werden [27], die genaue Umgebung, in der sich erstes Leben entwickelte, ist unbekannt. Zudem exis­tieren praktisch keinerlei geologische Rückstände aus dieser Zeit, die Hinweise auf frühe Lebensformenundderen Vorläufer geben könnten.Damitistjegliche Hypothese zur Ent­stehung von Leben nicht falsi.zierbare Spekulation. Verschiedene Hypothesen können ausschließlich hinsichtlich ihrer Plausibilität miteinander verglichen werden [26]. Nichts­destotrotz wird die Frage nach dem Ursprung des Lebens heute zu den wichtigsten und herausfordernsten Fragestellungen der Chemie gezählt [28]. 1.2.1 „Ursuppen“-Hypothese Als Erster versuchte Oparin 1924 mit seiner „Ursuppen“-Hypothese, den Prozess der Biogenese in den naturwissenschaftlichen Diskurs einzubringen. Er postulierte, dass sich in der reduzierenden Uratmosphäre mit den Gasen CH4, NH3,H2 und H2O unter dem Ein.uss von UV-Strahlung und Blitzentladungen organische Materie bildete [25]. Diese Materie habe sich dann in der Hydrosphäre angereichert und eine Art „verdünnter Sup­pe“ gebildet, aus der dann spontan erstes Leben entstand [25]. Doch erst durch das „Miller-Urey-Experiment“ im Jahr 1953 [29], in dem die Bildung biochemisch relevanter Bausteine wie z.B. mehrerer Aminosäuren sowie kurzkettiger Hy­droxysäuren in einer reduzierenden Atmosphäre unter Blitzentladungen nachgewiesen werden konnte, wurde aufgezeigt, dass das Biogenese-Problem experimentell zugäng­lich ist. Darum begannen in den nachfolgenden Jahrzehnten intensive experimentelle Untersuchungen zur Bildung von biochemisch relevanten Molekülen unter mutmaßlich präbiotischen Bedingungen [25]. Nach und nach gelang es, verschiedene biochemische Bausteine wie Aminosäuren, kurzkettige Fettsäuren und Nucleinsäurebasen, allerdings nichtalleuntervergleichbarenBedingungen,zugenerieren[30].DerartigeMolekülklassen konnten zudem auf dem prominenten Murchison-Meteoriten entdeckt werden, so dass die Verfügbarkeit biochemischer Bausteine aus terrestrischen bzw. extraterrestrischen Quellen auf der Urerde als gegeben angesehen wird [25]. Allerdings gelang es bislang nicht, plausible Wege für den konvergenten Aufbau von hochmolekularen Systemen wie Proteinen und informationstragenden Polymeren aus den Bausteinen zu .nden. Eine stringente Hypothese von der Bildung organischer Materie bis zur Ausbildung ersten Lebens kann die Ursuppen-Hypothese somit nicht liefern [30]. 1.2.2 RNA-Welt-Hypothese Einen anderen Ansatz hat die RNA-Welt-Hypothese, entsprechend der sich ein erstes selbst-replizierendes und katalytisch aktives System auf Basis der RNA ausgebildet hat. Die Annahme stützt sich auf die vielfältigen Eigenschaften der RNA, welche sowohl die Fähigkeit zur Informationsübertragung besitzt als auch katalytische Eigenschaften auf­weist [31]. Allerdings gilt es auch für die RNA plausible Mechanismen zum Aufbau eines Polymers aus einzelnen Nukleotiden zu .nden, da sich eine katalytische Aktivität erst bei der Verknüpfung von mindestens 20-30 Nukleotiden einstellt. Tatsächlich ist aber noch kein präbiotisch plausibler Weg bekannt, Nukleotide überhaupt herzustellen, so dass über eine Prä-RNA-Welt spekuliert wird [32]. Immerhin konnte bereits gezeigt wer­den, dass RNA-Oligomere aus aktivierten Nukleotiden in speziellen kompartimentierten Umgebungen wie entwässerten Lipiddoppelschichten bzw. im eutektischen Wasser-Eis-Gemisch bei -18.C unter Katalyse von Metallionen aufgebaut werden können [33,34]. Die Frage, wie hinreichend lange und stabile sowie rasch genug gebildete bzw. replizier­te RNA-Sequenzen generiert werden können und wie überhaupt Nukleotide plausibel präbiotisch entstehen können, bleibt Gegenstand zukünftiger Untersuchungen [25]. 1.2.3 Chemoautotropher Ursprung des Lebens Natürlich vorkommende Minerale wie Montmorillonit (Tonmineral) sowie Übergangsme­tallsul.de haben möglicherweise eine zentrale Rolle bei der Herausbildung von lebenden Systemen gespielt, da sie in der Lage sind, an der Ober.äche angelagerte Moleküle zu aktivieren und somit bestimmte Reaktionen gezielt zu katalysieren [35,36]. So ist z.B. bekannt, dass eine Vielzahl von Mineralen in der Lage ist, die Umwandlung von Fettsäure-Micellen in Vesikel zu befördern [37]. Ende der 1980er wurden überdies zwei Hypothesen vorgestellt, welche die womöglich zentrale Bedeutung von Eisensul.den für die Entstehung ersten Lebens betonen. Ei­senmonosul.d FeS ist oxidationsemp.ndlich gegenüber Sauersto. und kommt darum nur in geringen Mengen auf der Erde, z.B. in der Umgebung so genannter „Schwarzer Raucher“ auf dem Meeresboden, vor [25]. Allerdings waren FeS und Pyrit (FeS2) auf der Urerde in der sauersto.freien Atmosphäre vorhanden [25]. Plausibilität gewinnen die Hypothesen durch die Tatsache, dass einfache Fe-S-Verbindungen wie [2Fe:2S]-und 1.2 Hypothesen zur Chemischen Evolution und der Entwicklung ersten Lebens [4Fe:4S]-Cluster Redoxpotenziale mit einer großen Bandbreite aufweisen und in einer Vielzahl von Enzymen wirksam sind [38]. So bilden Eisen-Schwefel-Cluster u.a. die ak­tiven Zentren in heutigen Enzymen, die Redoxreaktionen an Molekülen wie N2,H2 und CO katalysieren [38]. Diese Moleküle waren höchstwahrscheinlich wichtige Bestandteile der Uratmosphäre [38]. Biogenese in FeS-Blasen Diese von M. Russel und W. Martin maßgeblich entwickelte Hypothese postuliert, dass sich erstes Leben am Meeresboden in Eisensul.d-Kompartimenten entwickelte, die an der Grenz.äche zwischen dem sul.dhaltigen Wasser von Hydrothermalquellen und dem Fe2+-haltigen Wasser des Urozean gebildet wurden [39]. Die Triebkraft für den Auf­bau organischer Materie aus CO2 lieferte ein Temperatur-, Redox-und pH-Gradient an der ausgefällten Membran aus Eisensul.d zwischen dem warmen, alkalischen und H2 ­haltigen Hydrothermalwasser und dem kalten CO2-haltigen Wasser des Urozeans [40]. Die gebildeten FeS-Blasen werden als funktionelle Vorläufer von später entstehenden Zellwänden interpretiert. Durch sie konnten Reaktanden im Inneren der Kompartimente hinreichend aufkonzentriert werden. Durch die vorherrschenden Gradienten sowie durch die katalytische Wirkung von Metallsul.den konnten komplexere organische Moleküle unter Fixierung von CO2 aufgebaut werden [40]. In den mineralischen Vorläufern entwi­ckelten sich nach und nach zwei alternative Wege der Lipidsynthese und ein genetischer Apparat, bis schließlich erste Zellen ohne anorganische Hülle entstanden. Somit wäre für die Entstehung von Leben keinerlei biologische Kompartimentierung als Ausgangs­voraussetzung notwendig gewesen, und ein genetischer Apparat wäre erst nach dem Metabolismus im FeS-Kompartiment entstanden [40]. Für die Hypothese gibt es einzelne geologische Belege. So wurden vor wenigen Jahren tatsächlich alkalische Hydrothermalquellen am Meeresboden entdeckt, die signi.kante Mengen an H2 und HS--Ionen beinhalten [41]. Zudem sind Strukturen, die Komparti­menten ähneln, aus fossilierten, vom Meeresboden stammenden Eisensul.dablagerungen bekannt [42]. Berichte von experimentellen Untersuchungen, die das vorgeschlagene Sze­nario unterstützen würden, fehlen indes völlig. Abb. 3: Mögliche Wege zur Herausbildung von zellulären Strukturen im Eisen-Schwefel-Welt-Szenario (aus [43]) Eisen-Schwefel-Welt-Hypothese Diese von G. Wächtershäuser entwickelte Hypothese postuliert, dass sich an der Ober­.äche von Eisensul.den ein erster so genannter „Pionier-Organismus“ entwickelte [44]. Dieser ist gekennzeichnet durch autokatalytische Kohlensto..xierungs-Zyklen, die zur Bildung einer organischen Überstruktur auf einer anorganischen, metallsul.dischen Sub­struktur führen [44]. Die reduktive Kraft für die Bildung und den weiteren Aufbau von niedermolekularen organischen Molekülen mittels CO2-Fixierung liefert die oxidative Pyritbildung (s. Reaktion 1) unter katalytischer Wirkung von anwesenden Übergangs­metallverbindungen [45]. FeS + H2S -. FeS2 +H2 ; .G = -38 KJ/mol (1) Die durch Reduktion von CO2 gebildeten, negativ geladenen organischen Moleküle wer­den in statu nascendi an die gebildete Pyritober.äche gebunden, verweilen dort je nach Bindungsstärke und können in weiteren Reaktionen zum Aufbau von komplexe­ren, höhermolekularen Verbindungen beitragen [45]. Es bildet sich nach und nach ein Ober.ächen-Reaktionsnetzwerk heraus, welches auch zur Bildung von einfachen Lipiden führt [45]. Eine hinreichende Anreicherung von Lipiden an der Pyrit-Ober.äche kann schließlich zur Ausbildung von semi-zellulären oder zellulären Strukturen führen, die potenzielle Vorläufer erster Zellen sind (s. Abb. 3). Experimentelle Untersuchungen zur Synthese von zumindest kurzkettigen Lipiden durch das FeS/H2S-System wurden unlängst verö.entlicht. Es konnten kurzkettige a-Amino­ 1.2 Hypothesen zur Chemischen Evolution und der Entwicklung ersten Lebens und a-Hydroxycarbonsäuren mit einer Kettenlänge von bis zu fünf Kohlensto.atomen durch die Umsetzung von Cyanid, CO und Methylthiolat im alkalischen unter plausi­blen geologischen Bedingungen in Gegenwart des FeS/H2S-Systems erzeugt werden [46]. Gleichwohl ist über Untersuchungen zur Verkapselung von FeS-bzw. FeS2-Partikeln in biologischen Kompartimenten wie Vesikeln bislang nichts bekannt. Solche Untersuchun­gen sind vonnöten, um die Funktionalität des energieliefernden FeS/H2S-Systems auch unter kompartimentierten Bedingungen, wie in Abb. 3b dargestellt, zu veri.zieren. Die postulierte Reduktionskraft des FeS/H2S-Systems im makroskopischen Maßstab konnte schon in mehreren Untersuchungen nachgewiesen werden. So entstanden bei der Reaktion von FeS/H2S mit CO2 Methylmercaptan (CH3SH), Schwefelkohlensto. (CS2), COS und kurzkettige Thiole [47]. Zudem konnte gezeigt werden, dass sich aus CO und Methylmercaptan (CH3SH) in der Gegenwart des gemischten Sul.ds (Ni,Fe)S Essigsäure bilden kann [48]. (Ni,Fe)S kann somit als funktioneller Vorläufer des aktiven Zentrums der Acetyl-CoA-Synthase angesehen werden, die eine ähnliche Funktionalität bezüglich der Kohlensto..xierung aufweist [48]. Weitere Untersuchungen belegen die reduzieren­denEigenschaften desFeS/H2S-Systems unterplausiblengeologischenBedingungen, wo­bei insbesondere der Nachweis der Reduktion des reaktionsträgen Sticksto. N2 zu NH3 bemerkenswert ist [49]. Die wenigen bislang vorliegenden Berichte zur reduzierenden Wirkung des FeS/H2S-Systems [47–52] sind nur beispielhaft, so dass es weiterer Unter­suchungen an anderen Modellverbindungen bedarf. 1.3 Zielstellungen Die Motivation für diese Arbeit liegt in der experimentellen Veri.zierung der Redukti­onskraft des FeS/H2S-Systems als Energiequelle in der Eisen-Schwefel-Welt-Hypothese. Zudem sollen, vom kompartimentierten Eisensul.d ausgehend, neuartige Systeme von kompartimentierten Metallsul.den generiert und charakterisiert werden. In einem ersten Teil der Arbeit soll eine Methode etabliert werden, die Zugang zu intra­vesikulärem Eisensul.d (FeS) ermöglicht. Solche Vesikel stellen einen ersten Schritt zu Modellen von möglichen Protozellen mit einem kompartimentierten, energieliefernden System FeS/H2S dar (s. Abb. 4), wie er in der Eisen-Schwefel-Welt-Hypothese postu­liert wird [45]. Es soll geklärt werden, ob auch das kompartimentierte FeS/H2S-System noch reduktive Eigenschaften aufweist. Bei einem positiven Resultat könnte eine zentra­le Annahme der Eisen-Schwefel-Welt-Hypothese experimentell unterstützt werden, was die Plausibilität der Hypothese unterstützen würde. Die Untersuchungen sollen nicht die Bildung von amphiphilen Molekülen durch das FeS/H2S-System zum Gegenstand haben. Vielmehr soll FeS im Inneren von Vesikeln unter inerten Bedingungen generiert und die erhaltenen Vesikel auf ihre zeitliche und thermische Stabilität sowie Reaktivität hin untersucht werden. Dazu sollten verschiedene vesikelbildende Substanzklassen so­wie bekannte Methoden zur Herstellung von Vesikeln hinsichtlich ihrer Eignung getestet werden. Abb. 4: Prinzip eines kompartimentierten Pionier-Metabolismus (aus [53]) 1.3 Zielstellungen Des Weiteren soll die Reduktionskraft des FeS/H2S-Systems an der Modellsubstanz Di­methylsulfoxid (DMSO) untersucht werden. Die Ergebnisse können zur Erweiterung des Verständnisses der reduzierenden Wirkung des FeS/H2S-Systems führen. Es ist zudem zu klären, ob sich das FeS/H2S-System als einfaches Modell für das Enzym DMSO-Reduktase, das formal wie eine Oxotransferase wirkt, eignet. Dazu ist eine Methodik für die Durchführung der Reaktion unter inerten Bedingungen und eine zuverlässige Analy­tik zu entwickeln. Das zu erwartende Reduktionsprodukt Dimethylsul.d besitzt sowohl biologische als auch klimatische Relevanz insbesondere in der marinen Umgebung [54]. Aufbauend auf den Erfahrungen zur Herstellung von FeS-haltigen Vesikeln sollen in ver­gleichendenUntersuchungenebenfallsandere,nichtoxidationsemp.ndlicheMetallsul.de wie NiS und CdS in Vesikeln eingeschlossen werden. Diese vergleichenden Untersuchun­gen können dazu beitragen, den Prozess der intravesikulären Generierung von Metall­sul.den näher zu beleuchten. Zudem ist es das Anliegen, Magnetit-haltige Vesikel mit neuen Methoden und vesikelbil­denden Substanzklassen herzustellen und zu charakterisieren. Dabei kann auf die Ergeb­nisse der Experimente zu kompartimentierten Metallsul.den zurückgegri.en werden. Es soll eruiert werden, ob und unter welchen Bedingungen die neuartigen Magnetit-haltigen Vesikel magnetophoretische Eigenschaften aufweisen, die für potenzielle medizinische Anwendungen wie z.B. als Anti-Tumor-Agens (s. Kapitel 1.1.2) interessant sind. Für die geplanten Untersuchungen sind begleitend synthetische Zugänge zu FeS-, NiS­und Fe3O4-NP zu entwickeln. Die erhaltenen NP können zum einen auf ihre Eignung für den Einschluss in Vesikeln getestet werden. Zum anderen können sie, im Fall von FeS, vergleichend zum amorph hergestellten Metallsul.d charakterisiert werden. 2 Eisenhaltige Phospholipidvesikel (Liposomen) 2.1 Vorbemerkungen Für das Einschließen von Eisenchalkogeniden in Vesikeln galt es zunächst, geeignete amphiphile Moleküle zu .nden. Dabei mussten mögliche Wechselwirkungen der mem­brankonstituierenden Moleküle mit sowohl Fe2+-bzw. Fe3+-Ionen als auch mit den er­wünschten Zielverbindungen FeS und Fe3O4 berücksichtigt werden. Die hohe Oxidati­onsemp.ndlichkeit von wässrigen Fe2+-Lösungen und wässrigen FeS-Suspensionen erfor­derte zudem die Durchführung aller Präparationsschritte unter anaeroben Bedingungen. Als erstes wurden Vesikel aus POPC auf ihre Eignung zum Einschluss von Eisenchal­kogeniden hin untersucht. POPC und andere Phospholipide kamen bereits in vielen Untersuchungen zu Zellmodellen (s. Kapitel 1.1.4) zum Einsatz, z.B. in verschiedenen Ansätzen zur Modellierung einer so genannten „Minimalzelle“ [2]. Zudem sind Zugänge zur Herstellung von intravesikulären Metallchalkogeniden in Phospholipid-Vesikeln be­kannt [18,21,55,56]. Für den Einschluss von Eisenchalkogeniden in Vesikeln gibt es mehrere denkbare Her­angehensweisen. Die naheliegendste Variante ist der Einschluss von zuvor hergestellten stabilisierten Eisenchalkogenid-NP. Zum Einschluss von Eisenoxid-NP in Phospholipid-Vesikeln existieren bereits Arbeiten [14,57,58]. Diese Methode ist prinzipiell auch auf andere Metalloxid-NP, z.B. TiO2 [24], übertragbar. Zum Einschluss von Metallsul.d-NP mit dieser Methode sind bisher keine Arbeiten bekannt. Die Bildung von kompartimentierten Schwermetallsul.den kann auf andere Weise erfol­gen. Kationen di.undieren nur sehr langsam durch Doppellipidschichten, während ins­besondere ungeladene Spezies wie H2O, aber auch Anionen die Vesikelmembran deutlich schneller durchdringen können [59]. Diese Tatsache ausnutzend werden Metallionen im Inneren von Vesikeln eingeschlossen und die erhaltene Vesikeldispersion zur Abtrennung von externen Metallionen mittels Gelpermeationschromatographie (GPC) oder Dialyse aufgereinigt. Schließlich wird die erhaltene Vesikeldispersion mit einem geeigneten Fäl­lungsreagenz (meist H2S oder OH- für die Erzeugung von Metallsul.den und -oxiden) inkubiert. Mit dieser Methode ist es möglich, kompartimentierte Metallsul.de wie CdS und PbS [18,21] und Eisenoxide, meist Magnetit Fe3O4, [56,60,61] zu generieren. Für die Herstellung von Liposomen mit Eisensul.d wurde auf das Prinzip der für Schwerme­tallsul.de bekannten Methode (s. Abb. 5) zurückgegri.en. 2.2 Einschluss von Fe2+-Ionen in Liposomen Abb. 5: Prinzip der Herstellung von FeS-haltigen Liposomen aus aufgereinigten, Fe2+-haltigen Liposomen (aus [62]) Auf alternative Varianten zur Präparation intravesikulärer Metallsul.de wird im Kapi­tel 3.4 eingegangen. 2.2 Einschluss von Fe2+-Ionen in Liposomen 2.2.1 Vorüberlegungen Für die Herstellung von FeS-haltigen Liposomen galt es zunächst, eine möglichst hohe Konzentration an Fe2+-Ionen in Liposomen einzuschließen, um nachweisbare Mengen an intravesikulärem FeS zu erzeugen. Der 100%-ige Einschluss einer 100 mM Fe2+-Lösung in einem Vesikel mit einem Durchmesser von 30 nm bedeutet, dass sich durchschnittlich insgesamt nur ca. 2000 Fe2+-Ionen in einem Vesikel be.nden [59]. Die daraus gebildeten Eisensul.d-bzw. Eisenoxid-Partikel hätten selbst unter idealen Bedingungen bei Ein­schluss und Ausfällung eine Größe von maximal 2 -3 nm. Außerdem musste für die einzuschließenden Fe2+-Ionen ein schwacher Ligand gefunden werden, der • Fe2+-Ionen auch bei pH-Werten bis 7,4 stabilisiert, • gleichzeitig die Bildung von Fe(OH)2 verhindert, • mögliche Wechselwirkungen von freien Fe2+-Ionen mit der zwitterionischen Kopf­gruppe von POPC minimiert und • die annähernd quantitative Ausfällung von FeS aus dem gebildeten Komplex er­laubt. Für eine quantitative Ausfällung von kompartimentiertem FeS ist es unabdingbar, bei pH > 5 zu arbeiten, da FeS makroskopisch erst ab pH 4 (bei gesättigter H2S-Lösung) ausgefällt werden kann [63]. Für die Ausfällung von FeS in Vesikeln dürfte die er­reichbare intravesikuläre H2S-Konzentration deutlich unter der Sättigungskonzentration von ca. 100 mM liegen. Somit kann FeS nur durch einen höheren intravesikulären pH-Wert als pH 4 ausgefällt werden. Die obere Grenze für den verwendeten pH-Wert wird durch die Bildung von Fe(OH)2 bestimmt. Aufgrund des geringen Löslichkeitsprodukts mol3 (KL = 4,9·10-17 l3 ) fällt Fe(OH)2 aus einer 50 mM Lösung eines Fe2+-Salzes bereits ab pH 6,5 aus. Durch Komplexbildung kann diese pH-Grenze allerdings zu höheren pH-Werten verschoben werden. Enorm wichtig in diesem Zusammenhang ist eine Arbeitsweise unter Sauersto.aus­schluss,dadieAnwesenheitvoneventuellgebildetenFe3+-IonenbeidiesempH-Werteine Fällung von Fe(OH)3 bedingen würde. Zudem ist bekannt, dass Fe3+-Ionen in erheblich größerem Ausmaß die Struktur von Phospholipid-Membranen stören als Fe2+-Ionen [64]. Ein geeigneter Ligand sollte mit Fe2+-Ionen einen mäßig stabilen Komplex bilden, der eine Abschirmung der Fe2+-Ionen gegenüber der zwitterionischen Kopfgruppe des POPC bewirken sollte. Eine solche elektrostatische Abschirmung der Fe2+-Ionen kann zudem dieEinschlusse.zienzdeutlicherhöhen[65].AusdemvomLigandengebildetenKomplex muss jedoch FeS ausfällbar sein, so dass starke Komplexbildner wie 1,10-Phenanthrolin und Cyanid nicht infrage kamen. Um möglichen Wechselwirkungen mit bzw. Einlage­rungen in der Vesikelmembran vorzubeugen, wurden auch keine ausgeprägt lipophilen Liganden getestet. Die notwendige anaerobe Arbeitsweise verringerte die Anzahl geeigneter Methoden für dieHerstellungFe2+-haltigerLiposomen.SokonntendieinderLiteraturfürgenaudiesen Zweck beschriebenen Techniken für Pro-Liposomen und Mikro.uidisation [66] nicht an­gewendet werden. Die an anderer Stelle [65] ebenfalls erwähnten Methoden der Reverse­Phase-Evaporation (RVE) sowie Film-Hydratisierung-Extrusion (FHE) zur Herstellung von Fe2+-haltigen Liposomen wurden in modi.zierter Form angewendet. 2.2.2 Untersuchungen zur Stabilisierung von Fe2+-Ionen durch Komplexierung Auf der Suche nach einem geeigneten Liganden für Fe2+-Ionen im Wässrigen wurden verschiedene aromatische und aliphatische sticksto.haltige Verbindungen hinsichtlich ihrer Komplexbildungseigenschaften getestet. Es zeigte sich, dass mit der Pyrazin-2,3­ 2.2 Einschluss von Fe2+-Ionen in Liposomen dicarbonsäure (PDC) ein Ligand vorliegt, der zusammen mit Fe2+-Ionen in verschiede­nen Mischungsverhältnissen einen intensiv roten Komplex mit einem Absorptionsma­ximum bei .max = 475 nm bildet (s. Abb. 6a) [67,68]. Aus den tiefroten Lösungen scheidet sich ein kristalliner Feststo. mit einer 1:1-Stöchiometrie ab [67,69], was durch Röntgen-Einkristalluntersuchungen bestätigt wurde [70]. Gleichwohl beschreiben Sanyal et al. [68], dass im Wässrigen im pH-Bereich von 5 -6,5 Fe2+-Ionen und PDC selektiv einKomplexanionderZusammensetzungFe2(PDC)32- bilden.DieSelektivität derKom­plexbildung ist so hoch, dass man das Fe2(PDC)32--Komplexanion unter Verwendung eines mindestens 10-fachen Überschusses an PDC zur quantitativen Eisenbestimmung heranziehen kann [68]. Das Komplexanion ist wahrscheinlich doppelt negativ geladen, da die pKa-Werte von PDC bei pKa1 = 1,5 und pKa2 = 3,25 liegen [71], und somit bei pH 5,5 beide Carboxylgruppen deprotoniert vorliegen. Allerdings wird in der Literatur am Beispiel des Oxovanadium(IV)-Kations (VO2+) über das pH-abhängige Vorliegen von in diesem Fall (VO2+-PDC)-Spezies unterschiedlicher Stöchiometrie (1:1 bzw. 1:2) in eben diesem pH-Bereich berichtet [71]. Um zu klären, ob sich im gesamten relevanten pH-Bereich von 5 -7,4 selektiv ein einheitlicher Fe2+­PDC-Komplex oder ein Gemisch von Komplexen unterschiedlicher Stöchiometrie bildet, wurden mehrere Untersuchungen zur spektrophotometrischen Bestimmung der Kom­plexzusammensetzung durchgeführt. Dazu wurde zunächst das Verhalten bei pH 7,4 untersucht, da Fe2+-Ionen bei diesem pH-Wert in Liposomen eingeschlossen werden soll­ten. Als erstes erfolgte eine Untersuchung mit der Methode der kontinuierlichen Variation nach Job und Ostromisslenski [72]. Voraussetzung zum Anwenden dieser Methode ist, dassMetallundLigand selektivnureinen Komplexde.nierterZusammensetzung bilden, der Licht einer bestimmten Wellenlänge absorbiert. Konkret werden Lösungen gleicher Konzentration von Ligand cL und Metall cM hergestellt und in verschiedenen Verhält­nissen so gemischt, dass das Gesamtvolumen und die -konzentration stets gleich sind (c0 = cL + cM = const.). Die Gleichgewichtskonzentration und damit die Absorption des Komplexes ist somit bei dem Mischungsverhältnis am größten, das genau der Kom­plexzusammensetzung entspricht. Es wurden fünf Fe2+-PDC-Lösungen in verschiedenen Mischungsverhältnissen bei kon­stanter Gesamtkonzentration von 2 mM in Tris(hydroxymethyl)-aminomethan-Pu.er, dermitHClaufpH7,4eingestelltwurde(TRIS-HCl-Pu.er),hergestelltunddiejeweilige Abb. 6: (a) Absorptionsspektren einer 0,8 mM Fe2(PDC)32--(rot) und einer 1 mM Fe2+­PDC-Lösung (schwarz) in TRIS-HCl-Pu.er (pH 7,4) und (b) graphische Ermittlung der Fe2+-PDC-Komplexzusammensetzung in TRIS-HCl-Pu.er nach der Methode der kontinuierlichen Variation; cL -Ligandenkonzentration und c0 -Summe der Konzen­trationen von Ligand und Fe2+-Ionen Absorptionbei .max =475nmbestimmt(s.S.159).DieaufgetragenenWerte(s.Abb.6b) können nun zur graphischen Bestimmung des Maximums (aus dem Schnittpunkt zweier Geraden ober-und unterhalb des Maximums) herangezogen werden. Hierbei wurde ein Wert von cL/c0 ˜ 0,59 erhalten, der auf eine Fe2+-PDC-Komplexzusammensetzung von 2:3 hinweist. Dies ist in guter Übereinstimmung mit der von Sanyal et al. [68] beschrie­benen Komplexzusammensetzung. Zur Veri.zerung dieses Ergebnisses erfolgte eine zusätzliche Untersuchung der Kom­plexzusammensetzung mit der Methode der molaren Verhältnisse [72]. Dabei wird die Konzentration eines der komplexbildenden Komponenten (hier des Metallions) konstant gehalten, während die Konzentration des Liganden sukzessive erhöht wird. Bilden die Metallionen tatsächlich quantitativ einen de.nierten Komplex mit dem Liganden, soll­te bei kontinuierlicher Vergrößerung der Ligandenkonzentration ab einem bestimmten Konzentrationsverhältnis cL/cM ein Plateau in der Absorption erreicht werden. Eine weitere Zugabe von Ligand darüber hinaus bliebe ohne E.ekt, da bereits alle Metallio­nen vollständig komplexiert vorliegen. Es wurden erneut geeignete Lösungen in TRIS-HCl-Pu.er hergestellt und UV/Vis­spektroskopisch vermessen (s.S. 159). Dabei zeigte sich, dass die Absorption der erhalte­nen Fe2+-PDC-Lösungen bei steigender PDC-Konzentration kontinuierlich anstieg, auch weit über den vermuteten Wert von cL/cM = 1,5 in einem Fe2(PDC)32--Komplexanion 2.2 Einschluss von Fe2+-Ionen in Liposomen Abb. 7: links (a): Versuch der Ermittlung der Fe2+-PDC-Komplexzusammensetzung in TRIS­ HCl-Pu.er mit der Methode der molaren Verhältnisse und rechts (b): Absorption verschiedener Fe2+-PDC-Mischungen bei c(Fe2+) = 0,2 mM = const. hinaus. Zur genaueren Untersuchung wurden in einem weiteren Experiment Fe2+-PDC-Lösungen mit einem bei zu dreizehnfachen Überschuss an PDC UV/Vis-spektroskopisch vermessen (s. Abb. 7a). Eine Wiederholung dieses Experimentes in Acetatpu.er pH 5 ergab ein vergleichbares Ergebnis wie in TRIS-HCl-Pu.er. Zudem zeigte sich, dass sich das Maximum der Absorptionsbanden bei größeren PDC-Konzentrationen von zunächst .max = 475 nm bathochrom bis .max = 485 nm verschiebt (Abb. 7b). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass bei pH 7,4 nicht nur ein Fe2+-PDC-Komplex mit de.nierter Zu­sammensetzung sondern noch mindestens eine weitere Spezies existiert, die eine andere Zusammensetzung und ein anderes Absorptionsmaximum aufweisen muss. Somit kann das in der Literatur [68] beschriebene Fe2(PDC)32--Komplexanion in TRIS-HCl-Pu.er nicht die einzige vorliegende Komplexspezies sein. In Abbildung 7a ist deutlich zu er­kennen, dass die Kurve einem Grenzwert zustrebt, diesen allerdings selbst bei einem zehnfachen Überschuss an PDC nicht erreicht. Denkbar ist auch das Vorliegen eines Komplexbildungs-Gleichgewichts bei pH 7,4, das erst bei einem sehr großen Überschuss von PDC vollständig auf der Seite eines Komplexes de.nierter Zusammensetzung liegt. In der Literatur .nden sich indes keine Angaben zu einer Komplexbildungskonstante. Auch bei Sanyal et al. wird ohne genauere Begründung ein zehnfacher Überschuss an PDC zur Eisenquanti.zierung verwendet [68]. Allerdings weisen die Ergebnisse bei pH 7,4 darauf hin, dass selbst ein so großer Überschuss an PDC nicht ausreicht, um Fe2+­Ionen vollständig zu komplexieren. Da mit den Untersuchungen zur Komplexzusammensetzung kein eindeutiges Ergebnis Abb. 8: E.ekt von EDTA und H2S auf Fe2+-PDC-Komplex-Lösungen: Fe2+-PDC-Komplex 6 mM in TRIS-HCl-Pu.er ohne Zusätze (links), nach der Zugabe einer äquimolaren Menge an EDTA (Mitte) und nach Inkubation mit gasförmigem H2S (rechts) erzielt werden konnte, wurde mit einem Verhältnis von Fe2+:PDC = 1:2 gearbeitet, um die Bildung von kristallinem Fe2+(PDC) sicher durch einen Überschuss des Li­ganden zu unterdrücken und um die Komplexierung eines möglichst hohen Anteils an Fe2+-Ionen zu gewährleisten. Noch höhere Konzentrationen an PDC wurden nicht ver­wendet, da sich eine hohe Ionenstärke ungünstig auf die Einschlusse.zienz auswirken kann[65].LösungenmiteinemKonzentrationsverhältnisvonFe2+:PDC=1:2(fortanmit Fe2+-PDC-Komplex bezeichnet) in TRIS-HCl-Pu.er zeigten bis zu einer Konzentration von 60 mM keinerlei Fe(OH)2-Niederschlag. In allen Experimenten mit dem Fe2+-PDC-Komplex wurde eine maximale Fe2+-Konzentration von 60 mM eingesetzt, da oberhalb dieser Konzentration die Bildung von roten Nadeln (kristallines Fe2+(PDC)) beobachtet wurde. Die Inkubation von Lösungen des Fe2+-PDC-Komplexes in TRIS-HCl-Pu.er im Konzentrationsbereich von 60 mM bis unter 0,5 mM mit H2S führte zur Bildung eines dunklen FeS-Niederschlags, der belegt, dass sich aus dem Komplexgemisch FeS ausfällen lässt (s. Abb. 8). Versetzt man Lösungen des Fe2+-PDC-Komplexes hingegen mit ei­ner äquimolaren Menge an EDTA (Dinatriumsalz der Ethylendiamintetraessigsäure), so wird unter gleichen Bedingungen die FeS-Fällung durch Chelatisierung der Eisenionen verhindert (s. Abb. 8, Mitte). 2.2.3 Experimente zur Herstellung Fe2+-haltiger Liposomen Fe2+-PDC-Komplex-Lösungen wurden mittels zweier verschiedener Ansätze, der so ge­nanntenReverse-Phase-Evaporation-undderFilm-Hydratisierungs-Extrusions-Methode in POPC-Liposomen mit einer Lipidkonzentration von 10 mM eingeschlossen. Mittels Photonenkorrelationsspektroskopie (PCS) kann der mittlere hydrodynamische Radius der Liposomen in einer Vesikeldispersion bestimmt werden. Der zudem bestimmbare 2.2 Einschluss von Fe2+-Ionen in Liposomen Polydispersitätsindex (PDI) ist ein ungefähres Maß für die Verteilungsbreite der Vesi­kelgrößen und hat einen Wert zwischen 0, für einheitlich monodisperse Partikel, und 1 für polydisperse Partikel. Durch die Extrusion von Vesikeldispersionen können POPC-Liposomen mit einem PDI von unter 0,1, d.h. mit einer sehr engen Verteilungsbreite der Vesikelgrößen, hergestellt werden. Ergänzend sollten elektronenmikroskopische Untersuchungen, z.B. Cryo-Transmissions-Elektronenmikroskopie (Cryo-TEM) zur Analyse der Morphologie der Vesikel, zur Veri­.zierung der PCS-Daten und zur Detektion von möglichen eisenhaltigen Niederschlägen erfolgen.InsbesonderedieCryo-TEMbietetdieMöglichkeit,Vesikelnahezuinihrernati­venFormwieinLösungabzubilden.DazumüssendieProbenraschdurchdasEintauchen in .üssiges Ethan auf ca. -190.C abgekühlt und dann auch bei diesen Temperaturen im Elektronenmikroskop untersucht werden, um die Eisbildung in der Probe zu verhindern. Zudem musste zur Veri.zierung der Einschlusse.zienz der verschiedenen Methoden und Herstellungsbedingungen eine Methode zur Quanti.zierung von intravesikulärem Eisen entwickelt werden. Die Verwendung von Eppendorf-Mikroreaktionsgefäßen unter Argon-Atmosphäre bzw. in einem glove bag (deutlich reduzierte O2-Konzentration im Vergleich zum Arbeiten an Luft) ermöglichten es, unter nahezu inerten Bedingungen mit sehr kleinen Volumina von maximal 1000 µl pro Ansatz zu arbeiten. 2.2.4 Quanti.zierung von intravesikulärem Eisen Es musste zunächst eine geeignete Methode entwickelt werden, die hinreichend emp­.ndlich für die zuverlässige Bestimmung der geringen Mengen an intravesikulärem Ei­sen ist. Als Reagenz für eine spektrophotometrische Bestimmung von Fe2+-Ionen ist 1,10-Phenanthrolin (phen) geeignet, welches mit Fe2+-Ionen im Bereich von pH 2 -9 das stabile Komplexion Fe(phen)32+ bildet. Dieses weist im Absorptionsmaximum von .max = 508 nm einen Extinktionskoe.zienten von . = 11100 l auf. mol·cm Um nun den Fe2+-Gehalt in aufgereinigten, Fe2+-haltigen Liposomen bestimmen zu kön­nen, müssen die eingeschlossenen Fe2+-Ionen zunächst freigesetzt werden. Ein Standard­reagenz zum Au.ösen von Liposomen ist das sogenannte TRITON X 100 (Struktur s. Abb. 9), ein Detergenz, das mit Phospholipiden Micellen bildet. Nach dem Zusatz eines Überschusses an TRITON X 100 zu der Liposomendispersion kann der Gehalt der in der micellären Lösung zugänglichen Fe2+-Ionen bestimmt werden. Ein ähnliches Abb. 9: Struktur von TRITON X 100 Vorgehen lässt sich auch in einer Publikation zur Eisenbestimmung in Fe3O4-haltigen Li­posomen .nden [14]. Bei dieser Methode wird zudem noch Hydroxylamin-Hydrochlorid alsReduktionsmittelzumUnterdrückenderOxidationvonFe2+-Ionenzugesetzt.Dasich bei der UV/Vis-spektroskopischen Untersuchung das Vorliegen der Micellen aus POPC und TRITON X 100 als störend erwies, kam die Standard-Additions-Methode (zur Be­stimmung von Analyten in Proben mit stark störender Matrix) zum Einsatz (s.S. 162). 2.2.5 Fe2+-haltige Liposomen mittels Reverse-Phase-Evaporation (RVE) Prinzip der RVE-Methode MitderRVE-Methodeistesmöglich,unterbestimmtenBedingungen(geeigneteLipidzu­sammensetzung, niedrige Ionenstärke) wasserlösliche Substanzen mit vergleichsweise ho­her E.zienz von bis zu über 50 % im Inneren von Liposomen einzuschließen [65,73]. Zu­nächst wird dabei das Phospholipid in einem organischen Lösungsmittelgemisch (meist Diethylether mit CHCl3 bzw. CH2Cl2 zur Erhöhung der Löslichkeit) gelöst und an­schließend mit einer wässrigen Pu.erlösung mit der einzuschließenden, wasserlöslichen Substanz versetzt. Nach intensivem Mischen wird eine opaleszierende Emulsion erhal­ten, aus der das organische Lösungsmittelgemisch nun langsam abdestilliert wird, bis sich schließlich ein viskoses Gel bildet. Dieses kann durch intensives Schütteln gebrochen werden, wobei sich eine Liposomendispersion bildet. Die hohe Einschlusse.zienz der Methode rührt daher, dass in der erzeugten Wasser-in-Öl-Emulsion die wässrigen Tröpf­chen im Innern von inversen Micellen schon durch die Phospholipide „vorkoordiniert“ vorliegen (Abb. 10a) [73]. Beim Kollaps des erzeugten Gels setzt ein Teil der inversen Micellen die eingeschlossene Lösung frei. Die dabei freigesetzten Lipidmoleküle tragen zur Ausbildung von vollständigen Doppelschichten um die noch vorhandenen inversen Micellen bei [73]. Inverse Micellen werden somit in Vesikel umgewandelt (s. Abb. 10c,d). 2.2 Einschluss von Fe2+-Ionen in Liposomen Durchführung Aus der unter inerten Bedingungen präparierten Emulsion wurde am mit Argon gespül­ten Rotationsverdampfer das organische Lösungsmittelgemisch bei vermindertem Druck entfernt. Das erhaltene Gel konnte durch intensive Behandlung mittels Vortexer gebro­chen werden, wobei sich eine Vesikeldispersion bildete (s. S. 160). PCS-Untersuchungen ergaben, dass in der erhaltenen Dispersion die Vesikelgrößen eine große Verteilungsbrei­te aufwiesen. Für die Studien zur Einschlusse.zienz wurde in einigen Experimenten die erhaltene Liposomendispersion extrudiert, um eine einheitliche Liposomen-Größe mit einer engen Verteilungsbreite zu gewährleisten. Zur Aufreinigung wurde üblicherweise eine Dialyse durchgeführt, um die Liposomendispersion nicht zu verdünnen. Die erhal­tenen Liposomendispersionen wurden mittels PCS charakterisiert sowie der Eisengehalt mit einer spektrophotometrischen Methode unter Verwendung von 1,10-Phenanthrolin bestimmt (s.S. 162). Eigenschaften von Fe2+-haltigen RVE-Liposomen Die mittels RVE-Methode hergestellten Liposomendispersionen wiesen schon nach ei­nem Tag größere Aggregate auf, die sich allerdings wieder redispergieren ließen. PCS-Untersuchungen zeigten, dass sich in einem typischen RVE-Ansatz Liposomen mit einer mittleren Größe von 200 -300 nm sowie einem PDI von 0,3 -0,5 bildeten. Solch große VerteilungsbreitenderVesikelgrößenkönnensichnachteiligaufdieStabilitätvonLiposo­mendispersionenauswirken,dadadurcheinegroßeVariationinderOber.ächenspannung der einzelnen Vesikel gegeben ist, was die Fusions-bzw. Aggregationstendenz fördert. In extrudierten, monodispersen Liposomenpopulationen hingegen weisen die einzelnen Vesikel nur geringe Unterschiede hinsichtlich der Ober.ächenspannung auf, was die Fu­sionsneigung deutlich verringert. Cryo-TEM-Untersuchungen von an Luft mehrere Tage gelagerten, Fe2+-haltigen RVE-Liposomen (s. Kapitel 2.4.2) zeigten, dass sich überwiegend unilamellare Vesikel mit Größen von 50 -400 nm gebildet hatten. Der Anteil oligolamellarer Vesikel betrug le­diglich ca. 10 %. Au.ällig war die große Verteilungsbreite der Vesikelgrößen, was in Übereinstimmung mit den PCS-Daten ist und auf die in diesem Fall nicht erfolgte Ex­trusion zurückgeführt werden kann. Einschlusse.zienz von Fe2+-haltigen RVE-Liposomen Die Einschlusse.zienz kann mittels verschiedener Ansätze ermittelt werden. Zum einen kann eine theoretische Einschlusse.zienz (EE) direkt unter Verwendung der Lipidkon­zentration und des hydrodynamischen Durchmessers sowie der Packungsparameter des POPC berechnet werden [74]. Allerdings bildet diese theoretische EE nur den Anteil des im Inneren von Vesikeln eingeschlossenen Volumens am Gesamtvolumen der Vesi­keldispersion ab. Somit entspricht die theoretische Einschlusse.zienz nur dann der tat­sächlichen EE, wenn die eingeschlossene Substanz wie z.B. Glucose nicht mit der Lipid­membranwechselwirkt [75]. Für Substanzen wieK3[Fe(CN)6],diemitderLipidmembran wechselwirken, kann die tatsächliche EE von der theoretisch berechneten abweichen [75]. In diesem Fall muss zusätzlich zur Berechnung des eingeschlossenen (internen) Volumens der Gesamtgehalt der eingeschlossenen Substanz nach der Aufreinigung ermittelt wer­den. Da für Fe2+-und Fe3+-Ionen bekannt ist, dass sie aufgrund von Wechselwirkungen mit Phospholipidmembranen deren Packungsstruktur verändern [64], musste hier die modi.zierte Variante zur Bestimmung der EE verwendet werden. Zunächst kann das interne Volumen Vintern schrittweise aus den erforderlichen Parame­ternZ-Average,derdenmittlerenhydrodynamischenDurchmesser derVesikelpopulation angibt, sowie den Packungsparametern des POPC in der Liposomenmembran, d.h. die Länge des POPC-Moleküls und die Fläche der Kopfgruppe, berechnet werden. Im An­hang (Seite 182) ist eine Tabelle zur Berechnung des internen Volumens in Abhängigkeit vom Vesikeldurchmesser aufgeführt. Zur Ermittlung der tatsächlichen EE von Fe2+-Ionen in RVE-Liposomen unter verschie­denen Bedingungen wurde von den hergestellten Liposomendispersionen nach der Auf­reinigung spektrophotometrisch der Fe2+-Gehalt cdisp(Fe2+) sowie in PCS-Messungen die mittlere Vesikelgröße (Z-Average) bestimmt. Mithilfe des Z-Average kann das in­terne Volumen Vintern ermittelt werden (s. Seite 182). Schließlich wird unter Verwen­ 2.2 Einschluss von Fe2+-Ionen in Liposomen Tab. 1: Einschlusse.zienz (EE = cintern(Fe2+) ) verschiedener Ansätze der RVE-Methode in c0(Fe2+) Abhängigkeit von pH-Wert und mittlerer Vesikelgröße (Z-Average) für dialysier­te 10 mM POPC-Liposomendispersionen in 100 mM TRIS-HCl bzw. Acetatpu.er; c0(Fe2+) -Fe2+-Startkonzentration; V intern -internes Volumen; cdisp(Fe2+) -Fe2+­Konzentration in der Liposomendispersion und cintern(Fe2+) -intravesikuläre Fe2+­Konzentration pH c0(Fe2+) (mM) Z-Average (nm) Vintern (µl) cdisp(Fe2+) (mM) cintern(Fe2+) (mM) Einschluss­e.zienz (%) 7,4 60 148,2 36,7 2,53 52,4 87,3 7,4 60 173,0 43,5 2,39 41,8 69,6 7,4 30 206,4 52,7 0,97 13,9 46,5 5 30 157,0 39,1 1,07 20,8 69,4 5 30 180,7 45,6 1,65 27,5 91,7 dung des Gesamtvolumens der Dispersion Vdisp die mittlere interne Fe2+-Konzentration cintern(Fe2+) erhalten: Vdisp cintern(Fe2+)= · cdisp(Fe2+) Vintern Die tatsächliche EE gibt an, wie hoch die mittlere intravesikuläre Fe2+-Konzentration cintern(Fe2+) im Vergleich zur Fe2+-Startkonzentration c0(Fe2+) ist. Es wurde der Ein.uss verschiedener Faktoren auf die tatsächliche EE von Fe2+-Ionen in RVE-Liposomen untersucht (s. Tabelle 1). Hierbei sind in der Tabelle 1 nur Ansät­ze berücksichtigt, die vor der Aufreinigung extrudiert wurden, um eine de.nierte, enge Vesikelgrößenverteilung zu erzielen. Mit der RVE-Methode konnten generell sehr hohe Einschlusse.zienzen von meist deutlich über 50% erzielt werden. Dies ist in Überein­stimmung mit Literaturangaben [65,73]. Da nur mit einer maximal 60 mM Lösung des Fe2+-PDC-Komplexes gearbeitet werden kann, ist eine hohe EE im Hinblick auf die ge­plante Ausfällung von FeS eminent wichtig. Es ist erkennbar, dass sowohl die mittlere Vesikelgröße als auch der pH-Wert einen Ein­.uss auf die Einschlusse.zienz hat. Mit der RVE hergestellte unextrudierte Liposomen weisen mittlere Vesikelgrößen von 300 -400 nm mit einer großen Verteilungsbreite auf. Es ist bekannt, dass sich bei der RVE große sowohl uni-als auch oligolamellare Vesikel bilden [73]. Extrudiert man nun größere oligolamellare Vesikel, so bildet sich eine größere Anzahl kleiner, unilamellarer Vesikel. Dies ist eine mögliche Erklärung für die Zunahme der Einschlusse.zienz bei pH 7,4 mit kleiner werdendem Z-Average. Generell nimmt bei der Extrusion von großen unilamellaren Vesikeln die EE ab, da in den erzeugten kleinen unilamellaren Vesikeln bei gleicher Gesamtober.äche (Anzahl der POPC-Moleküle) ein kleineres Volumen eingeschlossen wird. Gleichwohl ist die Anzahl der Analysen zu ge­ring, um einen zufälligen Trend vor dem Hintergrund der moderaten Reproduzierbarkeit der RVE mit Sicherheit auszuschließen. In Vergleichsexperimenten wurde untersucht, inwiefern sich das Absenken des pH-Werts auf die Einschlussrate des Fe2+-PDC-Komplexes auswirkt. Dabei konnte nur mit ei­ner 30 mM Lösung des Fe2+-PDC-Komplexes gearbeitet werden, da sich bei höheren Konzentration kein Gel bildete. Es ist zu erkennen, dass in Acetat-gepu.erten Lösun­gen (pH = 5) höhere Einschlusse.zienzen als in TRIS-HCl-Pu.er realisierbar waren. Dies kann u.U. am Einsatz von Acetatpu.er liegen, da Acetat ein schwacher Ligand für Fe2+-Ionen ist. Der Einsatz eines schwach komplexierenden Pu.ers kann zur e.ektiveren Abschirmung von Fe2+-Ionen und zugleich zur Stabilisierung von POPC-Liposomen in deren Gegenwart führen [65]. Die RVE-Methode weist generell eine mäßige Reproduzierbarkeit aufgrund der schwer kontrollierbaren Gelbildung auf. Zudem zeigten die mit RVE hergestellten Liposomendi­spersionenschonnacheinemTagersteAggregationen.AlsVoraussetzungfürdieHerstel­lung stabiler FeS-haltiger Liposomen sollten auch die dafür notwendigen Fe2+-haltigen Liposomen stabil sein. Darum wurde ergänzend zu der RVE-Methode auch die Eignung der Filmhydratisierungs-Extrusionsmethode zur Herstellung stabiler Fe2+-haltiger Lipo­somen untersucht. 2.2.6 Fe2+-haltige Liposomen mittels Filmhydratisierung-Extrusion (FHE) Diese Standardmethode zur Herstellung von Liposomen wurde ebenfalls verwendet, da man die einzelnen Schritte der Herstellung und Aufreinigung von Liposomen prinzipiell unter inerten Bedingungen durchführen kann. Mit dieser Methode sind EE von bis zu 10%, also deutlich niedriger als mit der RVE, zu erwarten [8]. EineausführlicheBeschreibungderDurchführungistaufSeite159zu.nden.Diewichtig­sten Schritte beinhalten zunächst das Überführen einer de.nierten Menge einer POPC­StammlösunginCHCl3 ineinen100mlEinhalskolben.NachVerdünnenmitetwasCHCl3 wird dann das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer unter vermindertem Druck voll­ 2.2 Einschluss von Fe2+-Ionen in Liposomen Abb. 11: Verfolgung der zeitlichen Stabilität von mittels FHE hergestellten und mit­tels GPC aufgereinigten POPC-Liposomen mit Fe2+-PDC-Komplex mit PCS (Ergebnis-Ausdruck) zum Herstellungszeitpunkt (roter Graph; Z-Average: 97,0 nm mit PDI = 0,100) und nach 7 Tagen (grüner Graph; Z-Average: 97,7 nm mit PDI = 0,121); Abszisse: logarithmische Darstellung der mittleren Vesikelgröße (in nm) und Ordinate: Intensität (in %) ständigentfernt,biseindünnerFilmdesPhospholipidsanderKolbenwandzurückbleibt. Auf diesen Film wird eine Fe2+-Lösung gegeben und der Kolben intensiv geschüttelt, wo­bei sich Liposomen bilden. Die erzeugte Liposomendispersion weist dabei üblicherweise eine große Verteilungsbreite der Vesikelgrößen auf. Mittels Extrusion durch eine Poly­carbonat.ltermembran mit de.nierter Porengröße können unilamellare Liposomen mit einerfasteinheitlichenGröße (z.B.100nm)erzeugtwerden.MittelsPCSkannzudemdie zeitliche Veränderung des PDI der erhaltenen Dispersion als Indikator für die Stabilität der Liposomendispersion ermittelt werden (s. Abb. 11). Zur Abtrennung von extrave­sikulären Fe2+-Ionen muss noch eine Aufreinigung durch Dialyse oder GPC erfolgen. Hierbei wurde eine Dialyse bevorzugt, da so eine Verdünnung der Liposomendispersion vermieden werden kann. Eigenschaften von Fe2+-haltigen FHE-Liposomen Cryo-TEM-Aufnahmenvonextrudierten,Fe2+-haltigenLiposomenzeigen,dasssichüber­wiegend oligolamellare Vesikel, meist 2 Vesikel ineinander, sowie irreguläre Strukturen gebildet haben (s. Abb. 12). Zudem ist auf Abb. 12b zu erkennen, dass die Membra­nen einiger Vesikel nicht mehr sphärisch sind. Diese Membranstörungen könnten durch Wechselwirkungen zwischen dem eingesetzten Fe2+-PDC-Komplex und der zwitterioni­schen Kopfgruppe des POPC verursacht sein. Dennoch zeigten PCS-Studien von extrudierten, Fe2+-haltigen Liposomendispersionen, dass solche Dispersionen mehr als 7 Tage ohne nennenswerte Veränderung (Aggregatio­nen) stabil sind (s. Abb. 11). Auch visuell konnten in diesem Zeitraum keine Aggregate beobachtet werden. Einschlusse.zienz von Fe2+-haltigen FHE-Liposomen Analog zu den RVE-Liposomen wurden auch die mittels FHE hergestellten Liposomen hinsichtlich der mittleren Vesikelgröße und der Verteilungsbreite mittels PCS unter­sucht. Zudem erfolgte nach dem gleichen Prinzip wie bei der RVE die Quanti.zierung von intravesikulären Fe2+-Ionen nach der Aufreinigung. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Die EE der FHE-Methode ist wie erwartet generell deutlich niedriger als die der RVE. Trotzdem liegt die EE bei zwei Ansätzen deutlich über dem Literaturwert von ca. 10% [76].WomöglichspielthierbeieineanziehendeWechselwirkungdesFe2+-PDC-Komplexes bzw. freier Fe2+-Ionen mit der POPC-Liposomenmembran eine Rolle, die zu einem er­höhten Anteil an vesikulär gebundenen Fe2+-Ionen führt. Die Zunahme der EE bei auf 2.2 Einschluss von Fe2+-Ionen in Liposomen Tab. 2: Einschlusse.zienz (EE = cintern(Fe2+) ) verschiedener Ansätze der Filmhydratisie­ c0(Fe2+) rungsmethode in Abhängigkeit von der mittleren Vesikelgröße für dialysierte 10 mM POPC-Liposomendispersionen in 100 mM TRIS; c0(Fe2+) -Fe2+-Startkonzentration; V intern -internes Volumen; cdisp(Fe2+) -Fe2+-Konzentration in der Liposomendisper­sion und cintern(Fe2+) -intravesikuläre Fe2+-Konzentration pH c0(Fe2+) (mM) Z-Average (nm) Vintern (µl) cdisp(Fe2+) (mM) cintern(Fe2+) (mM) Einschluss­e.zienz (%) 7,4 60 336,2 88,3 0,699 6,02 10,0 7,4 60 209,4 53,5 0,794 11,28 18,8 7,4 30 98,2 23,0 0,240 7,95 26,5 kleinere Z-Averages extrudierten Liposomendispersionen kann analog zur RVE-Methode erklärt werden: Durch die vermehrte Erzeugung von kleinen, unilamellaren Vesikeln aus zuvor oligolamellaren Vesikeln im Verlauf der Extrusion steigt die EE. Tatsächlich wei­sen mittels FHE hergestellte Fe2+-PDC-Komplex-haltige Liposomendispersionen einen hohen Anteil an oligolamellaren Vesikeln auf (s. Abb. 12a). 2.2.7 Diskussion -Einschluss von Fe2+-Ionen in Liposomen Die beiden untersuchten Methoden der FHE und der RVE erwiesen sich als geeignet, um Fe2+-Ionen unter inerten Bedingungen in POPC-Liposomen einzuschließen. Mit der RVE ließen sich dabei deutlich höhere EE realisieren. Der Vergleich dieser Ergebnisse mit denen von Xia et al. [65] zeigt, dass einige Trends bestätigt werden konnten. Xia et al. [65] studierten den Ein.uss verschiedener Faktoren auf den Einschluss von FeSO4 in Liposomen, verwendeten allerdings liposomale Formulierungen mit Anteilen von je 10 % Cholesterol und dem Tensid Tween 80 (Struktur s. Abb. 13). Gleichwohl wurden auch in diesen Untersuchungen die höchsten Einschlusse.zienzen mit der RVE erzielt. Überdieswurde inÜbereinstimmung mit den eigenen Ergebnissen auch bei Xia et al. [65] festgestellt, dass die EE stark vom verwendeten Pu.ersystem (vgl. Tab. 1) und von der eingesetzten Fe2+-Konzentration (vgl. Tab. 2) abhängig ist. Keine Angaben .nden sich indes über eine begrenzte zeitliche Stabilität der untersuch­ten Liposomendispersionen in [65]. Allerdings zeigten die ohne weitere Zusätze mit­tels RVE erzeugten POPC-Liposomendispersionen eine geringere zeitliche Stabilität. Die Stabilität könnte womöglich durch den Zusatz von membranstabilisierenden Sub­stanzen wie Cholesterol verbessert werden. Die mäßige Stabilität von RVE-Liposomen und deren hohe Einschlusse.zienz lassen sich mit der großen Verteilungsbreite der Ve­sikelgrößen in den RVE-Liposomendispersionen erklären. Dieser Umstand fördert die Fusions-und Aggregationstendenz von unterschiedlich großen Liposomen. Ein erstaun­liches Ergebnis der Cryo-TEM-Untersuchungen war, dass sich im Fall der FHE fast aus­schließlich oligolamellare Vesikel bildeten. Im Gegensatz dazu wiesen Fe2+-haltige RVE-Liposomendispersionen einen sehr hohen Anteil an unilamellaren Vesikeln auf. Auch dieser Befund kann die höhere Einschlusse.zienz von RVE-Liposomen mit erklären. In den weiterführenden Experimentenzur Generierung vonintravesikulärem FeS wurden aus Stabilitätsgründen nur FHE-Liposomen untersucht. 2.3 Fällung von FeS in Liposomen 2.3 Fällung von FeS in Liposomen 2.3.1 Herstellung FeS-haltiger Liposomen Zunächst erfolgte die Präparation von aufgereinigten, Fe2+-PDC-Komplex-haltigen Li­posomendispersionen mit einer Startkonzentration von 60 mM. Zur Fällung von intrave­sikuläremFeSwurdendieseDispersionenmitH2SoderNaHSalsFällungsreagenzbehan­delt. Es wird angenommen, dass H2S das maßgebliche Fällungsreagenz zur Herstellung von intravesikulären Metallsul.den ist [20], da es als ungeladenes Molekül besonders rasch durch eine Phospholipidmembran di.undieren kann [77]. Dabei ist der geschwin­digkeitsbestimmende Schritt der intravesikulären Fällungsreaktion nicht die Permeation von H2S durch die Vesikelmembran, sondern komplexere, bislang nicht bekannte Wech­selwirkungen im Vesikelinneren [18]. Geladene Sul.dspezies wie HS--Ionen sollten hin­gegen nur sehr langsam durch die Membran wandern. Somit ist zur Inkubation mit sul.dischen Spezies auch der extravesikuläre pH-Wert von entscheidender Bedeutung. Der pKS1-Wert vonH2S, der bei 6,9 liegt, impliziert eine Inkubation mit H2S bei pH = 7. Da es sich als sehr schwierig erwies, die geringen Volumina der erhaltenen Liposomen­dispersionen von V < 800 µl mit H2S zu begasen, wurden zudem mit H2S gesättigte Lösungen sowie NaHS-Lösungen auf ihre Eignung zur Generierung von intravesikulärem FeS hin untersucht. Unabhängig von der Aufreinigungsmethode verfärbten sich Fe2+-haltige Liposomendi­spersionen bei der Inkubation mit einer 5 -10 mM NaHS-Lösung in TRIS-HCl-Pu.er grau. Diese Verfärbung der durch den Fe2+-PDC-Komplex rosa gefärbten Lösung nach grau trat innerhalb von einer Minute nach dem Mischen der beiden Lösungen auf und war für einige Stunden stabil. Gleichwohl verschwand die dunkle Verfärbung der inku­bierten Dispersion während der Lagerung über Nacht. Sowohl bei Lagerung an Luft als auch unter Argonatmosphäre wurde nach 15 Stunden wieder eine rosa gefärbte Disper­sion erhalten. Eine wiederholte Inkubation einer solchen Dispersion mit NaHS-Lösung bewirkte erneut eine dunkle Verfärbung. So behandelte Dispersionen zeigten eine star­ke Tendenz zur Bildung größerer, sich absetzender Aggregate. Bei Einsatz einer höher konzentrierten, 30 mM NaHS-Lösung konnte die dunkle Verfärbung länger beobachtet werden. Indes setzten sich auch in diesem Fall dunkle Aggregate ab, während die über­stehende Lösung rötlich gefärbt war. Bei der Inkubation mit 2,5 -5 mM H2S in TRIS-HCl-Pu.er verfärbten sich Fe2+-PDC­Komplex-haltigeLiposomendispersionenerstnachmehrerenMinutendeutlichgrau.Auch hier nahm die Intensität der Verfärbung innerhalb von 15 Stunden bei Lagerung unter Argon deutlich ab. 2.3.2 Untersuchungen zur FeS-Fällung in Liposomen UV/Vis-Untersuchungen zur intravesikulären FeS-Fällung Zur Verfolgung der Inkubation von aufgereinigten, Fe2+-haltigen Liposomendispersionen mit H2S wurden UV/Vis-Untersuchungen über einen Zeitraum von mindestens 30 Mi­nuten durchgeführt. Mittels UV/Vis-Spektroskopie sollte zum einen die Abnahme der Absorptionsbande des Fe2+-PDC-Komplexes (s. Abb. 6a, S. 18) durch Ausfällung von FeS und zum anderen die potenzielle Zunahme der Streuintensität in der Probe durch die Bildung von FeS-NP verfolgt werden. Da bereits die Liposomendispersion einfallen­des Licht stark streut und somit sonstige Absorptions-bzw. Streuvorgänge überlagert werden, wurde von den aufgenommenen UV/Vis-Spektren das Spektrum zum Start­zeitpunkt (t0 = 0 s) subtrahiert. Die zeitliche Veränderung der erhaltenen korrigierten Absorptionen ist in Abb. 14a dargestellt. Zusätzlich wurden in einem Kontrollexperi­ment „leere“, in TRIS-HCl-Pu.er hergestellte Liposomen extern mit Fe2+-PDC-Komplex versetzt und ebenfalls ihr Verhalten gegenüber einer H2S-haltigen Pu.erlösung charak­terisiert (Abb. 14b). In beiden untersuchten Proben ist eine stetige Abnahme der Absorption im Bereich der Absorptionsbande des Fe2+-PDC-Komplexes (470 nm < . < 570 nm) zu beobachten. Diese Abnahme ist auf die Ausfällung von Fe2+-Ionen aus dem Komplex und somit auf die Abnahme der Komplex-Konzentration zurückzuführen. Im Falle des extern zugesetz­ten Fe2+-PDC-Komplexes (Abb. 14b) ist dieser Prozess nach ca. 1 Stunde abgeschlossen. Zudem kann bei dieser Probe bei Wellenlängen von . < 430 nm eine starke Zunahme der Absorption bzw. Streuung beobachtet werden. Diese Veränderung wird wahrscheinlich durch die Bildung von FeS-NP oder anderen liposomalen Aggregaten verursacht. Deutlich komplexer ist das Ergebnis für die aufgereinigten Liposomen mit eingeschlos­senem Fe2+-PDC-Komplex. Hier wird die Abnahme der Absorptionsbande des Fe2+­PDC-Komplexes von anderen Prozessen deutlich überlagert. Zunächst ist eine Zunahme der Absorption bzw. Streuung über den gesamten vermessenen Wellenlängenbereich zu verzeichnen (bis zum Zeitpunkt t = 480 s). Zu diesem Zeitpunkt war die Probe auch visuell deutlich grau gefärbt. Bei der Untersuchung der Probe über diesen Zeitpunkt hinaus zeigte sich eine Abnahme der Absorption bzw. Streuung über den gesamten 2.3 Fällung von FeS in Liposomen Abb. 14: Verfolgung der korrigierten Absorptionsspektren (jeweils Ausgangsspekrum vom Zeitpunkt t0 = 0 s subtrahiert) von Fe2+-PDC-Komplex-haltigen Liposomendisper­sionen nach Inkubation mit einer 25 mM H2S-Lösung in TRIS-HCl-Pu.er; links (a): mittels GPC aufgereinigte, Fe2+-PDC-Komplex-haltige Liposomen (Abschätzung: ca. 3 mM POPC-Liposomen und ca. 0,15 mM Fe2+-PDC-Komplex) und rechts (b): leere, 1,5 mM Liposomen mit extern zugesetztem 1 mM Fe2+-PDC-Komplex vermessenen Wellenlängenbereich. Das 30 Minuten nach der Inkubation aufgenommene UV/Vis-Spektrum weist fast über den gesamten Meßbereich eine geringere Absorption bzw. Streuung als das nach 30 s aufgenommenen Spektrum auf (Abb. 14a). In der auf­gereinigten Liposomenprobe scheint also ein reversibler Prozess abzulaufen, obwohl die Probe visuell unverändert grau erscheint. Lediglich die geringere Absorption im Bereich der Absorptionsbande des Fe2+-Komplexes bleibt erhalten (s. Pfeil). Bemerkenswert da­bei ist, dass die zunächst beobachtete Zunahme der Absorption v.a. bei Wellenlängen von . > 400 nm mit einem deutlichen Maximum bei . = 440 nm auftritt, während dieser E.ekt bei der Vergleichsprobe mit externem Fe2+-Komplex bei kleineren Wellen­längen (300 nm < . < 430 nm) auftritt. Dies könnte auf die Lokalisierung der FeS-Partikelbildung zurückzuführen sein. Extern gebildete, freie FeS-Partikel (Abb. 14b) streuen einfallendes Licht umso stärker, je kürzer die Wellenlänge des Lichtes ist. Hinge­gen können intravesikulär gebildete FeS-NP lediglich längerwelliges Licht streuen bzw. absorbieren, da die Liposomenhüllen kürzerwelliges Licht deutlich stärker streuen und vornehmlich längerwelliges Licht die Membran durchdringen kann. PCS-Untersuchungen von Liposomen nach FeS-Fällung Die mit NaHS-Lösung bzw. H2S-gesättigter Pu.erlösung inkubierten, grau verfärbten Liposomendispersionen wurde mittels PCS charakterisiert. Es zeigte sich, dass der Z-Average und auch der PDI der Proben vor und nach der Inkubation für mehrere Tage praktisch unverändert waren. Typische Ergebnisse bei PCS-Messungen von auf 100 nm extrudierten Liposomen waren Werte des Z-Average von 97 nm mit PDI < 0,15. Aller­dings wurde jeweils nur der Überstand der Liposomendispersionen, nicht die nach einem Tag gebildeten Aggregate nach Homogenisieren der Probe, untersucht. Somit kann nur die Stabilität der Liposomen, d.h. unveränderter Z-Average und PDI, im visuell nicht verfärbten Überstand der inkubierten Liposomendispersion belegt werden. Wie bereits erwähnt, konnte in entfärbten Liposomendispersionen durch erneute Inku­bation mit NaHS-Lösung eine dunkle Verfärbung induziert werden (s. Kapitel 2.3.1). Die PCS-Untersuchung einer solchen Probe zeigte das Auftreten großer Aggregate und eine deutliche Zunahme des PDI der Liposomendispersion und deutet auf eine Instabilität der inkubierten Liposomen unter diesen Bedingungen hin. Cryo-TEM-Untersuchungen von Liposomen nach FeS-Fällung Mithilfe der Cryo-TEM wurde untersucht, ob sich durch die Inkubation von aufgereinig­ten Fe2+-PDC-Komplex-haltigen Liposomendispersionen mit H2S zum einen Verände­rungen hinsichtlich der Vesikel-Morphologie und zum anderen hinsichtlich der Bildung von eisenhaltigen Aggregaten in Liposomen beobachten lassen. Solche Aggregate sollten aufgrund der höheren Ordnungszahl und damit Elektronendichte von Eisen einen stär­keren Kontrast als die umgebenden vesikulären Strukturen aufweisen. Bei der Interpretation einiger Cryo-TEM-Aufnahmen störte indessen, dass sich auf vie­len Aufnahmen durch die Bescha.enheit der Probe bzw. aus apparativen Gründen der Hintergrundkontrast von einer Seite der Aufnahme zur anderen kontinuierlich verändert. Dadurch erscheinen die Membranen von Liposomen bei einem dunkleren Hintergrund dunkler gefärbt als bei einem hellen Hintergrund (s. Abb. 17b). Dies ist problematisch, da bei diesen Untersuchungen nach eben solchen dunkler gefärbten Partikeln bzw. Mem­branen als Indiz für die Bildung von FeS-Partikeln bzw. -Schichten gesucht wurde. Aus diesem Grund wurden zur Auswertung der Untersuchungen nur solche Aufnahmen ver­wendet,dieeinenannäherndeinheitlichenHintergrundmitmöglichstgeringerKörnigkeit aufweisen. 2.3 Fällung von FeS in Liposomen haltigen Liposomen; links (a) ohne NaHS und rechts (b) nach Inkubation mit NaHS- Lösung Beim Vergleich von Abb. 15a und 15b fällt auf, dass bereits ein kleiner Anteil Fe2+­haltiger Liposomen (insgesamt < 10 %) dunkle Verfärbungen der Membran aufweisen, die auf die Bildung von eisenhaltigenNiederschlägen hinweisen. Rein visuell ist in diesem Fall kein deutlicher Unterschied zu der mit NaHS-Lösung inkubierten Liposomendisper­sion auszumachen. Im Vergleich konnten dunkle Aggregate an Liposomenmembranen hingegen deutlich häu.ger und charakteristischer bei der mit NaHS-Lösung inkubierten Probe beobachtet werden. Abbildungen 16a und 16b zeigen ebenfalls Aufnahmen von mit NaHS-Lösung inkubier­ten Liposomen. Deutlich sind an der Liposomenmembran gebildete, dunkle Strukturen sichtbar. Zum einen können in Abb. 16a schichtartige Ablagerungen an der Membran beobachtet werden. Solche Strukturen wurden auch vielfach bei weiteren Cryo-TEM-Aufnahmen detektiert. Allerdings tritt dieses Phänomen auch bei nicht-inkubierten Li­posomen sehr vereinzelt auf (s. Abb. 15a). Somit kann nicht mit Sicherheit zwischen vor der Inkubation mit NaHS-Lösung gebildeten, vermutlichen hydroxidischen Ablagerun­genund sul.dischen Ablagerungen nach der Inkubation mit NaHS-Lösung unterschieden werden. Zudem war das Erzeugen dieser Membranablagerungen in Folgeexperimenten schwierig zu reproduzieren. In Abb. 16b erkennt man vereinzelt membranständige NP, die aufgrund ihres Kontrasts nach Inkubation mit NaHS-Lösung; links (a) interne Membranablagerungen und rechts (b) diskrete Partikel in wenigen Liposomen vermutlich eisenhaltig sind. Eine konkrete Aussage über die Lokalisierung dieser Partikel an der äußeren oder inneren Liposomenmembran ist leider nicht möglich. Vergleichbare Ergebnisse mit je einem Partikel pro Liposom wurden auch bei CdS-NP in Liposomen beobachtet [21]. Für die eisenhaltigen Liposomen war allerdings die Ausbildung von NP nur bei sehr wenigen Liposomen (<10 %) zu beobachten. Charakteristischer war eher die Bildung von Schichten feingranulärer Partikel entlang der Membran. Dennoch weisen auch viele Liposomen nach der Inkubation keinerlei dunkle Verfärbung der Membran auf. Solche Spezies waren dominierend in Folgeexperimenten, in denen hauptsächlich oligo-und multilamellare Vesikel ohne dunkle Ablagerungen auf der Mem­bran beobachtet wurden (s. Abb. 17a). In einem weiteren Experiment wurden aufgereinigte, Fe2+-PDC-Komplex-haltige Lipo­somenexternmiteinerFeS-SuspensionversetztunddieMischungebenfallsmittelsCryo­TEManalysiert.DabeiderProbenpräparationgenerellgrößerePartikelentferntwerden, konnten in der Probe nur an wenigen Stellen überhaupt FeS-Aggregate entdeckt werden. Generell zeigen allerdings die mit der FeS-Suspension behandelten Liposomen deutliche Membranstörungen(Abb.18,rechts),diebeiunbehandeltenLiposomennichtbeobachtet wurden und von Wechselwirkungen mit FeS-Partikeln herrühren könnten. Zudem wurde ebenfalls die Wechselwirkung von einzelnen Liposomen mit dunklen FeS-Aggregaten be­obachtet (Abb. 18, links). Diese Ergebnisse deuten auf einen destabilisierenden Ein.uss von FeS auf die POPC-Liposomenmembran. Dies deckt sich mit den rein phänomenolo­ 2.3 Fällung von FeS in Liposomen gischen visuellen Beobachtungen (s. Kap. 2.3.1). 2.3.3 Diskussion -FeS in Liposomen Die intravesikuläre Fällung von FeS in aufgereinigten, Fe2+-haltigen Liposomen konn­te mittels UV/Vis-Spektroskopie verfolgt werden. Mit dieser indirekten Methode zeigte sich,dassnachderInkubationmitH2S-LösunganfangseinerascheZunahmederAbsorp­tion in einem Wellenlängenbereich von 300 nm < . < 650 nm, einhergehend mit einer grauen Verfärbung der rosa gefärbten Probe, auftrat. Schon nach ca. 8 Minuten wurde eine Verringerung der Absorption beobachtet. Nach ca. 30 Minuten wies die Dispersion bereits eine geringere Absorption als 30 s nach Beginn der Inkubation auf. Lediglich die Abnahme der Absorption im Bereich der Absorptionsbande des Fe2+-PDC-Komplexes weist auf die Ausfällung von Fe2+-Ionen aus dem Komplex hin. Die beobachtete Rever­sibilität der Absorptionsänderung könnte durch Aggregationsprozesse verursacht sein und wäre folglich ein Indiz für eine mögliche Instabilität von Liposomen bei der in­travesikulären FeS-Bildung. Bilden sich während der Inkubation mit H2S Aggregate aus Liposomen mit FeS-NP, so streuen diese weiterhin das einfallende Licht. Indes würde der Gesamtquerschnitt aller mit dem einfallenden Licht wechselwirkenden Liposomen gerin­ger werden.Durchdie geringere Anzahlan isolierten Liposomen in der Dispersionkönnte wieder mehr Licht die Probe passieren und die Gesamtabsorption bzw. -streuung wieder abnehmen. Dieses Phänomen ist auch unter dem Namen „Shadow-E.ekt“ bekannt [78]. Die Bildung von Aggregaten bei höheren H2S-bzw. HS--Konzentrationen konnte ein­deutig visuell belegt werden. Gleichwohl deuten die PCS-Untersuchungen darauf hin, dass sich weiterhin größen-und aggregationsstabile Liposomen in inkubierten Proben be.nden. Allerdings wurde hierbei stets der Überstand der Proben untersucht, so dass keine Aussage über mögliche sedimentierten Aggregate möglich ist. Dies ist in Über­einstimmung mit den Ergebnissen der Cryo-TEM-Untersuchungen, in denen ebenfalls vorwiegend Liposomen mit einer Größe < 200 nm ohne sichtbare Aggregate beobachtet wurden. Das zu dieser Zeit ungeklärte Phänomen der raschen Entfärbung der inkubierten Lipo­somendispersionen, sogar bei Lagerung unter Argon, erschwerte die Detektion möglicher intravesikulärer FeS-Partikel bzw. -Ablagerungen. Die Ausbildung von hauptsächlich Schichten feingranulärer eisenhaltiger Aggregate wurde nur vereinzelt beobachtet und war nur schwer reproduzierbar. I.d.R. war kaum ein visueller Unterschied zwischen in­ 2.3 Fällung von FeS in Liposomen kubierter und nicht-inkubierter Probe festzustellen. Hierfür könnte die Entfärbung der inkubierten Proben, die vermutlich auf die Au.ösung gebildeter FeS-Partikel zurückzu­führen ist, verantwortlich sein. In späteren Experimenten mit FeS-haltigen Polymerso­men wurde beobachtet, dass bei der Lagerung von mit H2S inkubierten Proben unter H2S-Atmosphäre keine Entfärbung der Probe auftrat. Dies deutet auf eine Reversibilität der FeS-Fällungsreaktion hin. Dieses Phänomen wird vermutlich auch durch die gerin­gen Mengen an intravesikulären Fe2+-Ionen mit verursacht. Bilden sich nur wenige, sehr kleine FeS-Aggregate, könnte sich diese womöglich wieder au.ösen. Dies könnte mit dem Hinausdi.undieren von H2S aus dem Vesikelinneren und schließlich aus der Liposomen­dispersion während der Lagerung erklärbar sein, durch die das Fällungsgleichgewicht wieder auf die Seite freier bzw. komplexierter Fe2+-Ionen verschoben würde. Die Bestimmung der Anzahl an Fe2+-Ionen in einem einzelnen Liposom kann durch eine einfache Berechnung erfolgen. Ein FHE-Liposom mit einem Durchmesser von 200 nm, das in einer 60 mM Lösung des Fe2+-PDC-Komplexes generiert wurde, weist nach der Aufreinigung eine durchschnittliche interne Fe2+-Konzentration von ca. 8,6 mM auf (s. Tab. 2, S. 29). Damit halten sich im Inneren dieses Liposoms lediglich 21700 Fe2+­Ionen auf (vgl. [55]). Bildete sich aus all diesen Fe2+-Ionen ein einziger, kubusartiger FeS-Kristall, so hätte dieser eine Kantenlänge von nur 13 nm. Da es auch möglich ist, dass sich mehrere kleine Kristallite bilden, wäre eine Detektion mittels Cryo-TEM (Auf­lösungsgrenze ca. 3 nm) fast unmöglich, da häu.g auch der Hintergrund bei Cryo-TEM-Aufnahmen sehr körnig erscheint. Würde sich das potenziell intravesikulär gebildete FeS alseinedünneSchichtaufderInnenseitederVesikelmembrananlagern,sowäreauchdies kaum elektronenmikroskopisch zu erfassen. Die Abschätzung der Fläche einer hypothe­tischen FeS-Monoschicht auf der inneren Ober.äche des oben beschriebenen Liposoms ergibt, dass die FeS-Monoschicht durchschnittlich lediglich 4,3 % der inneren Ober.ä­che des Liposoms bedecken würde. Je größer die Liposomen sind, desto größer würde hingegen auch der Anteil der theoretisch bedeckten inneren Ober.äche. Auch die Größe möglicher FeS-Partikel könnte mit zunehmender Vesikelgröße deutlich zunehmen, was die Detektion mittels Cryo-TEM vereinfachen würde. Die unter Verwendung mittler­er Konzentrationen vorgenommenen Abschätzungen machen deutlich, wie schwierig die Detektion der kleinen Mengen an intravesikulären FeS-Aggregaten mittels Cryo-TEM ist. Gleichwohl lässt sich visuell die FeS-Fällung belegen. AufgrundderbeobachtetenMembranstörungenvonPOPC-LiposomeninGegenwartvon FeS wurden Membranstabilitätsexperimente unter Verwendung des selbst-löschenden Fluoreszenzfarbsto.s Carboxy.uorescein von K. Rüdel (Lehrstuhl für Pharmazeutische Technologie) durchgeführt. Diese Experimente zeigten, dass POPC-Liposomen eine er­hebliche Instabilität gegenüber FeS aufweisen. Dies konnte in unabhängigen Vesikelsta­bilitätstests bestätigt werden. Aufgrund dieser Befunde wurde eine andere amphiphile Substanzklasse auf ihre Eignung zur Herstellung von stabilen, FeS-haltigen Vesikeln hin untersucht: Statt des zwitterionischen POPC erfolgten Untersuchungen mit einem un­geladenen block-Copolymer (s. Kapitel 3). 2.4 Magnetische Liposomen -Magnetoliposomen 2.4 Magnetische Liposomen -Magnetoliposomen 2.4.1 Motivation Magnetische Liposomen sind schon seit gut 20 Jahren Forschungsgegenstand aufgrund ihrer besonderen Eigenschaften [79] und vielversprechenden Anwendungsmöglichkeiten, z.B. in der Anti-Tumor-Therapie oder als Röntgenkontrastmittel (s. Kapitel 1.1.2). Zur Herstellung von eisenhaltigen Magnetoliposomen sind zwei verschiedene Verfahren be­kannt.Entwederes werden zuvorpräpariertemagnetische NPdirekt in Liposomen einge­schlossen[57,79,80]oder in einem mehrstu.genProzess werden zunächstFe2+-und/oder Fe3+-Ionen in Liposomen eingeschlossen und nach der Aufreinigung durch Zugabe einer Base die intravesikuläre Bildung von magnetischen Partikeln induziert [56,60,81]. Dieser Vorgang ist durch eine gelbliche Verfärbung der Dispersion gekennzeichnet [60]. Beim Mischen einer wässrigen Lösung mit stöchiometrischen Mengen an Fe2+-und Fe3+-Ionen mit einer starken Base bilden sich die entsprechenden Eisenhydroxide, die sehr rasch un­ter Bildung von Magnetit Fe3O4 altern [80]. Die etablierten Methoden zur Generierung von Fe2+-haltigen Liposomen (s. Kapitel 2.2) sollten als Grundlage für die Herstellung von Magnetoliposomen mit dem oben beschrie­benen mehrstu.gen Verfahren dienen. Zudem erfolgten Untersuchungen zum Einschluss von mit Triethylenglykol (TREG) stabilisierten Magnetit-NP in Liposomen analog zu den PB-PEO-Polymersomen (vgl. Kapitel 3.5). Die Charakterisierung der hergestellten Magnetoliposomen erfolgte hinsichtlich ihrer Morphologie (Cryo-TEM), Stabilität und ihren magnetophoretischen Eigenschaften. 2.4.2 Liposomen mit intravesikulär generiertem Magnetit Präparation MithilfederRVE-MethodewurdederFe2+-PDC-KomplexmiteinerAusgangskonzentra­tion von 30 mM unter anaeroben Bedingungen in 10 mM POPC-Liposomen eingeschlos­sen. Nach der Aufreinigung mittels Dialyse wurde die erhaltene, rosa gefärbte Liposo­mendispersion an Luft mit 10 V% 25 %-igem NH3 versetzt. Hierbei konnte eine gelbliche Verfärbung beobachtet werden. Die so behandelte Dispersion mit potentiell Magnetit­haltigen Liposomen wurde zur Veri.zierung ihrer magnetophoretischen Eigenschaften an einem Nd2Fe14B-Supermagnet unter nicht inerten Bedingungen gelagert. Dabei bildeten sichim VerlaufwenigerStunden gelbliche Aggregate inderNähedesSupermagneten,die auf magnetophoretische Partikel oder Liposomen hinweisen (s. Abb. 19). Aufgereinigte Liposomendispersionen wiesen auch ohne Zusatz von NH3 bei mehrstündiger Lagerung anLuftkleinegelblicheAggregationeninderNäheeinesSupermagnetenauf.Diesekönn­ten auf die Oxidation von Fe2+-Ionen durch Luftsauersto. und die damit verbundene Ausfällung von Fe(OH)3 bei pH 7,4 zurückzuführen sein. Zur Klärung der beobachteten Phänomene wurden die potenziellen Ein.ussfaktoren bei der Bildung magnetophoreti­scher Liposomen -pH-Wert, Anwesenheit von Luftsauersto. und äußeres Magnetfeld ­systematisch untersucht. In Vergleichsuntersuchungen wurde mit der FHE-Methode ebenfalls eine 30 mM Lösung des Fe2+-PDC-Komplexes in 10 mM POPC-Liposomen eingeschlossen. Nach der Auf­reinigung der Liposomendispersion erfolgte die Zugabe von 10 V% 25 %-igem NH3, die allerdingszukeinersichtbarenFarbänderungderzuvorfarblosenDispersionführte.Auch während der mehrtägigen Lagerung der mit NH3 inkubierten Liposomendispersionen an einem Supermagneten konnten keine Aggregationen beobachtet werden. 2.4 Magnetische Liposomen -Magnetoliposomen 25 %-igem NH3 und zwei Tagen Lagerung an Luft; interne Aggregate in fast al­ len Liposomen zu erkennen (Pfeile) Untersuchungen von Liposomen mit Fe3O4 InPCS-UntersuchungenerwiesensichdiehergestelltenFHE-undRVE-Liposomenunab­hängig von der Zugabe von NH3 als stabil. Obgleich insbesondere die RVE-Liposomen bereits nach der Herstellung einen PDI > 0,35 aufwiesen, veränderten sich die PCS-Daten der inkubierten, homogenisierten Dispersionen im Verlauf von 8 Tagen nicht. Indes konnte in weiteren PCS-Untersuchungen festgestellt werden, dass sich im klaren Teil der am Supermagneten gelagerten Dispersion Vesikel mit einem kleineren Z-Average und einem kleineren PDI befanden. Nach dem Homogenisieren der Probe wurde mittels PCS wieder ein den Ausgangswerten vor der Inkubation entsprechender Z-Average und PDI detektiert. Dies deutet darauf hin, dass sich kleinere Vesikel vergleichsweise lang­samer oder gar nicht gerichtet im angelegten Magnetfeld bewegen. Für die Stärke der Anziehung der Magnetoliposomen durch das angelegte Magnetfeld spielt wahrscheinlich auch die Größe intravesikulärer Magnetit-Niederschläge eine Rolle. FHE-Liposomen mit einem mittleren Durchmesser von ca. 100 nm und einem PDI von ca. 0,1 wurden ebenfalls mit 25 %-igem NH3 inkubiert und anschließend an Luft ge­lagert. Dabei konnte keine Änderung des Z-Average über einen Zeitraum von 7 Tagen 25 %-igem NH3 und zwei Tagen Lagerung an Luft; interne Aggregate bei Vesikeln < 150 nm kaum zu erkennen (s. Pfeile) detektiert werden. Lediglich der PDI erhöhte sich in diesem Zeitraum geringfügig, blieb jedoch stets unter einem Wert von 0,2. Zur Visualisierung der Morphologie der präparierten Liposomen erfolgten Cryo-TEM-Untersuchungen, bei denen ebenfalls nach intravesikulären Magnetit-Partikeln gesucht wurde. Es zeigte sich, dass RVE-Liposomen zum größten Teil unilamellar vorliegen. Mehr als 90 % der RVE-Liposomen mit einem Durchmesser über 150 nm wiesen nach der Inkubation mit NH3 kleine, eindeutig intravesikuläre Aggregate auf (s. Abb. 20). Bei kleineren RVE-Liposomen konnten interne Aggregate gar nicht oder nicht mit Sicher­heit auf den elektronenmikroskopischen Aufnahmen identi.ziert werden (s. Abb. 21). RVE-Liposomen mit Größen über 200 nm, die lediglich an Luft gelagert wurden, wiesen ebenfalls in mehr als 50 % der Vesikel interne Niederschläge auf. Folglich ist die Anwe­senheit von Luftsauersto. für die Ausbildung interner Niederschläge notwendig, denn in inert gelagerten Proben konnten keine derartigen Niederschläge detektiert werden. Die Inkubation mit NH3 bewirkt einen höheren Anteil an intravesikulären Niederschlägen. Die Einwirkung eines äußeren Magnetfeldes scheint ohne Ein.uss auf die Ausbildung in­terner Niederschläge zu sein. Ein Magnetfeld bewirkt hingegen eine Separierung von „be­ 2.4 Magnetische Liposomen -Magnetoliposomen ladenen“ und „unbeladenen“ Vesikeln, was auch durch PCS-Daten von RVE-Liposomen bestätigt wird. Die beobachteten internen Aggregate bestehen aus vielen kleinen NP mit einer Größe von ca. 4 nm, die sich di.us an der inneren Vesikelmembran zusammenla­gern (s. Abb. 22a). Bei den Cryo-TEM-Untersuchungen konnten ferner sehr vereinzelt extravesikuläre dunkle Aggregate entdeckt werden (s. Abb. 22b), die womöglich durch das Kollabieren von Liposomen freigesetzt wurden. Ein ganz anderes Bild bot sich bei den Cryo-TEM-Untersuchungen von 100 nm FHE-Liposomen. Selbst bei der Lagerung an Luftsauersto. und Zusatz von NH3 konnten keine internen Präzipitate mit Sicherheit detektiert werden. Dies kann zum einen an der geringen Größe der Liposomen liegen, denn auch im Fall von kleineren RVE-Liposomen konnten keine internen Aggregate sicher identi.ziert werden. Zum anderen weisen die Mikrographen der FHE-Liposomen einen störenden Untergrund auf, der eine Identi.­zierung von internen Aggregaten erschwert (s. Abb. 23a). Generell konnte eine Tendenz der Vesikel zur Oligolamellarität beobachtet werden. Vereinzelt wurden zudem wie auch bei den RVE-Liposomen dunkle extravesikuläre Aggregate detektiert. 2.4.3 Liposomen mit stabilisierten Magnetit-Nanopartikeln POPC-Liposomen wurden auf ihre Eignungzum EinschlussvonmitTREG stabilisierten Magnetit-NPexemplarischuntersucht. NachdererfolgreichenHerstellungvonMagnetit-NP mit einer Größe von 4 -8,5 nm erfolgten zunächst pH-abhängige Stabilitätsunter­suchungen von wässrigen Magnetit-NP-Suspensionen (s. Kapitel 3.6.2). Es zeigte sich, dass solche Suspensionen in H2O bei pH 3 für mehrere Wochen stabil sind und keinerlei Sedimentationstendenz aufweisen. Eine so präparierte 0,1 mg/ml Magnetit-NP-Suspension kam bei der Hydratisierung ei­nes POPC-Films nach der FHE-Methode (vgl. S. 159) zum Einsatz . Es wurde analog zur Herstellung Fe2+-haltiger Liposomen ein POPC-Film erzeugt und mit der Magnetit-Suspension intensiv geschüttelt. Die erhaltenen Liposomen wurden durch Extrusion auf eine mittlere Größe von 100 nm gebracht, wie mittels PCS-Messungen bestätigt wer­den konnte. Zur Aufreinigung der Liposomen erfolgte eine Größenausschlusschromato­graphie [57,80]. Diese Aufreinigungsmethode hatte sich in vorangegangenen Tests zur Abtrennung von nicht verkapselten Magnetit-NP als geeignet erwiesen. Die Lagerung der aufgereinigten Liposomen an einem Supermagneten ließ visuell kei­ 2.4 Magnetische Liposomen -Magnetoliposomen nerlei Aggregation in der Nähe des Magneten erkennen. In Cryo-TEM-Untersuchungen solcher Dispersionen konnten unilamellare Liposomen detektiert werden, die jedoch aus­nahmslos ohne assoziierte Magnetit-NP vorlagen. Der Versuch, Magnetit-NP auf diesem Wege in FHE-Liposomen einzuschließen, führte nicht zum gewünschten Ergebnis. Modi.kationen der FHE oder weitere, in der Literatur beschriebene Methoden wie Einsatz von Ultraschall oder RVE könnten in zukünftigen Experimenten zur erfolgreichen Verkapselung von Magnetit-NP in Liposomen führen. 2.4.4 Diskussion -Geeignete Zugänge zu Magnetoliposomen Von den beiden untersuchten Ansätzen zur Generierung von Magnetoliposomen erwies sich nur die Methode des sukzessiven Einschlusses von Fe2+-Ionen und der anschließen­den Ausfällung von Fe3O4 als geeignet. Der Ansatz, TREG-stabilisierte Magnetit-NP direkt in POPC-Liposomen mittels FHE einzuschließen, führte nicht zum gewünschten Ergebnis. Dies könnte an dem für die Magnetit-NP verwendeten sterischen Stabilisator TREG liegen, der einen Einschluss der NP in Liposomen verhindert. Schließlich konnten bereits Magnetit-NP in Liposomen eingeschlossen werden[57,80]. Jedoch wurde dabei nicht die FHE-Methode sondern Ultraschall bzw. die RVE-Methode eingesetzt. Somit könnte die FHE-Methode u.U. auch für diesen Zweck ungeeignet sein. Allerdings wurde aus Gründen der Vergleichbarkeit zu den PB-PEO-Polymersomen nur die FHE auf ihre Eignunghinuntersucht.InFolgeexperimentenkönntenauchalternativePräparationsme­thoden für Liposomen näher charakterisiert sowie alternative Zugänge zu Magnetit-NP untersucht werden. Die Erzeugung von Magnetoliposomen über den sukzessiven Einschluss von Fe2+-Ionen mittels RVE und anschließender Ausfällung ließ sich auch visuell durch die Lagerung an einem Supermagnet verfolgen. Es erwies sich als entscheidend, dass die Proben an Luftsauersto. gelagert wurden. Dies ist o.ensichtlich, da 23 der Fe2+-Ionen zu Fe3+-Ionen oxidiert werden müssen, damit überhaupt Magnetit aus dem Gemisch von Fe(II)-und Fe(III)-hydroxid entstehen kann. Die Einwirkung von Luftsauersto. zur Bildung von Magnetit ist in diesem Fall hinreichend, da die Präparationsbedingungen der Liposomen einen internen pH-Wert von 7,4 erwarten lassen. Ein weiterer Faktor ist die Zugabe einer Base, die die Bildung von Magnetit lediglich vorantreibt und zu einem höheren Anteil an intravesikulären Niederschlägen führt. In vergleichbaren Studien erwies sich die Zu­gabe einer Base zu Fe2+-/Fe3+-haltigen Liposomen hingegen als zwingend notwendig, da bei der Liposomenpräparation eine saure Lösung eingeschlossen wurde. Darum muss der pH-Wert zur Hydroxid-Fällung durch Inkubation mit einer Base erhöht werden. Somit ist der hier verwendete Ansatz des inerten Einschlusses von Fe2+-Ionen in Liposomen im leicht alkalischen zwar aufwändiger, indes kann die Bildung von intravesikulärem Mag­netit durch das bloße Lagern an Luft initiiert werden. PCS-Untersuchungen zeigten zudem, dass die Lagerung von Liposomendispersionen an einem Supermagneten prinzipiell zur Trennung von größeren, magnetophoretischen Ve­sikeln von kleineren Vesikeln geeignet ist. Dies kann in Zusammenhang mit der Größe der intern gebildeten magnetischen Partikel gebracht werden. Je größer die intravesiku­lären Magnetit-Niederschläge sind, desto stärker werden sie vom Magnetfeld angezogen. Damit dürfte eine gerichtete Bewegung größerer Vesikel einhergehen, während kleinere Vesikel sich eher di.usionskontrolliert bewegen. Eine weitere erstaunliche Erkenntnis war, dass sich bei 100 nm FHE-Liposomen in Cryo­TEM-Untersuchungen keine intravesikulären Aggregate visualisieren ließen. Dieser Be­fund ist in Übereinstimmung mit der Beobachtung, dass auch bei RVE-Liposomen nur Vesikel > 150 nm erkennbare interne Aggregate aufweisen. Eine plausible Erklärung für diese Beobachtungen liefert die jeweilige Anzahl an eingeschlossenen Fe2+-Ionen. Die­ser Wert kann mithilfe der Quanti.zierung des internen Fe2+-Gehalts in den jeweiligen Ansätzen ermittelt werden. Anhand eines Beispiels wird deutlich, wie unterschiedlich die Anzahl interner Fe2+-Ionen sein kann: 100 nm FHE-Liposomen mit einer inter­nen Konzentration von 8 mM enthalten durchschnittlich lediglich ca. 2500 Fe2+-Ionen. 200 nm RVE-Liposomen mit einer internen Fe2+-Konzentration von 14 mM enthalten im Durchschnitt ca. 35300 Fe2+-Ionen, während 100 nm RVE-Liposomen desselben Ansat­zes durchschnittlich nur ca. 4400 Fe2+-Ionen enthalten. Diese Abschätzung verdeutlicht, warum größere Vesikel deutlich größere interne Aggregate aufweisen können und die in­ternen Aggregate von kleineren Vesikeln kaum nachweisbar sind. Dies hängt auch mit derAu.ösungsgrenzederCryo-TEMzusammen,diebei ca.3nm liegt.Somit könnennur größere Aggregate von NP dieser Größe (s. Abb. 22a) deutlich identi.zierbar abgebildet werden. 3 Eisenhaltige Polymervesikel (Polymersomen) 3.1 Vorbemerkungen Ausgehend von den Erfahrungen zur Herstellung Fe2+-haltiger Liposomen wurden in analogerHerangehensweiseauchPolymervesikel,sogenanntePolymersomen,untersucht, dieausdemamphiphilenblock-Copolymer1,2-Polybutadien-polyethylenoxid(fortanmit PB-PEO bezeichnet) aufgebaut sind (s. Abb. 24). Für Vesikelmembranen des ungela­denen PB-PEO kann, anders als für Membranen von zwitterionischen Phospholipiden wie POPC [64], eine geringe elektrostatische Wechselwirkung mit Fe2+-Ionen bzw. dem Fe2+-PDC-Komplex erwartet werden. Dies sollte zum einen die Stabilität von Fe2+­haltigen Polymersomen erhöhen. Zum anderen geht der deutlich schwächer ausgeprägte amphiphileCharakterdesPB-PEOmiteinerwesentlichgeringerenelektrostatischenAb­stoßung der PB-PEO-Polymersomen untereinander einher. Aus diesem Grund können Polymersomen nur bei vergleichsweise geringen PB-PEO-Konzentrationen von maximal 1,6 mM (vgl. [82]) präpariert werden. Bei höheren Konzentrationen treten Aggregatio­nen auf. POPC-Liposomen können hingegen mit Lipidkonzentrationen von über 10 mM hergestellt werden [76]. Analog zu den POPC-Liposomen wurden verschiedene Herstellungsmethoden hinsicht­lich ihrer Eignung zur Erzeugung von PB-PEO-Polymersomen getestet. Dabei zeigte sich, dass mittels RVE-Methode keine Polymersomen erzeugt werden konnten. Mittels der FHE-Methode gelang es indes, Polymersomen zu präparieren, so dass ausschließlich die FHE-Methode bei der Herstellung von PB-PEO-Polymersomen zum Einsatz kam. 3.2 Einschluss von Fe2+-Ionen in Polymersomen In Analogie zu den Untersuchungen von Fe2+-haltigen Liposomen wurde in 1,6 mM PB­PEO-Polymersomen eine 60 mM Lösung des Fe2+-PDC-Komplexes in TRIS-HCl-Pu.er mittels FHE eingeschlossen.Die so präparierten Polymersomen konnten durchExtrusion auf Größen von 100 -200 nm eingestellt werden. Ohne Extrusion wiesen Polymersomen­dispersionen eine sehr breite Größenverteilung von 60 nm bis zu einigen Mikrometern auf. Folglich konnte die Lichtmikroskopie als zusätzliche Charakterisierungsmethode für Polymersomen mit Größen über 1 µm zum Einsatz kommen. Die Aufreinigung von Fe2+-haltigen Polymersomen erfolgte üblicherweise mittels Dialyse, wobei EDTA zur ef­fektiven Abtrennung von Fe2+-Ionen zugesetzt wurde. Bei der Dialyse konnte auf einen osmotischen Ausgleich durch NaCl verzichtet werden, da die Polymersomenmembranen sichtrotzdeswirkendenosmotischenDrucksalshinreichendstabilerwiesen.Aufgereinig­te Polymersomendispersionen waren schwach rosa gefärbt und wiesen bei mehrwöchiger inerter Lagerung keine Tendenz zur Bildung von Aggregaten auf. 3.2.1 Charakterisierung von Fe2+-haltigen Polymersomen Dynamische Lichtstreuung PCS-Untersuchungen von nicht extrudierten, Fe2+-haltigen Polymersomendispersionen ergaben,dassPolymersomenmiteinergroßenVesikelgrößen-Verteilungsbreite(PDI>0,4) vorliegen. Fe2+-haltige Polymersomen konnten hingegen bei sukzessiver Extrusion durch zunächst eine 200 nm und dann eine 100 nm Poren.ltermembran reproduzierbar auf einen Z-Average von 130 -140 nm mit einem PDI < 0,17 eingestellt werden. Licht-und Elektronenmikroskopie Nicht extrudierte, aufgereinigte Fe2+-haltige Polymersomendispersionen wurden mit­tels Lichtmikroskopie untersucht. Dabei konnten auf einer repräsentativen Aufnahme (Abb. 25) Vesikel in einem Größenbereich von 1,2 -2,1 µm detektiert werden. Die licht­mikroskopische Beobachtung der Polymersomendispersion belegt somit die Bildung von stabilen Vesikeln mit Größen von über einem Mikrometer. Genauere Aussagen über die Morphologie und Lamellarität der Vesikel sind mit den lichtmikroskopischen Aufnahmen nicht möglich. Mittels Cryo-TEM kann hingegen die Morphologie von Polymersomen näher untersucht 3.2 Einschluss von Fe2+-Ionen in Polymersomen werden. Hierzu eignen sich extrudierte Polymersomen, da mit der Cryo-TEM nur Struk­turen < 500 nm untersucht werden können. Auf einer repräsentativen Aufnahme ist zu erkennen, dass extrudierte PB-PEO-Polymersomen als unilamellare Vesikel mit einer ca. 12 nm dicken Membran vorliegen (Abb. 26). Die Polymersomenmembran ist somit ca. dreimal so dick wie die von unilamellaren POPC-Liposomen. Bestimmung des Eisengehalts von Polymersomendispersionen Zur Bestimmung des Gehalts von in Polymersomen eingeschlossenem Eisen wurde die spektrophotometrische Bestimmung mittels 1,10-Phenanthrolin eingesetzt. Diese bereits bei der Bestimmung des Eisengehalts in Liposomen etablierte Methode konnte auf die Bestimmung des Eisengehalts in Polymersomen übertragen werden. In einem ersten Schritt muss die Polymersomenmembran aufgelöst werden, um eingeschlossene Fe2+­Ionen freizusetzen. Aufgrund des abweichenden amphiphilen Charakters des PB-PEO können Polymersomen nicht wie Liposomen durch Zusatz von TRITON X 100 unter Micellbildung aufgelöst werden. Entsprechende Tests verliefen negativ. Hingegen wer­den Polymersomen durch Zusatz von Tetrahydrofuran (THF) vollständig zerstört, was mikroskopische Untersuchungen belegten. Da nach dem Au.ösen der Polymersomen die in der Lösung verbleibende Matrix bei der Eisenquanti.zierung stört, erfolgte die Eisen­bestimmung in Polymersomendispersionen mit der Standard-Additions-Methode. Diese Methode, die auch schon Anwendung bei der Analyse eisenhaltiger Liposomen gefunden hat, liefert Ergebnisse mit einer nur sehr geringen Verfahrensstandardabweichung von unter 5 %. Mit der FHE-Methode wurden mehrfach Polymersomendispersionen mit einer 60 mM Fe2+-PDC-Lösung in TRIS-HCl-Pu.er hergestellt und nach der Aufreinigung mittels Dialyse der Fe2+-Gehalt spektrophotometrisch bestimmt. Die Ergebnisse sind in Abb. 27 dargestellt. Es wurde ein mittlerer Fe2+-Gehalt von 0,35 mM in dialysierten Polymersomendisper­sionen erhalten. Dieser Wert wurde auch durch eine unabhängige Bestimmung mittels Flammen-Atomabsorptionsspektrokopie (FAAS) bestätigt. Die FAAS, bei der zunächst eine Siebenpunkt-Kalibration mit einem Eisenstandard erfolgte, diente dabei zur Veri.­zierung der Richtigkeit der spektrophotometrischen Methode. Zu Vergleichszwecken wurde des Weiteren eine mittels GPC aufgereinigte, Fe2+-PDC­haltige Polymersomendispersion untersucht. Bei dieser Untersuchung kann der 100%­ 3.2 Einschluss von Fe2+-Ionen in Polymersomen Wert des Eiseneinschlusses direkt nach der Generierung der Vesikeldispersion bestimmt werden, da die rasche Aufreinigung mittels GPC nur wenige Minuten dauert. Bei der Dialyse hingegen, die mehrere Stunden dauert, kann ein Verlust von verkapseltem Fe2+­PDC-Komplex aus Polymersomen mit undichter Membran auftreten. Die mittels GPC aufgereinigte Polymersomendispersion wies einen Fe2+-Gehalt von 0,43 mM auf. Dieser Wert liegt am oberen Ende des Ergebnisbereichs der dialysierten Polymersomendisper­sionen, so dass der Verlust von verkapseltem Fe2+-PDC-Komplex aus Polymersomen während der Dialyse gegen TRIS-HCl-Pu.er vernachlässigbar scheint. Weiterhin wurde der Ein.uss der Extrusion auf den Fe2+-Gehalt von dialysierten Poly­mersomendispersionen untersucht. Es ist deutlich zu erkennen, dass mit abnehmender Größe der Vesikel ein geringerer intravesikulärer Fe2+-Gehalt resultiert. Interessant ist, dass bei der Extrusion durch eine 200 nm Filtermembran, bei der Polymersomen mit einer mittleren Größe von 175 nm mit einem PDI = 0,161 erhalten wurden, nur ei­ne geringe Abnahme des Fe2+-Gehalts zu beobachten ist. Hingegen halbiert sich der Fe2+-Gehalt bei der anschließenden 100 nm Extrusion, bei der Polymersomen mit einer mittleren Größe von 140 nm (PDI = 0,138) generiert wurden. Dieser Trend kann da­mit erklärt werden, dass durch die Verkleinerung der Vesikel zwar die Gesamtober.äche konstant bleibt, aber das eingeschlossene Volumen und damit die eingeschlossene Fe2+­Menge abnimmt. EineStartkonzentrationvon60mMresultiertineinemFe2+-Gehaltvonmaximal0,4mM nach der Aufreinigung. Dies bedeutet, dass 0,7 % der eingesetzten Fe2+-Ionen in Poly­mersomen eingeschlossen werden. Mit dem ermittelten Fe2+-Gehalt in Polymersomen kann indes keine praktische Einschlusse.zienz analog zu POPC-Liposomen berechnet werden, da der Platzbedarf eines einzelnen PB-PEO-Moleküls in der Polymersomen­membran nicht bekannt ist. Berücksichtigt man die um den Faktor sieben geringere Konzentration des Amphiphils PB-PEO (1,6 mM) im Vergleich zu 10 mM FHE-POPC-Liposomen, so sind die erziel­ten Einschlussraten in Polymersomendispersionen deutlich höher als bei FHE-POPC-Liposomen. Schließlich können in 10 mM FHE-POPC-Liposomen nur maximal 1,3 % der eingesetzten Fe2+-Ionen eingeschlossen werden (s. S. 29). Dies spiegelt auch die Verwendung der Einschluss-Einheit µmolF e2+ wieder, die einen hinsichtlich der Lipid­ µmolLipid menge normierten Einschluss-Wert angibt. Für PB-PEO ergibt sich ein Einschluss von 0,25 µmolF e2+ und für POPC ein Einschluss von maximal lediglich 0,079 µmolF e2+ . Folg­ µmolLipid µmolLipid lichlassensichinPB-PEO-PolymersomenFe2+-Ionene.zienteralsinPOPC-Liposomen verkapseln, allerdings nur bei relativ geringen Lipidkonzentrationen. In einem Vergleichsexperiment wurden Polymersomendispersionen mit einer 60 mM FeCl2-Lösung hergestellt und mit zwei Dialyseschritten aufgereinigt. Solche Polymer­somendispersionen wiesen einen Fe2+-Gehalt von maximal 0,36 mM (mit FAAS be­stimmt) auf, was vergleichbar mit dem durchschnittlichen Wert für Ansätze mit 60 mM Fe2+-PDC-Komplex (s. Abb. 27) ist. Dieses Ergebnis zeigt, dass die Einschlussrate von Fe2+-IoneninPB-PEO-Polymersomennicht durchden EinsatzdesabschirmendenPDC-Liganden beein.usst wird. In späteren Experimenten wurden zudem Polymer.lme mit einer 500 mM FeCl2-Lösung, d.h. mit einer mehr als achtfach höheren Fe2+-Konzentration, in TRIS-HCl-Pu.er hy­dratisiert. Für REM-ESMA-Untersuchungen (ESMA -Elektronenstrahl-Mikroanalyse) wurden diese Dispersionen mit mindestens zwei zusätzlichen Dialyseschritten gegen H2O aufgereinigt, um externes FeCl2 bzw. den Pu.er vollständig abzutrennen. Durch den höheren osmotischen Druck, sowohl durch eine höhere interne Fe2+-Konzentration als auch durch den Einsatz von H2O als Dialysemedium, könnte ein größerer Anteil von Polymervesikeln undicht werden. Darauf deuten zumindest die Ergebnisse der Eisen­quanti.zierung solcher Polymersomendispersionen hin. Diese wiesen nach einer Dialyse 3.2 Einschluss von Fe2+-Ionen in Polymersomen in nur zwei Schritten, bei der nur noch eine extravesikuläre Eisenkonzentration von ca. 0,06mMvorliegt,einenimVergleichachtfachhöherenGehaltanEisenvon2,3 ± 0,3mM auf. Durch die zwei zusätzlichen Dialyseschritte gegen H2O sank der Eisengehalt in der Polymersomendispersion deutlich auf lediglich 0,42 mM. Dieser Wert liegt nur noch ge­ringfügig über dem oben aufgeführten Wert für aufgereinigte Polymersomendispersionen mit einer Startkonzentration von 60 mM FeCl2. 3.2.2 Diskussion -Fe2+-haltige Polymersomen PB-PEO-Polymersomen eignen sich zum Einschluss von 60 mM FeCl2 -bzw. Fe2+-PDC­Komplex-Lösungen. Die mittels FHE hergestellten 1,6 mM PB-PEO-Dispersionen wie­sen Polymersomen bis zu einer Größe von ca. 2 µm auf, wie lichtmikroskopische Un­tersuchungen zeigten. Obwohl unextrudierte Polymersomendispersionen eine sehr breite Größenverteilung aufwiesen, waren sie für mehrere Wochen stabil. Der Eisengehalt in aufgereinigten, Fe2+-haltigen Polymersomendispersionen konnte mit 1,10-Phenanthrolin analog zu POPC-Liposomen, allerdings mit einer modi.zierten Variante, bestimmt wer­den. Es wurden Fe2+-Gehalte von bis zu 0,4 mM bestimmt, was durch eine unabhängige Eisenbestimmung mittels FAAS abgesichert werden konnte. Der ermittelte Einschluss von ca. 0,7 % der eingesetzten Menge an Eisen ist vergleichbar mit den bekannten Wer­ten für die FHE [76]. Durch zusätzliche Extrusion von Fe2+-haltigen Polymersomen auf unter 200 nm sinkt der Eisengehalt nochmals deutlich. PB-PEO-Polymersomen weisen zudem vergleichbare Einschlussraten für Fe2+-Lösungen sowohl mit als auch ohne den Stabilisator PDC auf. Dies deutet auf eine geringe Wech­selwirkung des ungeladenen PB-PEO mit ionischen Spezies hin. Der Ein.uss des osmotischen Drucks während der Dialyse zeigte sich eindrucksvoll bei der Aufreinigung von mit 500 mM FeCl2-Lösung hydratisierten Polymersomendisper­sionen. Die für die ESMA notwendige Abtrennung von externem Pu.er durch Dialyse gegen H2O reduzierte den Eisengehalt in den so aufgereinigten Vesikeldispersionen auf lediglich ca. 0,4 mM. Die Dialyse weist also Nachteile für die Aufreinigung von Polymer­somendispersionen mit einer so hohen internen Eisenkonzentration auf. Dennoch stellt auch die GPC in diesem Fall aufgrund der auftretenden Verdünnung der Polymersomen­dispersionen keine brauchbare Alternative zur Dialyse dar. 3.3 Fällung von FeS in Polymersomen 3.3.1 Herstellung und Stabilität von FeS-haltigen Polymersomen Aufgereinigte, Fe2+-PDC-Komplex-haltige Polymersomendispersionen wurden zur Aus­fällung von intravesikulärem FeS mit H2S versetzt (s. Abb. 28). Eine Variante dafür ist die Zugabe eines H2S-gesättigten TRIS-HCl-Pu.ers. Alternativ kann H2S-Gas mit­tels Argon-Strom in die Polymersomdispersion eingeleitet werden. Es konnte jeweils eine deutlich erkennbare dunkle Verfärbung der rosa gefärbten Dispersionen insbesondere bei Inkubation mit H2S-Gas innerhalb von 10 -30 Sekunden beobachtet werden. Bei den er­haltenen, grau gefärbten Dispersionen ließ sich trotz inerter Lagerung schon nach einem Tag ein deutlicher Rückgang der Verfärbung erkennen, und die Dispersionen wiesen wie­der eine rosa Färbung auf. Mit einer 500 mM oder 1000 mM FeCl2-Lösung hergestellte, aufgereinigte Polymersomendispersionen verfärbten sich bei der Inkubation mit gasför­migem H2S zunächst orange und dann rasch schwarz (s. Abb. 29). Solche Dispersionen blieben bei inerter Lagerung bis zu fünf Wochen lang dunkel verfärbt. In Polymersomendispersionen, die sich während der inerten Lagerung entfärbt hatten, konnte unabhängig von der eingesetzten Fe2+-Konzentration durch erneute Inkubation mit H2S abermals eine dunkle Verfärbung induziert werden. Allerdings war auch diese dunkle Verfärbung nur wenige Stunden bis zwei Tage stabil. Mögliche Ursachen für die beobachtete Reversibilität der FeS-Fällungsreaktion wurden in Folgeexperimenten noch eingehender untersucht (s. Kapitel 3.3.4). Des Weiteren wurde bei praktisch allen durch die Inkubation mit H2S anhaltend dunkel verfärbten Polymersomendispersionen die Bildung geringer Mengen eines weißen Rück­stands nach 24 -72 Stunden beobachtet. Bei Proben, die sich alsbald nach der dunklen 3.3 Fällung von FeS in Polymersomen (a) über orange (b) und grau (c) bis schwarz (d) Verfärbung wieder entfärbt hatten, bildete sich kein solcher Rückstand. Zudem wurde eine raschere Bildung des weißen Rückstands bei Lagerung an Luft im Vergleich zu inert gelagerten Proben beobachtet. Eine Analyse des mit H2O gewaschenen weißen Rück­stands mittels Massenspektrometrie (Elektrospray-Ionisation) und der Vergleich mit ei­nem Referenz-Massenspektrum zeigten, dass sich eindeutig Schwefel S8 im Rückstand be.ndet. Dies belegen der Molpeak bei m/z = 264 und das für S8 charakteristische Fragmentierungsmuster (s. Abb. 71, S. 183 im Anhang). Die aufgenommenen Massen­spektren geben indes keine Anhaltspunkte dafür, dass sich auch PB-PEO, Zersetzungs­produkte davon oder andere organische Substanzen in dem weißen Rückstand be.nden. Der Schwefel in der Probe ist höchstwahrscheinlich das Resultat einer Oxidation von H2S in den präparierten Dispersionen. Die Oxidation von H2S könnte durch nicht zu eliminierende Spuren von Luftsauersto. und Lagerung an Licht [83] oder aber durch Fe3+-Ionen [84] erfolgen. Die Stabilität von PB-PEO-Polymersomen gegenüber FeS wurde analog zu POPC-Liposomen in Vesikelstabilitätstests in Zusammenarbeit mit K. Rüdel (Lehrstuhl für Pharmazeutische Technologie) untersucht. Dazu wurde ein PB-PEO-Polymer.lm mit TRIS-HCl-Pu.er hydratisiert, die erhaltene Dispersion auf Partikel mit einem Durch­messer von ca. 140 nm extrudiert und anschließend mit einer 5 mM FeS-Suspension in TRIS-HCl-Pu.er versetzt. Die zeitliche Stabilität der PB-PEO-Polymersomen wurde mittels PCS verfolgt. Dabei zeigte sich, dass PB-PEO-Polymersomen mehr als 48 Stun­den in Gegenwart von FeS-Partikeln stabil sind. Die PCS-Daten belegen, dass sich die mittlere Größe der Polymersomen praktisch nicht verändert, wohingegen eine Zunahme des PDI von 0,124 auf 0,242 zu beobachten ist. Begleitende Cryo-TEM-Untersuchungen der Proben zeigten, dass sich PB-PEO-Polymersomen in Gegenwart von FeS-Partikeln zwar leicht in der Form hin zu Ellipsoiden, hingegen nicht in der Größe verändern. Ergänzend zu diesen Untersuchungen wurde die Größenstabilität von mit 60 mM Fe2+­PDC-Lösung hergestellten, extrudierten Polymersomendispersionen nach der Inkubati­on mit H2S untersucht. Nach der Aufreinigung wurden die Polymersomen (Z-Average: 138,4 nm mit PDI = 0,127) zum einen mit H2S-gesättigtem TRIS-HCl-Pu.er und zum anderen direkt mit H2S-Gas behandelt. Dabei veränderte sich im ersten Fall der Z-Average und PDI nach der Inkubation praktisch nicht, während im Fall der Inkubation mit gasförmigem H2S zunächst ein Anstieg des Z-Average auf 211,2 nm und des PDI auf 0,229 gemessen wurde. Gleichwohl wies diese Dispersion bei PCS-Messungen nach fünf Tagen wieder vergleichbare Parameter wie vor der Inkubation auf. Auch die anders inkubierte und die nicht inkubierte Dispersion wiesen nach 5 Tagen einen vergleichba­ren Z-Average und PDI auf. Die reversible Veränderung von Z-Average und PDI in der mit gasförmigem H2S inkubierten Probe könnte zum einen auf eine Reversibilität der FeS-Fällung hindeuten (s. Kapitel 3.3.4). Andererseits ist es auch möglich, dass in der Dispersion noch vorhandene kleine H2S-Gasblasen zunächst die Messung beein.ussen. Solche Gasblasen hätten sich indes nach mehreren Tagen vermutlich aufgelöst. 3.3.2 Spektroskopische Verfolgung der Bildung von FeS in Polymersomen Zur spektroskopischen Verfolgung der Vorgänge bei der Reaktion des intravesikulären Fe2+-PDC-Komplexes mit zugesetztem H2S erfolgten UV/Vis-Untersuchungen. Da bei der Inkubation mit H2S-Gas schon nach weniger als 30 Sekunden keine Farbänderung der Dispersion mehr erkennbar war, musste H2S in „verdünnter“ Form eingesetzt werden, um den Prozess der FeS-Fällung zu verlangsamen und ihn angemessen mittels UV/Vis-Spektrokopie verfolgen zu können. Dies konnte durch den Einsatz einer 25 mM H2S­Lösung in TRIS-HCl-Pu.er bewerkstelligt werden. Da Polymersomen einfallendes Licht intensiv streuen, weist das UV/Vis-Spektrum von aufgereinigten, Fe2+-PDC-Komplex-haltigen Polymersomendispersionen eine charakte­ristische Streulichtkurve über den gesamten Messbereich auf. Die Streulichtkurve über­ 3.3 Fällung von FeS in Polymersomen lagert sich dabei mit der Absorptionsbande des Fe2+-PDC-Komplex, welche bei Wellen­längen von 420 -600 nm detektiert wird (s. Abb. 30a). Der zeitliche Verlauf der Inkubation von aufgereinigten, Fe2+-PDC-Komplex-haltigen PolymersomenmiteinerTRIS-HCl-Pu.erlösungmit25mMgelöstenH2SwurdeUV/Vis­spektroskopisch verfolgt, beginnend beim frühestmöglichen Zeitpunkt t0, 120 Sekun­den nach dem Mischen der Dispersionen. Um den störenden Ein.uss der Lichtstreuung durch die Polymersomen zu eliminieren, wurde von den aufgenommenen Spektren das Ausgangsspektrum zum Zeitpunkt t0 subtrahiert (Abb. 30b). Die erhaltenen Graphen zeigen deutlich, dass sich im Verlauf der Inkubation die Absorption genau im Bereich der Absorptionsbande des Fe2+-PDC-Komplexes kontinuierlich verringert. Dies ist auf die Verringerung der verfügbaren Fe2+-Konzentration durch Ausfällung zurückzuführen. Gleichzeitig steigt die Absorption im Wellenlängenbereich unter 400 nm. Dies kann der Bildung von Partikeln bzw. Aggregaten zugeschrieben werden und ist ein Indiz für die Bildung von FeS-Aggregaten. Die Beschreibung der auftretenden E.ekte ist nur phä­nomenologisch, da hier die FeS-Fällungsreaktion sichtbar verlangsamt im Vergleich zur Inkubation mit H2S-Gas auftritt. Es wird diskutiert, dass die Geschwindigkeit der intra­vesikulären Metallsul.d-Fällungsreaktion abhängig von der Menge des in die Dispersion eingebrachten Fällungsreagenz H2S ist [20]. Allerdings zeigten neuere Untersuchungen, dass die Permeation von H2S ins Vesikelinnere nicht der geschwindigkeitsbestimmende Schritt der Fällungsreaktion ist [18]. Vielmehr scheint die Geschwindigkeit der intravesi­kulären Bildung von Metallsul.den, betrachtet am Beispiel von CdS, durch komplexere Interaktionen von sul.dischen Spezies mit anderen Komponenten des Vesikelinneren bzw. der -membran bestimmt zu sein [18]. 3.3.3 Lokalisierung des FeS-Niederschlags in Polymersomen Makroskopische Untersuchungen Um abzusichern, dass der beobachtete Prozess der FeS-Fällung auch tatsächlich im Inne­ren von Fe2+-haltigen Polymervesikeln abläuft, wurden geeignete Versuchsserien durch­geführt und photographisch dokumentiert (s. Abb. 31 und 32). In aufgereinigten, leicht rosagefärbten,Fe2+-PDC-Komplex-haltigenPolymersomendispersionenmiteinemFe2+­Gehaltvonca.0,35mMgehtdieFeS-FällungdurchInkubationmitH2S,selbstinGegen­warteines 30-fachenÜberschusses (15mM) an externem EDTA, vonstatten (s. Abb.31). Leere Polymersomen mit extern zugesetzter 0,5 mM Fe2+-PDC-Komplex-Lösung verfär­ben sich zwar bei Inkubation mit H2S ebenfalls dunkel (s. Abb. 32, links oben). Indes verschwindet die rötliche Färbung der Dispersion bei Zusatz eines EDTA-Überschusses und eine dunkle Verfärbung bei Inkubation mit H2S kann nicht mehr beobachtet werden (s. Abb. 32, links unten). Somit muss die beobachtete Fällungsreaktion in aufgereinig­ten, Fe2+-haltigen Polymersomen intravesikulär ablaufen. Die inhibierende Wirkung von EDTA auf die FeS-Fällung konnte auch in Abwesenheit von Vesikeln eindrucksvoll be­legt werden (s. Abb. 32, rechts). Bereits die Zugabe einer äquimolaren Menge an EDTA genügt, um die Fällung von FeS aus einer 0,5 mM Fe2+-PDC-Komplex-Lösung durch Inkubation mit H2S zu verhindern. DurchZusatzvonTHFwerdenFe2+-haltigePolymersomeninderDispersionzerstört.Ei­ne, wenngleich deutlich abgeschwächte, farbliche Veränderung der entstandenen Lösung bei der Inkubation mit H2S ist dennoch weiterhin zu beobachten (s. Abb. 31, rechts). Wird vor dem Mischen mit THF eine bezüglich der Fe2+-Ionen äquimolare Menge EDTA zugesetzt, kannkeine Verfärbungder LösungbeiInkubation mit H2S beobachtet werden. Dies belegt zusätzlich, dass die FeS-Fällung innerhalb der Polymersomen abläuft. 3.3 Fällung von FeS in Polymersomen Abb. 31: Versuchsschema zum Nachweis der intravesikulären FeS-Fällung in aufgereinigten, Fe2+-PDC-Komplex-haltigen PB-PEO-Polymersomen bei Inkubation mit H2S-Gas (oben); Startkonzentration: 60 mM Fe2+-PDC-Komplex; Kontrolle (links unten): FeS-Fällung auch bei Gegenwart eines 30-fachen Überschusses an externem EDTA zu beobachten; unten rechts: Solubilisierung von Fe2+-haltigen Polymersomen mit THF lässt eine Reaktion von Fe2+-Ionen mit H2S immer noch zu (nach [53]) Abb. 32: Versuchsschemata zur Verdeutlichung des inhibierenden Ein.usses von EDTA auf die FeS-Fällung; oben: FeS-Fällung aus einer 0,5 mM Fe2+-PDC-Komplex-Lösung ohne(rechts)sowieinGegenwartvon1,6mMpu.erhaltigenPB-PEO-Polymersomen (links) in Abwesenheit von EDTA beobachtbar; unten links und Mitte: generelle Inhibierung der FeS-Fällung aus einer Fe2+-PDC-Komplex-Lösung bei Zusatz eines EDTA-Überschusses; unten rechts: Zusatz von THF zu einer 0,5 mM Fe2+-PDC­Komplex-Lösung verhindert FeS-Fällungsreaktion bei Inkubation mit H2S-Gas nicht (nach [53]) 3.3 Fällung von FeS in Polymersomen somen vor (a) und nach (b) der Inkubation mit 25 mM H2S-Lösung in TRIS-HCl- Pu.er; Fixierung der Vesikel auf dem Objektträger mit Poly-L-Lysin Lichtmikroskopische Untersuchungen Ergänzend zum makroskopischenNachweisderintravesikulären FeS-Fällungsollteinmi­kroskopischen Untersuchungen die FeS-Fällung in diskreten Vesikeln visualisiert werden. Da sich in unextrudierten Polymersomendispersionen auch Vesikel mit einem Durchmes­ser im einstelligen Mikrometerbereich be.nden, erfolgten zunächst lichtmikroskopische Untersuchungen. Für die Untersuchungen wurden aufgereinigte, Fe2+-PDC-Komplex­haltige Polymersomendispersionen vor und nach der Inkubation mit H2S mittels Licht­mikroskopie (Durchlicht) charakterisiert. Dazu wurden die Polymersomen auf einem Ob­jektträger mit Poly-L-Lysin .xiert. Repräsentative Aufnahmen dieser Untersuchungen zeigen, dass sich vor der Inkubation mit H2S nur Vesikel ohne erkennbare dunkle Schatten in der Probe be.nden (Abb. 33a). In der mit H2S inkubierten Probe weist indes eine Vielzahl von Vesikeln eindeutig er­kennbare dunkle Niederschläge auf (Abb. 33b). Die genaue Lokalisierung der dunklen Niederschläge kann gleichwohl nicht ermittelt werden, da die vesikulären Strukturen nicht mehr klar voneinander abgegrenzt vorliegen. Dennoch zeigen die dunklen Aggre­gate eine mögliche Ursache für die dunkle Verfärbung von mit H2S inkubierten Polymer­somendispersionen. Elektronenmikroskopische Untersuchungen Ergänzend zu den lichtmikroskopischen Untersuchungen wurden verschiedene elektro­nenmikroskopische Methoden hinsichtlich ihrer Eignung zur Visualisierung und zum Nachweis der intravesikulären FeS-Fällung in diskreten Vesikeln getestet. Hierbei war die Herausforderung groß, die Probenpräparation unter inerten Bedingungen zu bewerk­stelligen. Dies ist von enormer Bedeutung, da die zu erwartenden FeS-Aggregate im Nanometerbereich und aufgrund der großen Ober.äche besonders oxidationsemp.ndlich sind [85]. Bei TEM-Untersuchungen sollten sich eisenhaltige Aggregate aufgrund der höheren Ordnungszahl von Eisen im Vergleich zu den konstituierenden Elementen des PB-PEO Kohlen-, Sauer-und Wassersto. deutlich durch ihren dunklen Kontrast von ihrer Umgebung abzeichnen. TEM-Untersuchungen In TEM-Untersuchungen wurden aufgereinigte, Fe2+-PDC-Komplex-haltige Polymerso­men vor und nach der Inkubation mit H2S charakterisiert. Die Proben wurden auf ei­nem Grid aufgetragen, eingetrocknet und nach einem ggf. notwendigen Waschschritt mit H2Ountersucht. Mit dieser Methode wurden indes nur mäßigaussagekräftige und zudem schlecht reproduzierbare Ergebnisse erhalten. In mehreren Proben, die zuvor mit H2S inkubiert wurden, konnten dunkel kontrastierte Vesikel als dominierende Spezies neben 3.3 Fällung von FeS in Polymersomen vereinzelt au.ndbaren Vesikeln mit deutlich erkennbaren dunklen, vermutlich internen Aggregaten beobachtet werden (s. Abb. 34). Dabei kann der dunkle Kontrast von großen Vesikeln auf das große interne Volumen zurückgeführt werden, das den Elektronenstrahl beimDurchgangstärkerschwächtalsderintravesikuläreRaumkleinerVesikel(s.Abb.34 links). Dieser E.ekt bewirkt, das große Vesikel mit dunklerem Kontrast erscheinen als kleinere Vesikel. Die beobachteten dunklen Aggregate scheinen intravesikulär zu sein, konnten aber im Verlauf der TEM-Untersuchungen nicht näher charakterisiert werden. Es fällt außerdem auf, dass alle Vesikel < 100 nm keine erkennbaren intravesikulären Aggregate und auch größere Vesikel nur selten interne Aggregate aufweisen. Um die auftretende FeS-Fällungsreaktion auch in diskreten Vesikeln nachweisen zu kön­nen, müssen die gebildeten Aggregate hinreichend groß sein. Da dies bei den zuerst präparierten Proben nicht der Fall war, könnte eine Erhöhung der Menge an intra­vesikulären Fe2+-Ionen zur Bildung von potenziell größeren und damit detektierbaren FeS-Niederschläge führen. Darum wurden in Folgeexperimenten zum einen Vesikel mit einem Durchmesser im Mikrometerbereich mittels REM-EDX zur Detektion und zur Elementanalyse von potenziellen FeS-Aggregaten untersucht. Zum anderen wurden Ve­sikeldispersionen mit höheren Fe2+-Konzentrationen (500 mM FeCl2) hergestellt und nach Inkubation mit H2S mittels Cryo-TEM charakterisiert. Cryo-TEM-Untersuchungen Für höhere intravesikuläre Eisengehalte wurden Polymersomen mit einer 500 mM FeCl2 ­LösunghydratisiertundmittelsDialyseaufgereinigt.PDCkamalsStabilisatornichtzum Einsatz, da PDC mit Fe2+-Ionen einen kristallinen Feststo. bei Fe2+-Konzentrationen über 60 mM bildet. Ohne Stabilisator konnte die Bildung von Fe(OH)2-Niederschlägen allerdings nicht ausgeschlossen werden, denn es wurde bei einem pH-Wert von 7,4 gear­beitet (vgl. Kapitel 2.2). Die Bildung von Fe(OH)2-Niederschlägen ist jedoch unproble­matisch aufgrund der Tatsache, dass sich aus Fe(OH)2 durch die Reaktion mit Schwefel­wassersto. FeS bildet, wie Vergleichsexperimente zeigten. Die Ursache dafür liegt in den unterschiedlichen Löslichkeitsprodukten von FeS und Fe(OH)2, wobei FeS das niedrigere Löslichkeitsprodukt aufweist [63]. FeCl2-haltige Polymersomen wurden nach der inerten Präparation mit H2S inkubiert, wobei eine dunkle Verfärbung beobachtet werden konnte (s. Abb. 29). In anschließen­den Cryo-TEM-Untersuchungen wurden Proben vor sowie nach der Inkubation mit H2S untersucht. Es zeigte sich, dass sich bei der Hydratisierung ausschließlich unilamellare Vesikel gebildet hatten. Zudem weisen deutlich über 50 % der Polymersomen in der nicht inkubierten Probe eindeutig intravesikuläre Aggregate auf (s. Abb. 35 links). Der dunkle Kontrast weist auf eisenhaltige Aggregate hin. Diese sind vermutlich Zusammenballun­gen von Fe(OH)2-Niederschlägen, da in dem Experiment kein stabilisierender Ligand wie PDC eingesetzt wurde. Durch die Inkubation mit H2S konnte eine dunkle Verfärbung der Dispersion makrosko­pisch beobachtet werden. Indessen ließen sich bei den Cryo-TEM-Untersuchungen nur in wenigen Fällen erkennbare intravesikuläre Aggregate detektieren. Die bei nicht in­kubierten Proben beobachteten Aggregate waren komplett verschwunden. Dafür wiesen wenige Vesikel kompakte, membran-assoziierte dunkle Aggregate auf (s. Abb. 35 rechts). Außerdem konnte eine schwache, dunkle Verfärbung von Polymersomenmembranen be­obachtet werden, die auf winzige FeS-Aggregate zurückzuführen sein könnte (s. Pfeile in Abb. 35 rechts). Mehrere Polymersomen weisen außerdem klar erkennbare Deformatio­nenauf und sindüberdiesnichtmehrsphärisch (vgl. bb. 35 links).Polymersomen vor der Inkubation mit H2S waren hingegen nahezu einheitlich sphärisch. Häu.g waren zudem fadenartige Strukturen zu erkennen, die auf eine Veränderung der Polymermembran und die Ausbildung anderer Packungsstrukturen des PB-PEO hindeuten (s. Abb. 35 rechts). Solche Strukturen wurden in einigen Fällen auch in anderen Proben beobachtet, für die 3.3 Fällung von FeS in Polymersomen eine ältere PB-PEO-Charge verwendet wurde. Die Inkubation mit H2S verändert also o.ensichtlich bei einem Teil der Polymersomen die Form und hat auch einen gewissen Ein.uss auf die Stabilität des PB-PEO (Auftreten anderer Packungsstrukturen). Durch die Erhöhung des Eisengehalts in Polymersomen konnten somit zwar Hinweise auf die Bildung von FeS-Aggregaten in Form kleiner, membranständiger Aggregate ge­funden werden. Gleichwohl scheinen sich keine diskreten FeS-Partikel zu bilden, die groß genug sind, um eindeutig mittels Cryo-TEM detektiert zu werden. Die Schwierigkeit, in­travesikulär gebildete Metallsul.de mittels Elektronenmikroskopie zu detektieren, wird auch in der Literatur [19] beschrieben. Dort wird vermutet, dass sich die gebildeten Metallsul.dpartikel von wenigen Nanometern Größe als dünne Schicht an der inneren Vesikelober.äche ablagern [19]. REM-EDX-Untersuchungen eingetrockneter Proben Zur Untersuchung von aufgereinigten, Fe2+-haltigen Polymersomen mit Größen im Mi­krometerbereicherfolgtenrasterelektronenmikroskopischeUntersuchungen.DieWechsel­wirkung desElektronstrahlsmitderProbeführtzurFreisetzungvonElektronenundvon Röntgenstrahlung aus der Probe. Diese freigesetzten Elektronen sowie charakteristische Röntgenstrahlung aus der Probe können Aufschluss über die Art und die Lokalisierung von Elementen in der Probe geben. Eine Auswahl der an der Probenober.äche generier­ten Elektronen und der elektromagntischen Strahlung samt der notwendigen Detektoren zur Analyse derselben ist in Abb. 36 dargestellt. Der auf die eingetrocknete Probe tref­fende Primärelektronenstrahl generiert bei ausreichender Leitfähigkeit der Probe u.a. Sekundärelektronen (SE), die aus einer Tiefe von ca. 1 -10 nm unter der Probenober­.äche stammen [86] und somit Auskunft über die Topographie der Probe geben können. Zudem können so genannte Rückstreuelektronen (BSE), die aus einer Tiefe von ca. 10 ­1000 nm stammen [86] und somit eine Tiefeninformation geben, mit einem geeigneten Detektor registriert werden. Schließlich können die in der Probe enthaltenen Elemente anhand der charakteristischen Röntgenstrahlung, die bei der Wechselwirkung der Atome mitprimären odersekundärenElektronenfreigesetzt wird, mithilfe einesEDX-Detektors identi.ziert werden [86]. Zunächst mussteeinegeeignetePräparationfürdieREM-Untersuchungengefundenwer­den. Als optimal erwies sich die modi.zierte Aufreinigung von Fe2+-haltigen Polymer­somendispersionen mit einem zusätzlichen Dialyseschritt gegen destilliertes H2O. Nach tronenmikroskopie REM (links) und REM-Aufnahme (SE-Detektor) von aufgerei­ nigten, Fe2+-PDC-haltigen Polymersomen nach Inkubation mit H2S (rechts) einer ggf. erfolgten Inkubation mit H2S wurden 10 µl der Probe auf einen Silizium-Wafer aufgetragen. Nach dem Eintrocknen war kein zusätzlicher Waschschritt mit destilliertem H2O zur Abtrennung von externem Pu.er notwendig. Ein solcher Waschschritt erwies sich als unpraktikabel. Eine REM-Aufnahme einer so präparierten Polymersomenprobe mit SE-Detektor ist in Abb. 36, rechts zu sehen. Es sind diskrete Vesikel mit einer Größe von einigen Hundert Nanometern zu erkennen. Um Aussagen zur Lokalisierung des gebildeten FeS-Niederschlags in diskreten Vesikeln zu erhalten, wurden aufgereinigte, Fe2+-haltige Polymersomendispersionen mit H2S in­kubiert.NachderPräparationaufeinemSiliziumwaferwurdendieProbenmiteinemSE­Detektor bei unterschiedlichen Anregungsenergien untersucht, um die Ober.äche bzw. das Innere der präparierten Polymersomen zu charakterisieren. „Schwere“ Elemente mit höherer Ordnungszahl wie Eisen weisen dabei einen helleren Kontrast im Vergleich zu „leichten“ Elementen wie Kohlensto. und Sauersto. auf [86]. Bei niedrigen Anregungsenergien des Primärelektronenstrahls von 0,8 -2 keV sind mit dem SE-Detektor keine hellen Kontraste zu erkennen (Abb. 37a, b). Folglich sind keine schweren Elemente, d.h. kein Eisen, in und auf der Membran vorhanden. Hingegen ist ei­ne Art Ausbeulung der Vesikelmembran, die auf einen internen Niederschlag hinweist, in Abb. 37a deutlich sichtbar. Bei einer höheren Anregungsenergie von 7 keV, bei der auch ein Teil des Vesikelinneren mit angeregt wird [86], sind weiße Bereiche in einigen Vesi­ 3.3 Fällung von FeS in Polymersomen men nach Inkubation mit H2S bei Anregungsenergien von 0,8 keV (a), 2 keV (b) und 7 keV (c) keln sichtbar (Abb. 37c), die die Anwesenheit von Elementen mit höherer Ordnungszahl beweisen. Aufnahmen derselben Probe mit einem BSE-Detektor, der eine Information über das Vesikelinnere liefert, zeigen vergleichbare helle Bereiche in Vesikeln. Die Ergebnisse bei verschiedenen Anregungsenergien (SE-Detektor) und die Untersu­chung mit BSE-Detektor weisen folglich auf eine intravesikuläre Bildung eines Nieder­schlags mit einem schweren Element hin. Da Eisen das Element mit der mit Abstand höchsten Ordnungszahl in der Probe ist, sollte der Niederschlag eisenhaltig sein. Um die potenzielle Zusammensetzung des Niederschlags zu ermitteln, erfolgten an iden­tisch präparierten Proben (einer aufgereinigten, Fe2+-haltigen Polymersomendispersi­on nach Inkubation mit H2S) REM-EDX-Untersuchungen. Mittels REM-EDX können die in einem de.nierten Probenareal vorliegenden Elemente anhand ihrer charakteris­tischen Röntgenstrahlung identi.ziert werden [86]. Es konnte eindeutig das Vesikel­assoziierte Vorliegen von Fe und S anhand der K-Linien im EDX-Spektrum bestätigt werden (Abb. 38, rote Linie). Bei Vergleichsmessungen in der Umgebung von diskreten Vesikeln konnten weder Fe noch S detektiert werden (Abb. 38). Zudem konnten die in der Probe ebenfalls vorliegenden Elemente C, O und Cl sowie Si vom Probenträger de­tektiert werden. Die vesikel-assoziierte Colokalisation von Fe und S ist ein weiterer Beleg für die intrave­sikuläre FeS-Fällung, da in die Probe eingebrachtes H2S die einzige Schwefelquelle ist. Indessen würde H2S, falls es keinen FeS-Niederschlag bildet, beim Eintrocknen aus der Dispersion hinausdi.undieren und nicht mehr mit EDX nachweisbar sein. 3.3.4 Reversibilität der FeS-Fällungsreaktion in Polymersomen Die in aufgereinigten, Fe2+-haltigen Polymersomendispersionen beobachtete dunkle Ver­färbungbeiderInkubationmitH2Serwiessichalszeitlichnichtstabil.DasVerschwinden der dunklen Verfärbung kann verschiedene Ursachen haben. Eine erste Möglichkeit ist die Oxidation der gebildeten, sehr oxidationsemp.ndlichen FeS-Partikel durch Luftsau­ersto.. Diese Möglichkeit ist unwahrscheinlich, da begaste Proben unter inerten Be­dingungen präpariert und gelagert wurden. Als zweites ist denkbar, dass Vesikel mit intern gebildetem FeS während der Lagerung undicht werden und extern vorhandenes EDTA in die Vesikel eindringt. Dies könnte zur Au.ösung von vorhandenen FeS-NP in Polymersomen führen. Auch diese Erklärung ist unwahrscheinlich, da eine wiederholte Inkubation entfärbter Polymersomendispersionen mit H2S erneut eine dunkle Verfär­bung induziert. Würden Fe2+-Ionen in Form eines EDTA-Komplexes vorliegen, würde keineFeS-Fällungstatt.nden.EinedritteErklärungerscheintplausibler.Sokönntensich gebildete FeS-Partikel aufgrund abnehmender H2S-und damit S2--Konzentration in der Polymersomendispersion wieder au.ösen, da das FeS-Fällungsgleichgewicht (s. Reakti­on 2) wieder auf die linke Seite verschoben wird. Bei der Lagerung in Abwesenheit von H2S könnte dies die Ursache für das Verschwinden der Verfärbung darstellen. 3.3 Fällung von FeS in Polymersomen Fe2+ +S2- .(2) FeS. Denn beim Einschluss einer 60 mM Fe2+-PDC-Komplex-Lösung in Polymersomen er­folgte der Rückgang der bei der H2S-Inkubation beobachteten dunklen Verfärbung schon innerhalb von 24 Stunden. Der Rückgang wurde trotz Lagerung unter Argon beobach­tet. Erfolgte hingegen nach der Inkubation mit H2S die Lagerung unter einer inerten H2S-Atmosphäre, blieb eine dunkle Verfärbung deutlich länger bestehen. Unter diesen Bedingungen blieben mit einer 60 mM FeCl2-Lösung hydratisierte und anschließend aufgereinigte Polymersomen mehr als neun Wochen lang nach der Inkubation mit H2S dunkel verfärbt. Bei Einsatz von deutlich höheren Fe2+-Konzentrationen von 500 mM blieb die auftre­tende dunkle Verfärbung auch bei Lagerung unter Argon deutlich länger für eine oder mehrere Wochen bestehen. Eine mögliche Erklärung hierfür kann die Bildung von mehr oder auch größeren FeS-Partikeln sein. In ergänzenden Untersuchungen sollte geklärt werden, ob sich die phänomenologisch be­schriebene Reversibilität der FeS-Fällung auch mittels REM-EDX belegen lässt. Von der Annahme ausgehend, dass sich gebildetes FeS bei abnehmender H2S-Konzentration in der Vesikeldispersion wieder au.öst, wurden in Vergleichsexperimenten CdS-haltige Po­lymersomen unter analogen Bedingungen hergestellt. CdS weist ein im Vergleich zu FeS mol2 um mehr als acht Größenordnungen niedrigeres Löslichkeitsprodukt von KL = 10-27 l2 auf [63] und ist somit deutlich schwerlöslicher als FeS. Darum sollten in Polymersomen gebildete CdS-Partikel unter identischen Lagerungsbedingungen signi.kant stabiler als FeS-Partikel sein. Als Analysenmethode zum Vergleich verschiedener Lagerungsbedingungen bot sich die ESMA an. Mit dieser Methode kann der prozentuale Anteil aller vorhandenen Elemente in dem untersuchten Bereich der Probe ermittelt werden. Aus den prozentualen Anteilen der einzelnen Elemente können bei ausreichender Analytenmasse normierte Elementkon­zentrationen von Fe, Cd und S bestimmt werden, die dann zum Vergleich verschiedener Proben herangezogen werden können. Um ausreichende Mengen der zu bestimmenden Elemente für die ESMA zu gewährleisten, wurden Polymersomenproben durch intensi­ves Überleiten von Argon zunächst eingeengt, um eine höhere Polymersomenkonzentra­tion zu erreichen. Anschließend wurden die aufkonzentrierten Polymersomendispersio­nen mit H2S inkubiert und dann unter Argon-haltiger H2S-Atmosphäre, unter Argon-Atmosphäre sowie an Luft gelagert. Mit der Präparation wurden Polymer.lme, nicht diskrete Vesikel, auf dem Probenträger aufgebracht und untersucht, um eine ausreichen­de Menge der Analyten für eine qualitative EDX-Analyse zu gewährleisten. Ist die Verringerung der H2S-Konzentration in der Polymersomendispersion tatsächlich die Ursache für das Au.ösen von FeS-Partikeln, so sollte in der FeS-haltigen Polymer­somendispersion die Konzentration von Schwefel (im Vergleich zur Fe-Konzentration) bei Lagerung unter Argon bzw. an Luft deutlich geringer als bei der Lagerung unter H2S sein. Für CdS-haltige Polymersomen hingegen sollten die Lagerungsbedingungen wenig Ein.uss auf die normierte S-Konzentration in den Proben haben. Die Ergebnisse der REM-EDX-Untersuchungen für Polymersomen, die mit einer Startkonzentration von 60 mM FeCl2 bzw. CdCl2 hergestellt wurden und schließlich nach der H2S-Inkubation 24 Stunden unter verschiedenen Bedingungen gelagert wurden, sind in Abb. 39 dargestellt. Es ist zu erkennen, dass FeS-haltige Polymersomen unabhängig von der Lagerung eine nahezu konstante Fe-Konzentration aufweisen. Überdies existiert eine starke Abhängig­keit der S-Konzentration von den Lagerungsbedingungen. So ist die S-Konzentration bei Lagerung unter H2S-Atmosphäre mehr als doppelt so hoch wie bei Lagerung an Luft und mehr als achtmal so hoch wie bei Lagerung unter Argon. Der höhere Schwefelge­ 3.3 Fällung von FeS in Polymersomen halt bei Lagerung an O2 im Vergleich zur Lagerung unter Argonatmosphäre kann mit der Oxidation von H2S zu elementarem Schwefel oder Sulfat durch Luftsauersto. oder durch unter diesen Bedingungen gebildeten Fe3+-Ionen [84] erklärt werden. Die Bildung von S8 aus FeS-haltigen Polymersomendispersionen bei Lagerung an Luft konnte mit­tels MS belegt werden (s. Kapitel 3.3.1). Die Ergebnisse der REM-EDX für FeS-haltige Polymersomen belegen somit eindeutig die Abnahme der S-Konzentration bei anderen Lagerungsbedingungen als unter H2S-Atmosphäre. Die Hypothese, dass die Abnahme der S-Konzentration auch das Au.ösen des FeS-Niederschlags zur Folge hat, wird durch die Resultate der REM-EDX-Untersuchungen von CdS-haltigen Polymersomen gestützt. Bei diesen werden bei unterschiedlichen Lagerungsbedingungen fast identische Konzen­trationsverhältnissevonCdzuSerhalten.LediglichbeiderunterArgongelagertenProbe wurde eine geringfügig niedrigere normierte Cd-Konzentration detektiert. Die Resultate der REM-EDX-Untersuchungen belegen die Koinzidenz der Abnahme der Schwefelkon­zentration (vermutlich in Form von S2-, HS- und H2S) und dem Rückgang der dunklen Verfärbung von FeS-haltigen Polymersomen bei Lagerung in Abwesenheit von H2S. Die Erhöhung der H2S-Konzentration in FeS-haltigen Polymersomendispersionen, die sich während der Lagerung entfärbt hatten, führte zu einer erneuten dunklen Verfärbung solcher Proben. Diese Beobachtung und die Ergebnisse der REM-EDX-Untersuchungen belegen, dass der maßgebliche Faktor für die Stabilität des intravesikulär ausgefällten FeS die H2S-Konzentration in der Polymersomendispersion ist. Ein Ein.uss der beiden anderen am Beginn des Kapitels angeführten möglichen Ursa-chenaufdieEntfärbungvonmitH2Sbegasten,Fe2+-haltigenPolymersomendispersionen konnte nicht bestätigt werden. Schließlich konnte bei der Begasung entfärbter Proben auchinGegenwarteinesÜberschussesanextravesikuläremEDTAeineWiederholungder FeS-Fällungsreaktion beobachtet werden. Folglich müssen die FeS-Fällungsreaktion, die Entfärbung und auch die erneute FeS-Fällung intravesikuläre Vorgänge sein, die durch die H2S-Konzentration in der Probe bestimmt werden (vgl. Abb. 31, 32). Frisch gefälltes, amorphes Eisensul.d weist eine deutlich höhere Reaktivität auf als ge­altertes FeS [50,87]. Von diesem Befund ausgehend wurde untersucht, ob sich die Lage­rung von FeS-haltigen Polymersomendispersionen bei erhöhter Temperatur positiv auf die Stabilität des FeS-Niederschlags auswirkt. Durch die erhöhte Temperatur werden Kristallisationsprozesse ausgelöst, wie sich in Vergleichsexperimenten zeigte. Die Tests bei verschiedenen Temperaturen waren auch in Hinblick auf die Charakterisierung der thermischen Stabilität von Polymersomen wichtig, da die Reaktion von FeS und H2S in Vesikeln bei erhöhten Temperaturen untersucht werden sollte. Es zeigte sich, dass FeS-haltige Polymersomendispersionen mehr als fünf Stunden bei Temperaturen von 85.C unter H2S-Atmosphäre stabil waren. Bei deutlich längeren Lagerungszeiten traten größere Aggregate in der Dispersion auf. Im Verlauf der Lagerung bei 60.C wurde das Auftreten von Aggregaten erst nach mehr als 24 Stunden beobachtet. Die Ergebnisse zeigen, dass FeS-haltige Polymersomen nicht ausreichend stabil für die von Drobner et al. [50] verwendeten Reaktionszeiten und -temperaturen (14 Tage bei 100.C) für die Reaktion von FeS und H2S sind. Dennoch sollten die intravesikulären FeS-Partikel auf­grund des sehr großen Ober.äche-Volumen-Verhältnisses eine hohe Reaktivität aufwei­sen (vgl. [88]). Somit könnte auch schon bei 60 -80 .C eine Umsetzung des gebildeten FeS in Polymersomen mit H2S erfolgen. Auch bei erhöhter Temperatur von 60.C bis 85.C gelagerte FeS-haltige Polymersomen konnten nach der Enfärbung durch erneute Inkubation mit H2S wieder dunkel verfärbt werden. 3.3.5 Diskussion -FeS-haltige Polymersomen Vesikelstabilitätstestsvonleeren,extrudiertenPolymersomeninGegenwartvonFeSzeig­ten, dass Polymersomen länger als 48 Stunden stabil gegenüber FeS sind. Während der mittlere Durchmesser konstant blieb, konnte eine Zunahme des PDI sowie in Cryo-TEM-Untersuchungen eine Veränderung der Form der Polymersomen hin zu mehr ellipsoiden Vesikeln beobachtet werden. Es wurden indes keine aggregierten Vesikel visuell oder bei Cryo-TEM-Aufnahmen beobachtet. Bei der Generierung von FeS in extrudierten, Fe2+­haltigen Polymersomen wurde zwar eine Größenzunahme mittels PCS festgestellt. Aller­dings wiesen die fraglichen Polymersomendispersionen nach fünf Tagen wieder dieselbe mittlere Vesikelgröße wie vor der Inkubation mit H2S auf. Da unter den Lagerungsbe­dingungen keinerlei Sedimentation beobachtet wurde, ist davon auszugehen, dass Poly­mersomen auch mit intravesikulärem FeS stabil sind. Die beobachtete Größenzunahme kann auf die Anwesenheit von H2S-Gasbläschen zurückzuführen sein, die sich nach fünf Tagen aufgelöst hätten. Zur Ausfällung von intravesikulärem FeS in aufgereinigten, Fe2+-haltigen Polymersomen eignen sich sowohl eine H2S-haltige Pu.erlösung als auch gasförmiges H2S. Letzteres be­wirkt eine deutlich raschere und intensivere Dunkelfärbung der inkubierten Proben. Dies liegt u.a. daran, dass das ungeladene H2S-Molekül die Spezies mit der höchsten Mem­ 3.3 Fällung von FeS in Polymersomen branpermeabilität[20]unterdenebenfallsimpH-abhängigenGleichgewichtvorliegenden HS--und S2--Ionen ist: H2S HS- + H+ S2- +2 H+ (3) BeiderBegasungmitH2SerfolgteinerascheErhöhungderH2S-KonzentrationohneVer­dünnung der Dispersion. Die beim Mischen einer Fe2+-haltigen Polymersomendispersion mit H2S-haltiger Pu.erlösung unvermeidliche Verdünnung dürfte für die Verlangsamung der FeS-Fällungsreaktion sowie eine visuell schwächere Verfärbung verantwortlich sein. Das intravesikuläre Fällungsreagenz von Fe2+-Ionen ist dennoch das in einer deutlich geringeren Konzentration vorliegende S2--Ion, welches im pH-abhängigen Gleichgewicht mit H2S steht (s. Reaktion 3). Bei dem im Inneren von Fe2+-haltigen Vesikeln vor­liegenden pH 7,4 beträgt die H2S-Konzentration das 105-fache der S2--Konzentration. Damit liegt im Gleichgewicht ein einziges S2--Ion neben ca. 100000 H2S-Molekülen vor. Dennoch sollte die Ausfällung von 99,9 % der Fe2+-Ionen als FeS bei diesem pH-Wert theoretisch schon bei einer intravesikulären H2S-Konzentrationen von 1 µM erfolgen. Dieser Wert ist mithilfe der pKS-Werte von H2S sowie dem Löslichkeitsprodukt von FeS mol2 von KL = 10-18 l2 [63] ermittelbar. Die Quanti.zierung von Eisen in aufgereinigten, Fe2+-haltigen Polymersomendispersionen ergab einen Wert von 0,35 mM (Abb. 27). Da dieser Wert die Fe2+-Gesamtkonzentration in der Vesikeldispersion angibt, das interne Volumen aber nur einen Teil des Gesamtvolumens ausmacht, liegt die intravesikuläre Fe2+-Konzentration deutlich höher. Um mindestens 99 % der intravesikulären Fe2+-Ionen als FeS auszufällen, muss die in­terne Fe2+-Konzentration auf 3,5 µM sinken und gleichzeitig das Produkt der Fe2+-und der S2--Konzentration höher als das Löslichkeitsprodukt von FeS sein. Folglich muss die S2--Konzentration = 2,9 · 10-13 mM sein. Der Zusammenhang zwischen der S2-­Konzentration und der H2S-Konzentration bei pH 7,4 ist in Abb. 40 dargestellt. Es ist zu erkennen, dass ab einer intravesikulären H2S-Konzentration von 0,1 µM die Vorausset­zung zur Ausfällung von mindestens 99 % der Fe2+-Ionen als FeS bei einer verbleibenden Fe2+-Konzentration von unter 10-5 mM gegeben sind. Zur Veranschaulichung der besonderen Bedingungen im Inneren von Polymervesikeln dient eine Kalkulation der Anzahl an S2--Ionen, die bei einer H2S-Konzentrationen von 1 mM und pH 7,4 in einem 1000 nm großen Vesikel statistisch im Gleichgewicht vor­liegen. Die Berechnung ergibt, dass durchschnittlich nur 2,6 S2--Ionen in einem Vesikel vorliegen. Diese geringe Menge sollte allerdings theoretisch zur FeS-Fällung ausreichen, da S2--Ionen durch die Fällung aus dem pH-abhängigen Gleichgewicht (vgl. Reaktion 3) entzogen werden und bei gepu.erter Lösung das Gleichgewicht auf die Seite der S2-­Ionen verschoben wird (Prinzip von LeChatelier). Fe2+-Ionen liegen in einem deutlichen Überschuss im Vergleich zu den S2--Ionen vor, da sich bei einem 1000 nm großen Vesikel mit einer internen Fe2+-Konzentration von 3 mM ca. 950000 Fe2+-Ionen bzw. mit einer internen Fe2+-Konzentration von 0,3 mM ca. 95000 Fe2+-Ionen im Vesikelinneren be­.nden. Bei der Quanti.zierung von aufgereinigten, Fe2+-haltigen Polymersomendisper­sionen wurde ein Fe2+-Gesamtkonzentration der Dispersion von ca. 0,35 mM erhalten. Die mittlere interne Fe2+-Konzentration liegt deutlich höher, da die Polymersomen nur einen Teil des Dispersionsvolumens einschließen. Da das Löslichkeitsprodukt von FeS im Vesikelinneren schon bei einer H2S-Konzentration von 0,1 µM deutlich überschritten wird, sollten durch die H2S-Inkubationsbedingungen mindestens 99 % der Fe2+-Ionen im Vesikelinneren als FeS ausgefällt werden. Verringert sich nach der Ausfällung von FeS die H2S-Konzentration in der Lösung wäh­rend der Lagerung, so verschiebt sich das Gleichgewicht zwischen H2S und S2--Ionen wieder auf die linke Seite. Eine Verringerung der Elementkonzentration von Schwefel in FeS-haltigen Polymersomendispersionen bei Lagerung an Luft oder Argon im Vergleich zur Lagerung unter H2S-Atmosphäre konnte mittels REM-EDX bestätigt werden. Diese Abnahme ist vermutlich auf das Entweichen von H2S zurückzuführen, das in gepu.er­ 3.3 Fällung von FeS in Polymersomen ter Lösung mit der Abnahme der Konzentration freier HS--und S2--Ionen einhergehen würde. Dadurch könnten sich auch intravesikuläre FeS-Aggregate au.ösen, wenn das Produkt der Fe2+-und der S2--Ionen unter das Löslichkeitsprodukt von FeS sinkt. Ein solcher Vorgang ist nur für sehr kleine FeS-Aggregate, die ein sehr großes Verhältnis von Ober.äche zu Volumen aufweisen, unter den speziellen Bedingungen der Komparti­mentierung denkbar. Für makroskopische FeS-Partikel ist eine solche Reversibilität der Fällungsreaktion nicht bekannt. DieoptischeAufhellungvonzuvordunkelverfärbten,FeS-haltigenPolymersomenkonnte durch eine erneute Erhöhung der H2S-Konzentration im Verlauf einer zweiten Inkuba­tion mit H2S wieder rückgängig gemacht werden. Diese wiederholte Ausfällung von FeS konnte auch in Gegenwart eines Überschusses an extravesikulärem EDTA statt.nden. Dies beweist, dass die ablaufenden Prozesse von FeS-Fällung, -Au.ösung und erneute -Ausfällung im Vesikelinneren statt.nden. Nur beim Einschluss von höheren Fe2+-Konzentrationen über 500 mM wird während der InkubationmitgasförmigemH2SkurzzeitigeineorangeVerfärbungderPolymersomendi­spersion beobachtet (s. Abb. 29). Dieser E.ekt könnte auf die besonderen Bedingungen der Sul.drierung von kompartimentierten Fe(OH)2-Aggregaten, d.h. die Umwandlung des Fe(II)-hydroxids in ein Eisensul.d, zurückzuführen sein [89]. Bei dieser Reaktion bilden sich FeS-Kristallisationskeime auf vorhandenen Fe(OH)2-NP, wobei als Zwischen­stufe FeS-Nanocluster mit besonderen optischen Eigenschaften gebildet werden könn­ten. Derartige Eigenschaften sind von einer Vielzahl von nanopartikulären Substanzen bekannt [13]. Das Wachstum dieser Nanocluster im Verlauf der Reaktion führt dann vermutlich zur Ausbildung von größeren, grau-schwarzen FeS-Aggregaten. Die bei der Inkubation von aufgereinigten Fe2+-PDC-Komplex-haltigen Polymersomen mit H2S auftretende Ausfällung von FeS konnte auch UV/Vis-spektroskopisch erfasst werden (Abb. 30). Es ist eindeutig eine zeitliche Abnahme der Absorptionsbande des Fe2+-PDC-Komplexes nach der Inkubation mit H2S zu beobachten. Gleichzeitig deutet die Zunahme der Streuintensität bei Wellenlängen unter 400 nm auf die Bildung von Partikeln hin. Vergleichbare Vorgänge wurden auch bei der UV/Vis-spektroskopischen Verfolgung der Inkubation einer 1 mM Fe2+-PDC-Lösung (in Gegenwart leerer POPC-Liposomen) mit H2S beobachtet (s. Abb. 14, S. 33). Der Nachweis der intravesikulären Ausfällung von FeS in Polymersomen konnte indirekt mithilfemehrererKontrollenunterVerwendungvonEDTAerbrachtwerden(Abb.31,32). Ein direkter Nachweis bzw. eine Visualisierung von intravesikulär gebildetem FeS in dis­kreten Vesikeln gestaltete sich schwierig. Zwar deuten lichtmikrokopische Aufnahmen auf die vesikelassoziierte Bildung von dunklen Aggregaten hin. Allerdings lieferten er­gänzende TEM-und Cryo-TEM-Untersuchungen keinen klaren Nachweis. Dies könnte mit einer zu geringen Größe der gebildeten FeS-Aggregate zusammenhängen. Auch in anderen Arbeiten wird von Schwierigkeiten bei der Visualisierung intravesikulärer Me­tallsul.de mittels TEM berichtet [19]. Durch die Erhöhung der intravesikulären Fe2+-Konzentration konnte zunächst die Bil­dung von intravesikulären, vermutlich hydroxidischen Niederschlägen in aufgereinigten, Fe2+-haltigen Polymersomen bei Cryo-TEM-Untersuchungen beobachtet werden. Die BildungdieserAggregatekannaufdiehoheFe2+-KonzentrationsowiedenfehlendenEin­satz eines stabilisierenden Komplexanden wie PDC bei dem vorliegenden pH-Wert von 7,4 zurückgeführt werden. Die Sul.dierung des Niederschlags, d.h. die Umsetzung des Hydroxids mit H2S [89], führte zum Au.ösen des Hydroxids, wie Cryo-TEM-Aufnahmen belegen. Indes konnte nur bei wenigen Vesikeln die Bildung eines membran-assoziierten Niederschlags beobachtet werden. Vielmehr wurde das Auftreten fadenartiger Struktu­ren an oder in der Polymersomenmembran beobachtet. Ob es sich um eine andersartige Struktur des verwendeten PB-PEO oder aber um winzige Aggregate von FeS handelt konnte nicht mit Sicherheit geklärt werden. Gleichwohl konnten REM-Untersuchungen an diskreten Polymersomen die Bildung von intravesikulärem FeS untermauern. Die Aufnahmen mittels SE-Detektor bei verschiede­nen Anregungsenergien belegen die Lokalisierung eines eisenhaltigen Niederschlags im Vesikelinneren. Das sich im Inneren von solchen Vesikeln mittels EDX-Detektor die Ele­mente Eisen und Schwefel nachweisen ließen, unterstützt die Annahme, dass es sich bei den visualisierten Niederschlägen um FeS handelt. Bei der Lagerung von frisch präparierten, FeS-haltigen Polymersomen unter inerter H2S­Atmosphäre bei erhöhten Temperaturen von 60 -85 .C zeigte sich, dass Polymersomen unter diesen Bedingungen zumindest einige Stunden bis einen Tag stabil sind. Damit eignen sich Polymersomen zumindest prinzipiell für Untersuchungen zur Reaktion von FeS und H2S (Berzelius-Reaktion) [84]. Hier sind zukünftige Untersuchungen vonnöten, die klären können, ob die Reaktion von FeS mit H2S im Inneren von Polymersomen unter den Stabilitäts-limitierenden Bedingungen von Polymersomen abläuft. 3.4 Alternative Zugänge zu metallsul.dhaltigen Polymersomen 3.4 Alternative Zugänge zu metallsul.dhaltigen Polymersomen Zusätzlich zu dem ausführlich angewendeten Prinzip des schrittweisen Einschlusses von Fe2+-Ionen in Vesikeln, deren Aufreinigung und die anschließende FeS-Ausfällung durch Inkubation mit H2S gibt es noch weitere Möglichkeiten, intravesikuläre Metallsul.de herzustellen. Zum einen ist es für die Herstellung leichter löslicher Metallsul.de wie Eisensul.d denk­bar, zunächst bei niedrigem pH-Wert (pH = 3) Fe2+-Ionen gemeinsam mit gelöstem H2S in Vesikeln einzuschließen und dann nach einer schnellen Aufreinigung (mittels GPC) extern eine Base (OH--Ionen) zuzugeben. Durch die Di.usion der OH--Ionen durch die Vesikelmembran sollte es zu einem Anstieg des internen pH-Wertes und da­mit zur internen Ausfällung von FeS kommen. Aufgrund eines Löslichkeitsproduktes von mol2 KL=10-18 l2 fällt FeS erst oberhalb von pH 4 aus [63]. Daneben bietet sich eine weitere Methode der homogenen, intravesikulären Metallsul.d-Fällung an. Dazu kann Thioacetamid zum Einsatz kommen, das als potenzieller H2S­Produzent mit den meisten Übergangsmetallsul.d-Kationen nicht direkt reagiert und somit zusammen mit z.B. Fe2+-Ionen in Vesikel eingeschlossen werden kann. Thioacet­amid zerfällt bei erhöhten Temperaturen (60.C bis 85.C) durch Säurekatalyse unter Bildung von H2S: CH3CSNH2 +2H2O -. CH3COONH4 +H2S (4) Die intravesikuläre Generierung von H2S aus Thioacetamid sollte dann bei Überschrei­tung des FeS-Löslichkeitsprodukts zur Ausfällung von FeS führen. Schließlich sollte auch der direkte Einschluss von FeS-NP in Polymervesikeln untersucht werden. 3.4.1 Polymervesikel mit Fe2+-Ionen und H2S bei niedrigem pH-Wert Es wurde eine Fe2+-Lösung in einem mit H2S gesättigten Citratpu.er (pH 3) hergestellt und dann zur Hydratisierung eines Polymer.lms verwendet. Nach der Aufreinigung kann durch die extravesikuläre Zugabe einer Base die Di.usion von OH--Ionen ins Innere in­duziert werden. Durch den Anstieg des internen pH-Wertes sollte die intravesikuläre Konzentration der S2--Ionen so stark ansteigen, dass das Löslichkeitsprodukt von FeS überschritten werden wird. Zum Einschluss von Metallkationen und gelöstem H2S in Vesikeln zur anschließenden Ausfällung von intravesikulären Metallsul.den sind keine Arbeiten bekannt. Allerdings gibt es Untersuchungen zur Permeabilität von H2S, die darauf hindeuten, dass H2S als lipophilesMolekülsehrraschundfastungehindertdurchLipiddoppelschichtendi.undie­ren kann [18,77,90]. Die besondere Herausforderung bei dieser Methode bestand darin, aufgereinigte Vesikeldispersionen hinreichend rasch herzustellen, bevor signi.kante Men­gen intravesikulären H2S durch die Vesikelmembran entweichen. Dass das Prinzip der FeS-Generation über diesen Weg funktioniert, konnte in Lösung gezeigt werden. So kann eine 60 mM Fe2+-Lösung in einem H2S-gesättigten Citratpu.er (pH 3) ohne Probleme hergestellt werden. Die schwach gelbliche Lösung verfärbt sich bei Zugabe einer geringen Menge konzentrierten NH3 rasch dunkel, und ein schwarzer Niederschlag fällt aus. Ausgehend von diesem positiven Befund wurde unter inerten Bedingungen eine 60 mM Fe2+-LösunginH2S-gesättigtemCitratpu.er(pH3)hergestellt.MitdieserLösungwurde ein PB-PEO-Polymer.lm hydratisiert, so dass eine 1,6 mM PB-PEO-Dispersion resul­tierte. Nach der Aufreinigung mittels Dialyse unter Verwendung von EDTA wurde eine farblose Dispersion erhalten. Durch den Zusatz von 10 µl konzentrierten NH3 zu 100 µl der erhaltenen Dispersion stieg der pH-Wert der Dispersion auf >11. Nach 15 Minuten war eine gelblich-graue Verfärbung der Dispersion erkennbar, die mehr als 24 Stunden bestehen blieb. In diesem Zeitraum konnten keinerlei Aggregate in der Dispersion beobachtet werden, was darauf hinweist, dass Polymersomen unter diesen Bedingungen stabil sind. Die beobachtete dunkle Verfärbung deutet auf die Bildung von FeS hin. Über diese phä­nomenologischen Beobachtungen hinaus erfolgten keine weiteren Untersuchungen der Vesikeldispersion. Dieser Ansatz wurde aufgrund der umfangreichen Freisetzung von H2S während der Dialyse nicht weiter verfolgt 3.4.2 Polymervesikel mit internem Thioacetamid und Metallsalzen Vorbemerkungen Thioacetamid (TAA) ist in der qualitativen Analyse von Bedeutung als Reagenz zur Generierung von H2S, da es gegenüber dem schwerer handhabbaren H2S den Vorteil be­sitzt,dass schwerlöslicheMetallsul.de direktaushomogenenLösungenausgefälltwerden können [63]. Das dafür notwendige H2S wird beim Zerfall von TAA bei höheren Tempe­raturen durch Säurekatalyse gebildet (s. Reaktion 4), wobei die Zerfallsgeschwindigkeit 3.4 Alternative Zugänge zu metallsul.dhaltigen Polymersomen des TAA mit steigender Temperatur zunimmt [91]. Die TAA-induzierte Metallsul.dfäl­lung im Sauren eignet sich insbesondere für schwerlösliche Metallsul.de wie PbS und CdS, die bei pH 0 ausgefällt werden können. Allerdings ist bekannt, dass die Fällungs­reaktion meist verzögert und nicht ganz quantitativ erfolgt [63]. Die Ausfällung von FeS durch Reaktion von Fe2+-Ionen mit TAA wurde bisher lediglich im Inneren eines porösen Silicats beschrieben [92]. Da FeS nur oberhalb von pH 4 quan­titativ ausgefällt werden kann, ist TAA als H2S-Bildner unter Säurekatalyse nicht zur FeS-Fällung prädestiniert. Immerhin ist eine intravesikulär induzierte CdS-Ausfällung durch Einsatz von TAA in Phospholipidvesikeln bekannt [93]. Die dort beschriebene Fällungsreaktion .ndet gleich­wohl bei Raumtemperatur und verzögert statt. Ausgehend von den o.ensichtlichen Einschränkungen bei der Wahl der Reaktionsbedin­gungen musste ein Pu.ersystem gefunden werden, das bei pH = 4 die Ausfällung von FeS durch TAA ermöglicht. Davon ausgehend sollten das Konzentrationsverhältnis von Fe2+-Ionen zu TAA optimiert werden und die Geschwindigkeit der FeS-Fällungsreaktion näher charakterisiert sowie Ausbeuten der Fällungsreaktion bestimmt werden. Da be­kannt ist, dass selbst deutlich schwerlöslichere Metallsul.de nicht quantitativ mit TAA ausgefällt werden, konnte auch für FeS nicht mit einer quantitativen Ausfällung gerech­net werden. Dennoch sollte aufbauend auf den Erfahrungen der FeS-Fällung in Lösung die Möglichkeit einer FeS-Fällung unter den Bedingungen der Kompartimentierung in PB-PEO-Polymersomen veri.ziert werden. Untersuchungen zur TAA-induzierten Metallsul.dfällung in Lösung Zur TAA-induzierten Ausfällung von Metallsul.den wurden die entsprechenden Lösun­gen im Wasserbad auf 85.C erhitzt. Es wurde mit einem fün.achen Überschuss an TAA in Bezug auf die Konzentration des Metallsalzes gearbeitet. Dieses Konzentrationsver­hältnis erwies sich als optimal beim Arbeiten mit einer 100 mM Metallsalzlösung. Zunächst wurde überprüft, ob H2S aus TAA-Lösungen mit einem pH-Wert im Bereich von pH 2 -7 beim Erhitzen freigesetzt wird. Dies konnte mittels Pb(NO3)2-Papier be­stätigt werden. Dennoch zeigte sich, dass sich beim Erhitzen einer 100 mM Fe2+-Lösung in 100 mM Citratpu.er in Gegenwart von 500 mM TAA im fraglichen pH-Bereich kein schwarzer FeS-Niederschlag bildet. Dieser Befund wurde sowohl beim Arbeiten an Luft als auch unter inerten Bedingungen erhalten. Vermutlich chelatisieren die als Pu.er ver­wendeten Citrationen e.ektiv Fe2+-Ionen, was die FeS-Fällung bei pH 5 inhibiert. Diese Vermutung konnte durch die Wahl eines alternativen Pu.ersystems bestätigt wer­den. Aus einer in 100 mM Acetatpu.er (pH 5) hergestellten 100 mM Fe2+-Lösung mit einem fün.achen Überschuss an TAA fällt beim inerten Erhitzen ein schwarzer Nieder­schlag aus. Beim Arbeiten an Luftsauersto. wurde beim Erhitzen zunächst die Bildung einesrotbraunenNiederschlags(vermutlichFe(OH)3)beobachtet,dersichnachundnach schwarz färbte. Folglich ist FeS auch bei pH 5 durch TAA in der Hitze ausfällbar, al­lerdings optimalerweise unter inerten Bedingungen und in Abwesenheit chelatisierender Citrationen. Weiterhin wurde untersucht, wie schnell und in welchem Umfang sich FeS durch TAA aus einer Fe2+-Lösung in 100 mM Acetatpu.er (pH 5) ausfällen lässt. Die zum Vergleich untersuchte Ausfällung von PbS aus einer 100 mM Pb2+-Lösung (pH 1) bei fün.achem TAA-Überschuss läuft innerhalb von zwei Stunden ab. Im Gegensatz dazu ist die Aus­fällung von FeS auch nach über fünf Stunden nicht vollständig abgelaufen, worauf eine erhebliche, noch in Lösung verbliebene Fe2+-Menge hinweist. Der Nachweis von Fe2+-Ionen konnte nur qualitativ als Turnbulls Blau unter Einsatz von K3[Fe(CN)6] erfolgen. Die spektrophotometrische Fe2+-Quanti.zierung mittels 1,10­Phenanthrolin war aufgrund der störenden Reaktivität des nicht umgesetzten TAA in der Lösung nicht möglich. Indes konnte die Menge des nach fünf Stunden gebildeten schwarzen Niederschlags ermittelt werden. Dazu wurde der erhaltene schwarze Feststo. mehrmals mit H2O gewaschen und anschließend vakuumgetrocknet. Es wurde eine Aus­beute von 40 % nach 30-stündigem Erhitzen auf 85.C ermittelt. Eine Behandlung einer identischen Lösung bei 70.C für 72 Stunden ergab eine Ausbeute an FeS von 7 %. Der bei der Fällungsreaktion gebildete schwarze Feststo. wurde mittels Röntgenpul­verdi.raktometrie charakterisiert. Es zeigte sich, dass es sich dabei hauptsächlich um Mackinawit (FeS) handelt. Dies belegt, dass sich die Ausfällung von FeS durch TAA bewerkstelligen lässt, wobei die Reaktion erst bei Temperaturen von über 80.C mit akzeptablen Ausbeuten abläuft. TAA-induzierte FeS-Fällung in Polymersomen Zur Veri.zierung der Möglichkeit einer intravesikulären, TAA-induzierten FeS-Fällung wurden Polymersomen unter inerten Bedingungen mit einer 100 mM Fe2+-Lösung mit 500 mM TAA in Acetatpu.er (pH 5) hergestellt. Nach der Aufreinigung mittels Dialyse 3.4 Alternative Zugänge zu metallsul.dhaltigen Polymersomen in zwei Schritten wurden 300 µl der erhaltenen Polymersomendispersionen nach Zusatz von 100 µl destilliertem H2O auf 85.C erhitzt. Innerhalb von 15 Minuten bildeten sich in der Dispersion farblose Aggregate, die vermutlich auf die Zerstörung der in Dispersion be.ndlichen Polymersomen hindeuten. Die Dispersion verfärbte sich indes nicht dunkel. Es konnte unter diesen Bedingungen auch keine Entwicklung von H2S detektiert werden, weder olfaktorisch noch mittels Pb(NO3)2-Papier. In einem weiteren Experiment wurden Polymersomen mit einer 500 mM Fe2+-Lösung mit 500 mM TAA in Acetatpu.er (pH 5) hergestellt. Diese Dispersion wurde in drei Schritten dialysiert, wobei im dritten Schritt eine Acetat-Pu.erlösung mit 500 mM TAA zum Einsatz kam. Dieser extravesikuläre Zusatz von TAA sollte eine möglichst hohe in­travesikuläre TAA-Konzentration gewährleisten, indem die Di.usion von TAA aus den Fe2+-haltigen Polymersomen heraus durch einen externen TAA-Überschuss kompensiert wurde. Die aufgereinigte, farblose Polymersomendispersion wurde nun auf 70.C bzw. 85.C unter inerten Bedingungen erhitzt. Bei beiden untersuchten Temperaturen bilde­ten sich in der Polymersomendispersion farblose, sedimentierende Aggregate, die ver­mutlich auf aggregierte Polymersomen zurückzuführen sind. Daneben konnte die Ent­stehung von schwarzen, schwebenden Flocken nach längerer Reaktionszeit (45 min bei 85.C bzw. mehrere Stunden bei 70.C) beobachtet werden. Das Auftreten eines schwar­zen Feststo.s belegt die Bildung von FeS. Dass der schwarze Feststo. erst verzögert im Vergleich zu den beobachteten farblosen Polymeraggregaten auftritt, könnte an der vergleichsweise langsamen sauren Hydrolyse des TAA bei pH 5 liegen. Die FeS-Fällung läuft höchstwahrscheinlich nicht intravesikulär ab, da ihr die Bildung von Polymerag­gregaten vorausgeht. Vermutlich entweichen verkapselte Fe2+-Ionen aus kollabierenden Polymersomen und können dann mit dem nach und nach durch die saure Hydrolyse von TAA freigesetztem H2S unter Bildung von feinen FeS-Niederschlägen reagieren. Die bei erhöhter Temperatur behandelten Polymersomendispersionen wurden mittels Lichtmi­kroskopie auf das Vorhandensein von Vesikeln untersucht. Dabei zeigte sich, dass sich in der auf 70.C erhitzten Probe, im Gegensatz zu der bei 85.C behandelten Probe, noch eine Vielzahl an Vesikeln be.ndet. Diese sind vorwiegend länglich und nicht mehr sphä­risch geformt und weisen keinerlei erkennbare interne Niederschläge auf. Die Untersuchungen zeigen, dass die TAA-induzierte FeS-Fällung in Gegenwart von Polymersomen ablaufen kann. Die moderate Temperaturstabilität der Polymersomen erwies sich als entscheidendes Hindernis für die intravesikuläre, TAA-induzierte FeS-Ausfällung, welche mit steigender Temperatur beschleunigt wird und mit höheren Aus­beuten abläuft. Die Di.usion des nur schwach polaren TAA durch die Polymersomen­membran könnte ebenfalls zu Verlusten an TAA während der Aufreinigung und damit zu nicht ausreichenden Mengen an H2S während des Erhitzens für die FeS-Fällung füh­ren. Die FeS-Fällungsreaktion konnte überhaupt nur bei Verwendung eines sehr hohen Fe2+-Gehalts sowie einer hohen TAA-Konzentration intra-wie extravesikulär beobachtet werden. Dies bestätigt die bereits gewonnene Erkenntnis, dass die Ausbeuten der TAA-induzierten FeS-Fällungsreaktion nur gering sind. So werden Fe2+-Ionen in Acetatpu.er (pH 5) selbst bei einem fün.achen Überschuss an TAA bei 70.C nur zu 7 % sowie bei 85.C nur zu 40 % als FeS ausgefällt. Eine geringe Ausbeute bei der TAA-induzierten FeS-Fällung entspricht Literaturhinweisen, nach denen schwer lösliche Metallsul.de mit TAA in der Hitze u.U. nicht quantitativ ausgefällt werden können [63]. 3.4.3 Polymervesikel mit FeS-Nanopartikeln Generell ist bei der Art der Verkapselung von NP in Vesikeln zwischen hydrophoben und hydrophilen NP zu unterscheiden. Hydrophobe NP lagern sich bevorzugt im hydropho­ben Inneren der Vesikelmembran ein, während hydrophile NP vorwiegend im wässrigen Inneren von Vesikeln lokalisiert sind [94]. Da FeS-NP hydrophil sind, sollte es möglich sein, diese im wässrigen Inneren von Polymersomen einzuschließen. Von der erfolgreichen Einbettung hydrophiler Au-und hydrophober CdSe-NP in PB­PEO-Vesikel wurde bereits berichtet [94]. Dort wurden geringe Mengen hydrophiler Au-NP mit einer Größe von 12 nm in einer Suspension zur Hydratisierung eines PB-PEO-Polymer.lms eingesetzt. Bei der Bildung der Polymersomen konnte ein Teil der Au-NP im Inneren der Polymersomen eingeschlossen werden. Hydrophile FeS-NP, die in einer Mikroemulsion hergestellt wurden (s. Kapitel 166), wurden nun auf ihre Eignung zum Einschluss in PB-PEO-Polymersomen untersucht. Es zeigte sich, dass sich durch die Hydratisierung von PB-PEO-Polymer.lmen mit ei­ner FeS-NP-Suspension kein Einschluss von FeS in Polymersomen bewerkstelligen lässt. Vielmehr bildeten sich leere Polymersomen mit externen FeS-NP. Die Behandlung eines PB-PEO-Polymer.lms mit einer wässrigen Suspension von frisch gefälltem FeS ergab dasselbe Resultat. Ein direkter Einschluss von vorgeformten FeS-NP bzw. FeS-Aggregaten in Polymersomen war nicht realisierbar. Vermutlich ist das entscheidende Problem, dass die untersuchten FeS-NP im Wässrigen keine hinreichend stabile Suspension bilden. Durch die auftretende Sedimentation bzw. 3.4 Alternative Zugänge zu metallsul.dhaltigen Polymersomen Aggregation der FeS-NP kann die Hydratisierung eines Polymer.lms nicht bewerkstel­ligt werden. Auch im Fall des frisch gefällten FeS ist wahrscheinlich die Ausbildung von zu großen Aggregaten das entscheidende Hindernis, um FeS-Partikel in Vesikeln einzu­schließen. 3.5 Eisenoxidhaltige Polymervesikel 3.5.1 Motivation Die Herstellung und Charakterisierung magnetischer Liposomen wurde bereits in einer Vielzahl von Studien beschrieben (s. auch Kapitel 2.4). Dennoch ist die Einbettung von magnetischen NP in Liposomen eine Herausforderung, da die NP meist deutlich größer sind, als eine Liposomenmembran dick ist (3 -4 nm), was zu Stabilitätsproblemen bei den hergestellten Magnetosomen führen kann [82]. Eine Alternative zur Herstellung von stabileren magnetischen Vesikeln ist darum der Einsatz von block-Copolymer-Vesikeln, die deutlich dickere Membranen aufweisen. Dafür können u.a. block-Copolymere mit ei­ner biokompatiblen Polyethylenoxid-Hülle zum Einsatz kommen. Der Einschluss von hydrophoben Eisenoxid-NP in Polymervesikel wurde bereits mehr­fach beschrieben [82,95,96]. Die verwendeten Eisenoxid-NP wurden dabei im hydro­phoben Inneren der Polymersomenmembran eingeschlossen und führten zur Ausbildung von oligolamellaren Vesikeln [82]. Die erhaltenen Polymersomen wiesen eine magneto­phoretische Mobilität auf [82] bzw. konnten durch das Anlegen verschiedener externer Magnetfelder deformiert werden [95]. Allerdings sind bislang keine Studien bekannt, die den Einschluss hydrophiler Magnetit-NP im wässrigen Inneren von Polymersomen beschreiben. Solche Polymersomen würden sich, im Gegensatz zu Polymersomen mit hydrophoben Eisenoxid-Partikeln im Inneren der Membran, nicht in einem äußerlich angelegten Magnetfeld deformieren lassen und wären dadurch potenziell stabiler. Darum sollte untersucht werden, ob sich hydrophile Magnetit-NP, die eine Art Ferro.uid bilden, im Inneren von Polymersomen einschließen lassen und welche Eigenschaften solche Polymersomen aufweisen. In einem anderen Ansatz sollten in Analogie zu den Untersuchungen zu magnetophore­tischen Liposomen (s. Kapitel 2.4) ebenfalls schrittweise zunächst Fe2+-Ionen in Poly­mersomen eingeschlossen und diese dann aufreinigt werden. Durch Zugabe von NH3 und Lagerung an Luft sollte die intravesikuläre Ausfällung von Eisen(II,III)-oxid induziert werden, denn beim Mischen einer wässrigen Lösung mit stöchiometrischen Mengen an Fe2+-und Fe3+-Ionen mit einer starken Base bilden sich die entsprechenden Eisenhy­droxide, die sehr rasch unter Bildung von Magnetit (Fe3O4) altern [80]. Dieser Ansatz, der bislang nur für die Herstellung von Eisen(II,III)-oxid-haltigen Liposomen beschrie­ben wurde [60], erö.net einen weiteren, bislang nicht untersuchten Zugang zu stabileren, potenziell magnetophoretischen Vesikeln. Da das eingesetzte PB-PEO-block-Copolymer 3.5 Eisenoxidhaltige Polymervesikel eine biokompatible PEO-Hülle aufweist, ist es auch für das breite Anwendungsspektrum von Magnetit-haltigen Vesikeln als z.B. Röntgenkontrastmittel oder Anti-Tumor-Agenz äußerst interessant. 3.5.2 Polymersomen mit intravesikulär gebildeten Magnetit-Nanopartikeln Ein alternativer Zugang zu Polymersomen mit intravesikulären Magnetit-NP stellt der sukzessive Einschluss von Fe2+-Ionen in Polymersomen und die nach der Aufreinigung erfolgende Inkubation mit NH3 an Luft dar. Es konnte bereits gezeigt werden, dass auf diesem Weg magnetophoretische, Eisenoxid-haltige Vesikel (Liposomen) hergestellt wer­den können (s. Kapitel 2.4.2). Ausgehend von diesem Prinzip wurde zunächst ein PB-PEO-Polymer.lm mit einer 60 mM Fe2+-PDC-Komplex-Lösung hydratisiert. Die erhaltene Polymersomendispersion wurde inzweiSchrittensukzessiveauf100nm extrudiertundanschließendmittelsDialy­se in zwei Schritten unter Verwendung von EDTA aufgereinigt. Eine PCS-Untersuchung der erhaltenen, intensiv rosa gefärbten Dispersion ergab einen Z-Average von 146 nm (PDI = 0,247). Zur Generierung von intravesikulärem Magnetit wurden 80 µl der Polymersomendisper­sion mit 17 µl konzentriertem NH3 versetzt. Dabei trat eine sofortige Aufhellung der Dispersion auf, und die rötliche Färbung verschwand. Die erhaltene, schwach gelbliche Dispersion wurde 18 Stunden an Luft an einem Supermagneten gelagert. In diesem Zeit­raum konnten keine Aggregationsprozesse am Supermagneten beobachtet werden. Eine derart präparierte Dispersion wurde zusätzlich mittels Cryo-TEM untersucht, um zu veri.zieren, ob sich intravesikuläre Eisenoxid-NP gebildet hatten. Es zeigte sich, dass ausschließlich unilamellare Vesikel in der Dispersion vorliegen. Fast alle Vesikel mit einer Größe > 150 nm wiesen in der Tat di.use dunkle, interne Aggregate mit einer Ausdeh­nung von 8 -25 nm auf (s. Abb. 41). Vesikel ohne NH3-Zugabe wiesen keine internen Aggregate auf. Der dunkle Kontrast der beobachteten Aggregate, die aus kleineren Par­tikeln im einstelligen Nanometerbereich bestehen (s. Abb. 41, rechts), ist ein starkes Indiz dafür, dass es sich um eisenhaltige Aggregate handelt. Vergleichbare di.use Aggre­gate konnten auch im Inneren von mittels RVE hergestellten, Fe2+-haltigen Liposomen nach Zugabe von NH3 und Lagerung an Luft, nicht jedoch im Inneren von mittels FHE hergestellten, extrudierten Liposomen nach identischer Behandlung beobachtet werden (s. Kapitel 2.4.2). In der untersuchten Probe wurden weder visuell noch in der Cryo-TEM-Untersuchung Hinweise auf kollabierte Polymersomen gefunden, was die Stabilität von Polymersomen unter diesen stark alkalischen Bedingungen belegt. Die Lagerung der mit NH3 inkubier­ten Polymersomendispersion an einem Supermagneten bewirkte keine visuell erkennbare Aggregatbildung in der Nähe des Magneten. Dies kann darauf zurückzuführen sein, dass die intravesikulären Magnetit-NP zu klein sind. Damit wäre die gerichtete, attraktive Wirkung des Supermagneten auf die Magnetit-NP zu gering im Vergleich zur ungerich­teten Di.usionsbewegung der Polymersomen in der homogenen Dispersion. 3.5.3 Polymersomen mit stabilisierten Magnetit-Nanopartikeln Für die Untersuchungen kamen zuvor hergestellte, mittels Triethylenglykol (TREG) sta­bilisierte Magnetit-NP zum Einsatz, die in einer wässrigen, HCl-sauren Lösung bei pH 3 eine fürmehrereWochen stabileSuspension bilden(vgl.Kapitel 3.6.2). Die Magnetit-NP weisen eine Größe im Bereich von 4 -8,5 nm auf. 3.5 Eisenoxidhaltige Polymervesikel Mit verschiedenen Verfahren wurde versucht, TREG-stabilisierte, hydrophile Magnetit­NPinPB-PEO-Polymersomeneinzuschließen.DafürkameineSuspensionvonMagnetit­NPinsalzsauremH2Ovon0,1mg/mlzumEinsatz.DiesewurdezurHydratisierungeines PB-PEO-Polymer.lms zur Herstellung einer 1,6 mM PB-PEO-Polymersomendispersion verwendet. Zusätzlich wurde die Möglichkeit eines Einschlusses von Magnetit-NP in Polymersomen mittels THF-bzw. Ethanol-Injektion veri.ziert. Dazu wurden je 5 mg PB-PEO in 100µl THF bzw. Ethanol gelöst und dann rasch über eine Kanüle in 900 µl einer Magnetit-NP-Suspension injiziert. Die verwendete Menge an Magnetit-NP betrug dabei 0,1 mg/ml. Gleichwohl zeigten PCS-und UV/Vis-Untersuchungen der PB-PEO-haltigen Dispersio­nen, dass lediglich bei der Filmhydratisierungsmethode Vesikel gebildet wurden. Die beiden untersuchten Injektionsmethoden führten nicht zur Bildung von Polymersomen­dispersionen.AuchbeiEinsatzeinergeringerenMengevonMagnetit-NPvon0,05mg/ml in einer wässrigen Suspension konnte weder bei der THF-noch bei der Ethanol-Injektion die Bildung von Vesikeln beobachtet werden. Die über die FHE-Methode hergestellte, magnetithaltige Polymersomendispersion wur­de durch GPC aufgereinigt, wobei zur Eluierung eine wässrige, HCl-saure Lösung (pH 3) verwendet wurde. Während Polymersomen rasch auf der Säule wandern, verblieben die Magnetit-NP auf der Säule. Eine Probe der aufgereinigten Polymersomendispersion so­wie die verwendete Magnetit-NP-Suspension wurden mittels Cryo-TEM untersucht, um zutesten,obMagnetit-NPimInneren vonPolymersomeneingeschlossenwerdenkönnen. Die bei der Herstellung der Polymersomen eingesetzten Magnetit-NP weisen überwie­gend Größen im Bereich von 4 -8,5 nm auf und sind deutlich anhand ihres dunklen Kontrasts zu erkennen (s. Abb. 42a). Bei der Cryo-TEM-Untersuchung von aufgerei­nigten, potenziell magnetithaltigen Polymersomen wurden ausschließlich unilamellare Vesikel gefunden, von denen ein Großteil leicht defomiert ist (s. Abb. 42b). Weniger als 5 % der Vesikel auf den Cryo-TEM-Aufnahmen weisen überhaupt dunkle Magnetit-NP auf, die membranassoziert sind. Ein Beispiel dafür ist in Abb. 42c zu erkennen. Isolierte oder aggregierte Magnetit-NP wurden bei der Untersuchung nicht gefunden. Der Einschluss von Magnetit-NP in Polymersomen mittels Filmhydratisierung gelingt also nur zu einem sehr geringen Anteil. Die wenigen beobachteten Magnetit-NP liegen höchstwahrscheinlichintravesikulärvor,danachderGPCkeinerleiexterne Magnetit-NP inderaufgereinigtenPolymersomendispersiongefundenwurden.DesWeiterenweisendie hergestellten Polymersomen deutlicheDeformationen auf, dieauf eine mögliche Wechsel­ wirkung mit TREG-stabilisierten Magnetit-NP hinweisen. Der Stabilisator Triethylen­glykol ist ebenso aus Ethylenoxid-Einheiten aufgebaut wie der PEO-Teil des PB-PEO, was Interaktionen wahrscheinlich macht. Um Belege für solche Wechselwirkungen zu .nden, wurden auch nicht-aufgereinigte, po­tenziell magnetithaltige Polymersomen mittels Cryo-TEM untersucht. Repräsentative Aufnahmen einer solchen Probe sind in Abb. 43 zu sehen. Es zeigte sich, dass ca. 30 % der Polymersomen auf den Cryo-TEM-Aufnahmen diskrete Magnetit-NP,derRestkeineNPaufweist.DieMagnetit-NPliegenvorwiegendalsisolier­te Aggregate bzw. auf den Stegen des Grids vor. Zudem sind schlauchförmige Strukturen des PB-PEO zu erkennen, die auf eine andere Packungsform des PB-PEO zurückzufüh­ren sind. Solche Strukturen weisen auf ein vermutlich während der Lagerung chemisch verändertes PB-PEO hin, das damit auch andere amphiphile Eigenschaften aufweist. DieMembraneinzelnerPolymersomenistanderKontakt.ächezuassoziiertenMagnetit­NP deutlich deformiert bzw. gestört (s. Abb. 44). Folglich liegen diese Magnetit-NP wie eingesunken in der Membran vor und sind nicht im Inneren der Polymersomen einge­schlossen. Ob sich in der Probe auch Polymersomen mit internen Magnetit-NP be.nden, kann jedoch nicht ausgeschlossen werden. 3.5 Eisenoxidhaltige Polymervesikel 3.5.4 Diskussion -Zugänge zu magnetithaltigen Polymersomen Die zwei untersuchten Zugänge zu magnetithaltigen Polymersomen führten zu sehr un­terschiedlichen Resultaten. Die beabsichtigte intravesikuläre Generierung von Magnetit-NP in aufgereinigten Fe2+-haltigen Polymersomen durch Zugabe von NH3 und Lagerung an Luft gelang nachweislich. So belegen Cryo-TEM-Aufnahmen eindeutig die Bildung von dunklen intravesikulären Aggregaten mit einer Ausdehnung von 8 -25 nm. Diese können in Vesikeln mit Größen > 150 nm beobachtet werden. Es wurden keinerlei Poly­meraggregate in solchen Polymersomendispersionen beobachtet. Gleichwohl zeigten Polymersomen mit intern generierten Aggregaten von Magnetit-NP keine visuell erkennbare Mobilität (Magnetophorese) im Magnetfeld eines Supermagne­ten. Die magnetische Wechselwirkung der Magnetit-Partikel mit dem angelegten Ma­gnetfeld ist also zu gering, um eine beobachtbare, gerichtete Bewegung der Polymerso­men zu induzieren. Dies könnte an einer zu geringen Größe der Magnetit-NP liegen. Die Erhöhung der Fe2+-Startkonzentration ist eine Möglichkeit, um eine höhere intravesi­kuläre Fe2+-Konzentration zu erreichen. Dies könnte zur Ausbildung größerer, interner Magnetit-NP führen, die die Magnetophorese von Polymersomen ermöglichen. Dennoch ist bemerkenswert, dass überhaupt interne Aggregate mittels Cryo-TEM zu detektieren waren, da dies im Fall von Liposomen, die unter vergleichbaren Bedingun­gen mittels FHE hergestellt wurden, nicht der Fall war. Ganz anders stellen sich die Ergebnisse der Experimente zum Einschluss von vorgeform­ten hydrophilen Magnetit-NP in Polymersomen dar. Nur die FHE-Methode erwies sich als geeignet, Polymersomen in einer Suspension von Magnetit-NP zu erzeugen. Eine Cryo-TEM-Untersuchung der aufgereinigten Polymersomendispersion zeigte indes, dass sich vorwiegend leicht deformierte Polymersomen gebildet hatten. Polymersomen mit Magnetit-NP fanden sich nur zu einem Anteil von < 5 % in der Probe. Eine mögliche Ursache ist, dass Magnetit-NP in der verwendeten Suspension aggregieren und somit zu groß für den Einschluss in Polymersomen sind. Größere Aggregate von Magnetit-NP wurden zwar bei Cryo-TEM-Untersuchungen einer nicht aufgereinigten Polymersomen­dispersion mit Magnetit-NP gefunden, allerdings befand sich eine deutlich größere An­zahl isolierter Magnetit-NP als Polymersomen in der Probe. Eine weitere mögliche Erklärung für den in meinen Arbeiten selten beobachteten Ein­schluss von Magnetit-NP in Polymersomen könnte eine zu starke Wechselwirkung der Magnetit-NPmitderPolymersomenmembransein.IndiziendafürliefertedieCryo-TEM­ 3.5 Eisenoxidhaltige Polymervesikel Untersuchung einer nicht aufgereinigten, potenziell magnetithaltigen Polymersomendi­spersion. Dort konnte bei mehreren Polymersomen die Deformation der ca. 12 nm dicken Membran durch angelagerte Magnetit-NP beobachtet werden. Diese starke Deformati­on erscheint angesichts der Rigidität und Dicke der Polymersomenmembran erstaunlich. Allerdings kann dieser E.ekt mit einer starken Wechselwirkung zwischen Triethylengly­kol, dem Stabilisator der Magnetit-NP, und den Ethylenoxid-Einheiten des PEO-Teils der Polymersomenmembran erklärt werden, da diese beiden Komponenten strukturell identische Einheiten aufweisen. Dies ist eine plausible Erklärungfür diebeobachtete Ein­buchtungderPolymersomenmembrandurchMagnetit-NP(s.Abb.44,Pfeile).Diedamit verbundene starke Deformation eines Membransegments geht bei einigen Polymersomen sogar mit der Ausbildung schlauchförmiger Strukturen aus der Polymersomenmembran und damit der Zerstörung des Polymersoms einher (s. Abb. 43). Die Vermutung, dass Polymersomenmembranen gegenüber Magnetit-NP stabiler als Li­posomenmembranensind,kannfürdenEinschluss vonTREG-stabilisierten,hydrophilen Magnetit-NP nicht untermauert werden. Die Ursache dafür liegt höchstwahrscheinlich in der starken Wechselwirkung des Stabilisators TREG mit den PEO-Gruppen der Poly­mersomenmembran. Der Einsatz eines anderen Stabilisators für Magnetit-NP könnte die Wechselwirkungen mit der Polymersomenmembran reduzieren. Damit wäre eine höhere Stabilität der Polymersomen und ein e.ektiver Einschluss von Magnetit-NP in Polymer­somen möglich. 3.6 Exkurs: Magnetit-Nanopartikel 3.6.1 Motivation Die Intention der Untersuchungen lag in der Herstellung einer stabilen, wässrigen Sus­pension von Magnetit-NP, die zur Verkapselung von hydrophilen Magnetit-NP in Ve­sikeln eingesetzt werden sollte. Dazu mussten zunächst Magnetit-NP hergestellt und charakterisiert werden. In einem zweiten Schritt stand die Entwicklung einer Methode zur Generierung einer stabilen, homogenen Suspension von Magnetit-NP in einem wäss­rigen Lösungsmittel, einer Art „ferro.uid“, im Vordergrund. Magnetit-NP sind aufgrund ihrer besonderen magnetischen Eigenschaften vielfältig an­wendbar,z.B. indermedizinischenDiagnostikoderTherapie(s.Kap.1.1.2).FürdieHer­stellung von stabilisierten Magnetit-NP sind verschiedene Verfahren etabliert. So wird u.a. die Fällung von Magnetit aus einer wässrigen Lösung eines 2:1-Gemischs von FeCl3 und FeCl2 durch die Zugabe von NH3 beschrieben [97]. Die entstandenen Magnetit-NP werden durch den anschließenden Zusatz des Tensids Tetramethylammoniumhydoxid in einer wässrigen Suspension stabilisiert [97]. Zudem sind unterschiedliche solvothermische Verfahren zur Generierung von Magnetit-NP bekannt. Ein Beispiel hierfür ist die Bildung von Magnetit-NP durch die thermi­sche Zersetzung von Fe(III)-acetylacetonat Fe(acac)3 in einer Triethylenglykol-Lösung (TREG), über die eine stabile wässrige Suspension von Magnetit-NP zugänglich ist [98,99]. Hier wurde die Methode der solvothermischen Herstellung in TREG aufgrund des gut nachvollziehbaren Verfahrens ausgewählt. 3.6.2 Solvothermische Herstellung von Magnetit-Nanopartikeln Die untersuchte solvothermische Herstellungsmethode von Magnetit-NP basiert auf der thermischen Zersetzung von Fe(acac)3. Dazu wird TREG mit einem Siedepunkt von 287.C verwendet, das gleichzeitig drei Funktionen ausübt. Es wirkt als Lösungmittel, teilweise als Reduktionsmittel zur Generierung von Fe2+-Ionen aus Fe(acac)3 sowie als Stabilisator der gebildeten Magnetit-NP [98]. Dazu wurde zunächst eine geeignete Me­thode entwickelt, um die Reaktion bei solch hohen Temperaturen unter einer Argon­Atmosphäredurchführenzukönnen.BeimErhitzeneinerLösungvonFe(acac)3 inTREG über ein de.niertes Temperaturprogramm bis zum Rück.uss fällt aus der tiefroten Lö­sung ein schwarzer Feststo. aus. Dieser kann durch eine Ultrazentrifugation abgetrennt, 3.6 Exkurs: Magnetit-Nanopartikel durch mehrmaliges Waschen gereinigt und anschließend getrocknet werden. 3.6.3 Charakterisierung von Magnetit-Nanopartikeln Zusammensetzung Der schwarze Feststo. wurde mittels PXRD charakterisiert, um abzusichern, dass es sich tatsächlich um Magnetit handelt. Das Di.raktogramm ist in Abb. 45 dargestellt. Es ist zu erkennen, das die intensivsten Re.exe denen von Magnetit zugeordnet werden können. Dabei ist die Breite der gemessenen Re.exe ein gutes Indiz dafür, dass diese von sehr kleinen Partikeln (oder, weniger wahrscheinlich, von amorphen Anteilen) herrühren. Das Di.raktogramm deutet darauf hin, dass sich geringe Anteile an Fe2O3 als Neben­produkt in der Probe be.nden. Die hergestellten NP bestehen folglich hauptsächlich aus Magnetit. Größenverteilung der Magnetit-Nanopartikel Zur Ermittlung der Größe und der Größenverteilung der hergestellten Magnetit-NP wur­den TEM-Untersuchungen durchgeführt. Dabei zeigte sich, dass die NP mehrheitlich nahezu sphärisch geformt sind (s. Abb. 46). Die Analyse mehrerer TEM-Aufnahmen hinsichtlich der Größe der abgebildeten NP ergab, dass diese Größen im Bereich von 3 -14 nm aufweisen, wobei 90 % der NP einen Durchmesser zwischen 4 und 8,5 nm haben. Die NP liegen in losen Aggregaten vor, was auf das Eintrocknen der stabilen Suspension zurückzuführen ist. Dispergierbarkeit im wässrigen Milieu Da das Ziel der Arbeiten die Herstellung einer stabilen homogenen Suspension von Magnetit-NP war, wurde untersucht, wie sich Magnetit-NP im Wässrigen verhalten. Laut [98] bilden TREG-stabilisierte Magnetit-NP eine stabile wässrige Suspension. Da in [98] weitere Angaben über die Art der verwendeten wässrigen Lösung fehlen, musste ermittelt werden, bei welchem pH-Wert stabile Suspensionen von Magnetit-NP gebildet werden. Dazu wurden Suspensionen von 0,1 mg Magnetit-NP je Milliliter wässriger Lö­sung hergestellt und deren Stabilität mittels PCS veri.ziert. Es zeigte sich, dass Magnetit-NP eine mehrere Wochen stabile, braune Suspension in HCl-saurem H2O (pH 3) bilden, wie PCS-Messungen ergaben. Hingegen lassen sich Magnetit-NP in destilliertem H2O (pH 6) bzw. in mit NaOH auf pH 9 gebrachtem H2O nicht länger als 24 h suspendieren. 3.6 Exkurs: Magnetit-Nanopartikel Ergänzend wurde getestet, ob sich Magnetit-NP zur besseren pH-Kontrolle ebenfalls in 100 mM Citratpu.er (pH 3) suspendieren lassen. Es konnte indes beobachtet werden, dass sich die ursprünglich braun gefärbte Magnetit-NP-Suspension bereits nach einem Tag gelb verfärbt hatte. In der gelben Lösung konnten keine Magnetit-NP mehr mittels Lichtstreuung detektiert werden. Vermutlich werden die Magnetit-NP durch Komplexie­rung der Fe3+-Ionen durch Citratanionen aufgelöst. Bei der Lagerung einer stabilen Suspension von Magnetit-NP an einem Supermagneten aggregieren bräunlich gefärbte Schlieren am Supermagneten. Dies kann auf die Magne­tophorese von Magnetit-NP zurückgeführt werden. 3.6.4 Diskussion Mit dem gewählten solvothermischen Ansatz konnten tatsächlich erfolgreich Magnetit­NPhergestelltwerden.Mittels PXRD wurdeabgesichert,dass es sich beidengenerierten NP tatsächlich überwiegend um Magnetit-NP handelt. Die hergestellten Magnetit-NP weisen zu 90 % eine Größe von 4 -8,5 nm auf und sind damit deutlich kleiner als in der Literatur beschrieben [98], wo eine mittlere Größe von 11 nm angegeben wird. Dort fehlt allerdings eine genauere Charakterisierung der Partikelgrößenverteilung. Es zeigte sich, dass sich die aufgereinigten NP für mehrere Wochen in einer schwach HCl-sauren Lösung bei pH 3 stabilisieren lassen. Bei höheren pH-Werten sind die her­gestellten NP-Suspensionen lediglich etliche Stunden stabil. Diese Beobachtungen legen die Vermutung nahe, dass im wässrigen Milieu eine elektrostatische Stabilisierung der Magnetit-NP vorliegt, wobei niedrigere pH-Werte vorteilhaft sind. Vermutlich weisen die TREG-stabilisierten Magnetit-NP eine positive Ober.ächenladung auf, so dass sie im sauren Milieu besser stabilisiert werden als im neutralen oder alkalischen Milieu (vgl. [100]). Magnetit-NP in einer HCl-sauren, wässrigen Suspension zeigen wie erwartet Magneto­phorese und eignen sich somit prinzipiell zur Herstellung von Magnetit-NP-haltigen, magnetophoretischen Vesikeln (s. Kapitel 2.4.3 und 3.5.3). 4 Einschluss weiterer Übergangsmetalle in Polymersomen 4.1 Motivation ZusätzlichzumEinschlussvonFeSinPolymersomensolltenNanopartikelderÜbergangs­metallsul.de NiS, CdS und CuS in Polymersomen ausgefällt werden, um den Prozess der Generierung intravesikulärer Metallsul.de intensiver zu beleuchten. Zudem können die Erkenntnisse dieser Untersuchungen zum Vergleich und zum besseren Verständnis der Ergebnisse, die bei der Herstellung FeS-haltiger Polymersomen erhalten wurden, dienen. Die zusätzlich zu charakterisierenden Übergangsmetallsul.de eignen sich insbesondere, da • sie deutlich schwerer löslich sind als FeS und somit schon bei niedrigerem pH-Wert sowie bei gleichem pH-Wert mit höherem Umsatz im Vergleich zu FeS ausfallen. • sie aufgrund der geringeren Löslichkeit im Vergleich zu FeS nach der Ausfällung stabiler sein sollten. • im Gegensatz zu Fe2+-Ionen sowie FeS weder die zur Herstellung eingesetzten zwei­wertigen Kationen noch die gebildeten Metallsul.de oxidationsemp.ndlich sind. • der Nachweis in Polymersomen erleichtert wird, da insbesondere Cd einen deut­lich stärkeren Kontrast bei Cryo-TEM-Untersuchungen aufweist und somit besser detektiert werden kann. Ausgehend von den Ansätzen zur Herstellung von FeS-haltigen Polymersomen wurden mitderFHE-MethodeebenfallsMetallchloridederÜbergangsmetalleNickel,Kupferund Cadmium in Polymersomen eingeschlossen. Nach der Aufreinigung wurden entsprechend der Herstellung von intravesikulärem FeS durch Inkubation mit H2S die jeweiligen Me­tallsul.de im Inneren von Polymersomen ausgefällt. Die geplanten Untersuchungen mussten nicht unter Luftausschluss durchgeführt wer­den, da die verwendeten Metallsalze der zweiwertigen Ionen von Nickel (in Form von NiCl2 · 6H2O), Cadmium (CdCl2) und Kupfer (in Form von CuCl2 · 2H2O) nicht oxi­dationsemp.ndlich sind. Von den Metallsul.den dieser Elemente ist nur eine Oxidation von NiS zu Ni2S3 an Luft bekannt. 4.2 Nickelhaltige Polymersomen mol2 Das Löslichkeitsprodukt von FeS (KL(FeS) = 10-18 l2 [63]) ist größer als das der an­deren untersuchten Übergangsmetalle. So ist das Löslichkeitsprodukt von NiS um zwei Größenordnungen, das von CdS und CuS um neun bzw. 19 Größenordnungen kleiner als das von FeS [63]. Darum sollten die gebildeten Metallsul.de im Vergleich zu FeS, welches zudem auch noch oxidationsemp.ndlich gegenüber Luftsauersto. ist, nach der Ausfällung deutlich stabiler und damit auch besser charakterisierbar sein. Der Einsatz nicht-inerter Arbeitstechniken erleichterte die experimentelle Durchführung der Arbei­ten. 4.2 Nickelhaltige Polymersomen 4.2.1 Vorbemerkungen Nickel ist von den drei untersuchten Übergangsmetallen dem Eisen chemisch am ähn­lichsten. Die zweiwertigen Ionen beider Metalle gehören zur Ammoniumsul.dgruppe beim Kationentrennungsgang in der qualitativen Analyse [63], bei dem unter inerten Bedingungen auch FeS statt Fe(OH)3 ausfallen würde. NiS bzw. Ni2S3 und FeS sind schwarze Feststo.e. Nickelhaltige Polymersomen wurden darum analog den eisenhalti­gen Polymersomen umfassend charakterisiert. 4.2.2 Entwicklung einer Methode zur Quantifzierung von Ni2+-Ionen Analog zur Analyse eisenhaltiger Polymersomen sollte eine hinreichend emp.ndliche spektrophotometrische Methode zur Bestimmung von Ni2+-Ionen gefunden und für die Quanti.zierung von intravesikulären Ni2+-Ionen optimiert werden. Zunächst wurde ge­testet, ob Ni2+-Ionen mittels Dimethylglyoxim (dimegly) quanti.ziert werden können. Ni2+-Ionen und dimegly bilden im alkalischen den neutralen Komplex [Ni(dimegly)2] (s. Abb. 47a), der intensiv rosa gefärbt und zudem schwerlöslich ist. Er eignet sich indes nicht nur zur gravimetrischen Bestimmung, sondern auch zur spektrophotometrischen Quanti.zierung von Nickel. Es wurden zwei in der Literatur beschriebene Vorschrif­ten [101] zur Bestimmung von Ni2+ mit dimegly hinsichtlich ihrer Eignung getestet. Es erwies sich als entscheidend, ein genaues Zeitregime bei der Präparation der zu vermes­senden Lösungen einzuhalten, da sich die Absorption beim Absorptionsmaximum des Komplexes bei .max = 460 nm nach der Präparation der Lösungen veränderte. Dies ist aufdielangsameOxidationderkomplexiertenNi2+-IonenzuNi3+-Ionenzurückzuführen, diezu Folgereaktionen amkomplexierten dimegly-Ligandenführt unddamitzurBildung anderer Komplexspezies mit veränderten Absorptionseigenschaften führt [101]. Um diese störende Reaktivität zu unterdrücken, erfolgte die Zugabe eines Oxidationsmittels zur quantitativen Oxidation von Ni2+-zu Ni3+-Ionen bei der Herstellung der Komplexlö­sungen. Es zeigte sich, dass sich nur beim Einsatz von Bromwasser im Rahmen einer modi.zierten Variante nach [102] die Generierung eines Nickel-dimegly-Komplexes mit zeitlich konstanter Absorption realisieren ließ. Auf diesem Weg konnten reproduzierbare Ergebnisse erzielt werden. Mit dieser Bestimmungsmethode von Ni2+-Ionen (s. S. 162) wiesen die [Ni(dimegly)2]-Komplexlösungen für mehr als 60 Minuten eine konstante Ab­sorption im Absorptionsmaximum auf. Zudem konnten Ni2+-Ionen auch in hinreichend geringen Mengen für die Analyse von Ni2+-haltigen Polymersomen quanti.ziert werden. Ausgehend von diesen Ergebnissen wurde der Ein.uss von THF und von PB-PEO auf die Emp.ndlichkeit und die Reproduzierbarkeit der Ni2+-Bestimmungsmethode unter­sucht. Es zeigte sich, dass analog zur Eisenbestimmung Nickel ausschließlich mit der Standard-Additions-Methode quanti.ziert werden konnte, da vorhandenes PB-PEO den Blindwert deutlich beein.usst. 4.2.3 Herstellung und Charakterisierung Ni2+-haltiger Polymersomen Alle Präparationsschritte erfolgten an Luft. Es wurden analog zur Herstellung von ei­senhaltigen Polymersomen mit der Filmmethode (s.S. 160) NiCl2-Lösungen unterschied­licher Konzentration in TRIS-HCl-Pu.er bei unterschiedlichen pH-Werten in 1,6 mM PB-PEO-Polymersomen eingeschlossen. Eine Extrusion der hergestellten Ni2+-haltigen Polymersomen erfolgte nicht. Nach der Aufreinigung mittels Dialyse wurden farblose Di­spersionen erhalten, die eine große Verteilungsbreite der Vesikeldurchmesser aufwiesen. Zur Bestimmung des Nickelgehalts in aufgereinigten Polymersomendispersionen kam die zuvor optimierte Methode zur Quanti.zierung von intravesikulären Ni2+-Ionen zum Ein­satz. Dazu wurden die Polymersomen zunächst mit einem Überschuss an THF aufgelöst. Daran anschließend erfolgte die spektrophotometrische Bestimmung von Nickel mittels Standardaddition. Die Ergebnisse der Nickel-Bestimmung für verschiedene Ansätze sind in Abb. 47b dargestellt. Es ist deutlich zu erkennen, dass bei einer Startkonzentration von 500 mM NiCl2 stark unterschiedliche Werte für den Ni2+-Gehalt nach der Aufreinigung ermittelt wurden. Die Spannbreite geht von Ni2+-Konzentrationen von 0,3 mM bis zu 0,9 mM. Dabei scheint 4.2 Nickelhaltige Polymersomen Gehalt in aufgereinigten, Ni2+-haltigen Polymersomendispersionen bei unterschied­ lichen pH-Werten und verschiedenen Ni2+-Startkonzentrationen auch der pH-Wert einen Ein.uss zu haben. Bei niedrigeren pH-Werten konnte ein hö­herer Nickelgehalt realisiert werden. Bei Einsatz einer Startkonzentration von 60 mM NiCl2 wiesen die aufgereinigten Polymersomendispersionen jeweils einen vergleichbaren Ni2+-Gehalt von ca. 0,28 mM auf. Interessanterweise entspricht dieser Ni2+-Gehalt auch in etwa dem mittleren Fe2+-Gehalt von 0,35 mM von aufgereinigten Fe2+-haltigen Po­lymersomendispersionen. Die Schwankungen der ermittelten Ni2+-Gehalte könnten auf die in manchen Experimenten nicht vollständige Hydratisierung des Polymer.lms nach 16-stündigem Schütteln zurückzuführen sein. Zur Veri.zierung der Ergebnisse der spektrophotometrischen Ni2+-Bestimmung wurde von aufgereinigten Ni2+-haltigen Polymersomendispersionen der Nickelgehalt zusätzlich mittels FAAS bestimmt. Dazu wurde zunächst eine Fünfpunkt-Kalibration im Kon­zentrationsbereich von 0,1 mg/l -1,0 mg/l mit einem Nickel-Standard vorgenommen. Anschließend wurden die Proben mit konzentrierter HNO3 aufgeschlossen und nach de­.nierter Verdünnung vermessen. Dabei zeigte sich, dass für PB-PEO-Polymersomen, die in einer 60 mM NiCl2-Lösung hergestellt wurden, teils vergleichbare, teils um bis zu 50 % geringere Werte gefunden wurden. Auch in mit 500 mM NiCl2-Lösung hergestellten Polymersomendispersionen wurden nur 50 % der Ergebnisse der UV/Vis-Methode gefunden. Die abweichenden Ergebnisse können möglicherweise mit einem unvollständigen Aufschluss der Polymerso­mendispersionen vor der FAAS-Bestimmung erklärt werden. Zum Aufschluss der Proben für die FAAS wurde anstelle von THF konzentrierte HNO3 verwendet, um ein wässriges System für die FAAS-Untersuchung zu gewährleisten. Bei der Präparation von Polymer­somenproben für andere FAAS-Untersuchungen konnte beobachtet werden, dass sich bei Einsatz zu geringer Mengen an HNO3 zum Aufschluss von Vesikeldisperisionen inhomo­gene Dispersionen bildeten. 4.2.4 Herstellung und Charakterisierung NiS-haltiger Polymersomen Zum Ausfällen von intravesikulärem NiS wurden aufgereinigte, Ni2+-haltige Polymerso­mendispersionen mit gasförmigem H2S oder mit einer gesättigten wässrigen H2S-Lösung versetzt. Dabei trat eine dunkle Verfärbung der zuvor farblosen Dispersionen auf, die auf die Bildung von schwarzem NiS hindeutet. Durch mehrere Kontrollexperimente konnte gezeigt werden, dass die beobachtete NiS-Fällung intravesikulär ist (Abb. 48). Löst man aufgereinigte, Ni2+-haltige Polymersomen durch einen Überschuss an THF auf, kann dennoch eine schwarze Verfärbung der Dispersion bei Inkubation mit H2S be­obachtet werden (Abb. 48 A). Dieser löst sich auch bei Zugabe eines Überschusses an EDTA nicht mehr auf (A). Wird allerdings ein Überschuss an EDTA zu der mit THF versetzten Polymersomendispersion gegeben und diese anschließend mit H2S inkubiert, tritt keine dunkle Verfärbung der Lösung auf (B). Die NiS-Fällung wird durch die Kom­plexierung der aus den Polymersomen freigesetzten Ni2+-Ionen verhindert. Dies konnte auch in einem Vergleichsexperiment gezeigt werden. Eine grün gefärbte Ni2+-Lösung, die mit einem Überschuss an EDTA versetzt wurde, färbte sich bei der Inkubation mit H2S nur geringfügig dunkler. In intakten, aufgereinigten Ni2+-haltigen Polymersomen kann NiS durch Inkubation mit H2S ausgefällt werden (Abb. 48 C). Die Zugabe eines externen Überschusses an EDTA hat keinen Ein.uss auf die Ausfällung von NiS in intakten Polymersomen (D). Das bei diesem pH-Wert als Dianion vorliegende EDTA kann praktisch nicht durch die Poly­mersomenmembran ins Innere der Polymersomen di.undieren und folglich auch keine Ni2+-Ionen im Inneren maskieren kann. Da die Inhibierung der NiS-Fällung nur beim Zerstören der Vesikel mit THF beob­achtet wurde, muss die beim Zusatz von EDTA zu intakten Vesikeln beobachtete NiS-Fällungsreaktion intravesikulär sein. Einmal gebildetes NiS löst sich nicht mehr bei An­wesenheit eines Überschusses an EDTA auf. 4.2 Nickelhaltige Polymersomen Abb. 48: Verwendung einer aufgereinigten, Ni2+-haltigen Polymersomendispersion (Startkon­zentration: 500 mM NiCl2; pH 4) für die Kontrollexperimente: NiS-Fällung bei In­kubation mit H2S auch nach Zerstörung der Polymersomen durch Zusatz von THF möglich (A); Zusatz eines Überschusses an EDTA (15 mM) zu (durch Zusatz von THF) solubilisierten Polymersomen inhibiert NiS-Fällung bei Inkubation mit H2S (B); Bildung von schwarzem NiS bei Inkubation von intakten Polymersomen mit H2S(C); Auftreten der NiS-Fällung auch bei Zugabe eines externen Überschusses an EDTA (15mM) (D) UV/Vis-spektroskopische Verfolgung der NiS-Fällung Die Kinetik der Fällung von NiS in Polymersomen wurde UV/Vis-spektroskopisch ver­folgt. Dazu wurden aufgereinigte, Ni2+-haltige Polymersomen mit einer gesättigten H2S­Lösung (cH2S ˜ 100 mM) versetzt und die Absorption der erhaltenen Dispersion im Verlauf von 30 min gemessen. Die Spektren wurden dabei um die Lichtstreuung der Po­lymersomendispersion korrigiert, indem das UV/Vis-Spektrum der unbehandelten Po­lymersomendispersion subtrahiert wurde. Die erhaltenen korrigierten Spektren, die in Abb. 49a dargestellt sind, zeigen die nach der Inkubation mit H2S-Lösung auftreten­den Veränderungen des Absorptionsspekrums der Probe. Das Auftragen der um die Partikelstreuung korrigierten, relativen optischen Dichte für verschiedene Wellenlängen veranschaulicht, dass nach 120 s die optische Dichte über einen breiten Wellenlängen­bereich bereits über 80 % des Endwerts erreicht hat (s. Abb. 49b). Die intravesikuläre NiS-Fällung läuft also bei einer externen H2S-Konzentration von ca. 66 mM sehr rasch ab. Zudem ist zu erkennen, dass sich die relative optische Dichte praktisch wellenlänge­nunabhängig verändert (s. Abb. 49b). Da NiS ebenso wie FeS als schwarzer Feststo. ausfällt, konnten keine spezi.schen Ab­sorptionsbanden im Verlauf der Messung detektiert werden. Vielmehr ist eine Zunahme der Absorption über den gesamten vermessenen Wellenlängenbereich zu beobachten, wo­bei für kleinere Wellenlängen eine stärkere Zunahme auftritt. Dies deutet vermutlich auf die Bildung von NiS-Partikeln hin, die Licht umso stärker streuen, je kürzer dessen Wel­lenlänge ist (vgl. Abb. 30, S. 59 für die Fällung von FeS in Polymersomen). Die charakteristische grüne Farbe von Ni2+-Lösungen kann bei aufgereinigten, Ni2+­haltigen Polymersomendispersionen nicht mehr beobachtet werden. Dies kann auf die starke Lichtstreuung durch die Polymersomen und den geringen Ni2+-Gehalt von durch­schnittlich ca. 0,28 mM in der Polymersomendispersion zurückzuführen sein. Aus die­sem Grund ist es, anders als beim rötlich gefärbten Fe2+-PDC-Komplex, nicht möglich, die Veränderung einer für Ni2+-Ionen charakteristischen Absorptionsbande während der NiS-Fällung mittels UV/Vis-Spektroskopie zu verfolgen. Cryo-TEM-Untersuchungen von NiS-haltigen Polymersomen Zur Visualisierung von intravesikulären NiS-Aggregaten wurden aufgereinigte, Ni2+­haltige Polymersomen vor und nach der Inkubation mit H2S mittels Cryo-TEM un­tersucht. Hierbei kam eine Polymersomendispersion 45 Tage nach der Herstellung zum 4.2 Nickelhaltige Polymersomen Einsatz. Es zeigte sich, dass Ni2+-haltige Polymersomen praktisch ausschließlich als uni­ lamellare Vesikel vorliegen (s. Abb. 50a). Cryo-TEM-Aufnahmen von mit H2S inkubierten und verfärbten Polymersomendisper­sionen zeigen, dass viele Polymersomen kleine dunkle Aggregate aufweisen, die membra­nassoziert vorliegen (Abb. 50b, 51). Diese sind teilweise auch deutlich erkennbar an der äußeren Vesikelmembran angelagert (Abb. 50b). Zudem zeigen Vesikel auf einigen Auf­nahmen di.use Aggregate mit dunklem Kontrast (schwarze Pfeile auf Abb. 51a,b), bei denen es sich vermutlich um Aggregate von NiS-NP handelt, da Polymersomen solche Aggregate vor der Inkubation mit H2S nicht aufwiesen. Weitere beobachtete Strukturen in derselben Abbildung sind kompakte Partikel mit ei­ner Größe zwischen 11 nm und 24 nm (durch rote Pfeile indiziert). Ähnliche Partikel konnten auch auf anderen Aufnahmen beobachtet werden. Aufgrund ihres Kontrastes sollte es sich dabei ebenfalls um NiS handeln, da solche Aggregate bei Proben ohne H2S­Inkubationnichtbeobachtetwurden.Allerdingssindsolchedunklen,kompaktenPartikel auch in einigen Fällen extravesikulär erkennbar. Solch extravesikuläre Partikel rühren womöglich von kollabierten Polymersomen her. Es war nicht möglich, eine Kippserie zur Veri.zierung der Lokalisierung solcher membranassoziierten Partikel aufzunehmen. Eineweiteres,sehrinteressantesPhänomen wardas beobachteteAuftreteneinerdunklen Ablagerung an der inneren Polymersomenmembran (Abb. 51b, schwarzer Pfeil). Das fragliche Polymersom ist zweifelsohne nicht mehr vollständig geschlossen. Das Platzen des Polymersoms könnte durch den Ein.uss des internen Niederschlags verursacht sein, da ansonsten nur intakte Vesikel in der Probe gefunden wurden. Alternativ könnte auch der interne Niederschlag erst durch das Ö.nen des Polymersoms entstanden sein. Dies ist jedoch unwahrscheinlich, da extern vorhandenes EDTA durch das Eindringen in ein geplatztes Vesikel eine Fällung von NiS verhindern würde. Schließlich weisen die untersuchten Ni2+-haltigen Polymersomendispersionen unabhän­gig von der Inkubation mit H2S extravesikuläre faden-bzw. schlauchförmige Strukturen (z.B. Abb. 51b) auf, die durch eine andere Packungsanordnung der PB-PEO-Moleküle bewirkt wird. Dieser E.ekt könnte durch die lange Lagerungsdauer bedingt sein und auf eine chemische Veränderung des PB-PEO hindeuten. Die Resultate der Cryo-TEM-Untersuchungen von Ni2+-haltigen Polymersomendisper­sionen nach der Inkubation mit H2S belegen eindeutig die Bildung von dunklen Nie­derschlägen. Diese treten in Form von di.usen Aggregaten, einer Ablagerung auf der inneren Membran von Polymersomen sowie als Partikel bzw. Aggregate mit Größen bis zu 24 nm auf. Der Kontrast der Niederschläge und die Tatsache, dass diese nicht in Pro­ben vor der H2S-Inkubation beobachtet werden konnten, beweist, dass es sich um NiS handelt. Die Lokalisierung der beobachteten dunklen Aggregate mittels einer Kippserie 4.2 Nickelhaltige Polymersomen konnte nicht erfolgen. Einige Aggregate liegen erkennbar extern vor, insbesondere größe­re Aggregate. Trotzdem deuten die Cryo-TEM-Aufnahmen darauf hin, dass die di.usen Aggregate und insbesondere die Membranablagerungen intravesikulär sind. 4.3 Cadmiumhaltige Polymersomen 4.3.1 Vorbemerkungen Der Einschluss des photohalbleitenden und als Photokatalysator einsetzbaren CdS im Inneren von PB-PEO-Polymersomen ermöglicht es, photokatalysierte Reaktion unter den speziellen Bedingungen der Kompartimentierung zu untersuchen. Die Verwendung von Polymersomen als vesikuläres System mit internem CdS wurde bislang noch nicht beschrieben, obwohl diese aufgrund der dickeren Membran im Vergleich zu Liposomen ein stabileres System darstellen sollten. Bislang wurde hingegen nur von der Herstellung und Charakterisierung von CdS in Liposomen [18–23] sowie in kationisch-anionischen Tensidvesikeln [103] berichtet. Zur Herstellung von CdS-haltigen Polymersomen wurde dieselbe Herangehensweise wie im Fall von FeS-und NiS-haltigen Polymersomen angewendet: Zunächst erfolgte die Herstellung und Aufreinigung Cd2+-haltiger Polymersomen, in derem Inneren dann die CdS-Fällungsreaktion induziert wurde. CdS fällt aus Cd2+-haltigen Lösungen bei der Inkubation mit H2S bei pH = 0 als gelber Feststo. aus, da es ein Löslichkeitsprodukt mol2 von KL(CdS) = 10-27 l2 aufweist [83]. CdS-Partikel mit Größen über 8 nm absorbieren Licht mit einer Wellenlängen von . = 515 nm, was für die gelbe Farbe von CdS verantwortlich ist [104]. CdS-NP mit Größen unter 8 nm weisen hingegen auf Quantene.ekten beruhende optische Eigen­ 4.3 Cadmiumhaltige Polymersomen schaften auf [104]. Diese bewirken, dass sich die Wellenlänge der Absorptionskante mit abnehmender Partikelgröße verringert (s. Abb. 52). Denn je kleiner CdS-Partikel sind, desto größer ist die für das Anheben eines Elektrons auf ein höheres Energieniveau notwendige Energie, da die entsprechenden Energieniveaus höher liegen als im makro­skopischen Kristall. Dieser E.ekt kann auch als Vergrößerung der Energielücke von CdS mit abnehmender Partikelgröße beschrieben werden [104]. Der Zusammenhang zwischen der Größe von CdS-NP und der Lage der CdS-Absorptionskante konnte experimentell und theoretisch veri.ziert und quanti.ziert werden [104,105]. Dieser Zusammenhang kann auch zur Bestimmung der Größe von in Vesikeln gebildeten CdS-NP ausgenutzt werden. Dazu wird die Ausfällung von CdS in Liposomen UV/Vis­spektrokopisch verfolgt und die Größe der intravesikulär gebildeten CdS-NP zu einem beliebigen Zeitpunkt graphisch aus dem jeweiligen Absorptionsspektrum mithilfe von Vergleichsdaten ermittelt [18,103]. 4.3.2 Herstellung und Charakterisierung Cd2+-haltiger Polymersomen Mit der Filmhydratisierungsmethode wurden in 1,6 mM PB-PEO-Polymersomen 100 bzw. 300 mM CdCl2-Lösungen bei unterschiedlichen pH-Werten eingeschlossen. Die Mo­di.kation dieser Parameter diente zur Veri.zierung möglicher Ein.ussfaktoren auf die Einschlussrate von Cd2+-Ionen in Polymersomen sowie auf die CdS-Ausfällung im In­neren von Polymersomen. Als Pu.erlösungen kamen dabei jeweils 100 mM Lösungen eines Citrat-(pH 2), Acetat-(pH 4-5) oder TRIS-HCl-Pu.ers (pH 7) zum Einsatz. Die ohne Extrusion erhaltenen, aufgereinigten Polymersomendispersionen waren farblos und polydispers. Der Cd2+-Gehalt aufgereinigter Polymersomendispersionen wurde in ausgewählten Pro­ben exemplarisch mittels FAAS bestimmt. Dazu wurde eine Fünfpunkt-Kalibration im Konzentrationsbereichvon0,1 -1,0mg/mlmiteinemCd-Standardvorgenommen.Diezu vermessenden Proben wurden mit konzentrierter HNO3 aufgeschlossenen, auf de.nierte Volumina verdünnt und anschließend vermessen. Die Ergebnisse dieser Bestimmungen sind in Abb. 53 dargestellt. Es ist zu erkennen, dass im sauren Milieu bei pH 2 ein geringerer Cd2+-Gehalt in Po­lymersomen realisiert werden konnte als im schwach sauren bzw. neutralen Milieu. So wurde bei Einsatz einer 100 mM CdCl2-Lösung in Citratpu.er (pH 2) ein Cd2+-Gehalt von 0,042 ± 0,016 mM erzielt. Hingegen konnte bei den untersuchten höheren pH­ mendispersionen bei unterschiedlichen pH-Werten und einer Startkonzentration von 100 mM CdCl2; * -Startkonzentration 300 mM CdCl2 Werten jeweils ein Cd2+-Gehalt von ca. 0,1 mM realisiert werden. Bei pH 4-5 wurde ein Cd-Gehalt von 0,100 ± 0,033 mM und bei pH 7 von 0,103 ± 0,048 mM gefunden. Zudem wird bei einer Verdreifung der CdCl2-Startkonzentration auf 300 mM auch ein annähernd dreifacher Cd2+-Gehalt von 0,278 ± 0,039 mM in der aufgereinigten Poly­mersomendispersion realisiert. Gleichwohl sind die absoluten Werte des Cd2+-Gehalts deutlich niedriger als die Werte von aufgereinigten Fe2+-oder Ni2+-haltigen Polymerso­mendispersionen (vgl. Abb. 27 und 47). Dies könnte an einer nicht vollständigen Hydra­tisierung des Polymer.lms und damit einer verringerten PB-PEO-Konzentration in der Polymersomendispersion liegen. 4.3.3 Herstellung und Charakterisierung CdS-haltiger Polymersomen Zur Ausfällung von intravesikulärem CdS in aufgereinigten, Cd2+-haltigen Polymerso­men wurde die Polymersomendispersion mit einer gesättigten wässrigen H2S-Lösung gemischt. Dabei konnte eine rasche gelbliche Verfärbung der zuvor farblosen Dispersion beobachtet werden. 4.3 Cadmiumhaltige Polymersomen UV/Vis-spektroskopische Verfolgung der CdS-Fällung Der zeitliche Verlauf der Absorption von aufgereinigten, Cd2+-haltigen Polymersomen­dispersionen nach Inkubation mit H2S wurde mittels UV/Vis-Spektroskopie verfolgt. Dabei wurde systematisch der Ein.uss der Parameter interner pH-Wert, intravesikuläre Cd2+-Konzentration sowie die zugesetzte Menge an H2S untersucht. Zur Gewährleis­tung einer möglichst guten Reproduzierbarkeit und Vergleichbarkeit aller Messungen kam dabei eine gesättigte wässrige H2S-Lösung (cH2S ˜ 100 mM) zum Einsatz, die in bestimmten Volumen-Verhältnissen mit der Cd2+-haltigen Polymersomendispersion gemischt wurde. Die intravesikuläre CdS-Fällungsreaktion wurde insgesamt über einen Zeitraum von maximal 30 min verfolgt. Über diesen Zeitraum hinaus fand keine de­tektierbare Veränderung des UV/Vis-Spektrums der Proben mehr statt. Aufgrund der intensiven Streuung von einfallendem Licht durch die Polymersomendispersionen wur­den jeweils um die Vesikelstreuung korrigierte UV/Vis-Spektren dargestellt und ausge­wertet. Dazu wurde von allen Spektren jeweils das UV/Vis-Spektrum der im gleichen Mischungsverhältnis mit H2O verdünnten Polymersomendispersion subtrahiert. Die La­ge der Absorptionskante der CdS-Partikel-Absorption wurde wie in [103] beschrieben graphisch im jeweiligen UV/Vis-Spektrum als Schnittpunkt der Basislinie mit der Tan­gente an die Schulter der CdS-Absorptionsbande bestimmt. Ein Beispiel der graphischen Ermittlung der CdS-Absorptionskante ist in Abb. 54 dargestellt. In Abb. 55 ist das Ergebnis der UV/Vis-spektroskopischen Verfolgung der Fällungsre­aktion von CdS im Inneren von Polymersomen (Abb. 55a) sowie als Vergleich in einer 0,8 mM CdCl2-Lösung (Abb. 55b) dargestellt. In beiden untersuchten Systemen ist ein starker Anstieg der Absorption bei Wellenlängen von . < 500 nm, überlagert von der Schulter einer Absorptionsbande, zu erkennen. Aus der Lage der Absorptionskante die­ser Schulter .thres kann die jeweilige Größe der Licht absorbierenden CdS-NP und das Wachstum derselben abgeschätzt werden [18]. Laut Referenzdaten aus [105] entspricht die für die intravesikuläre CdS-Fällung ermittelte Absorptionskante nach 30 s Reakti­onszeit bei .thres ˜ 480 nm einer Partikelgröße von 4,9 nm. Nach Abschluss der Fäl­lungsreaktion nach 20 min liegt die Absorptionskante bei .thres ˜ 490 nm, was einer CdS-Partikelgröße von 5,6 nm entspricht. Es tritt also eine Zunahme der Partikelgröße im Verlauf der Untersuchung auf. Fällt man CdS hingegen aus einer 0,8 mM CdCl2-Lösung, so liegt der erste ermittel­bare Wert der Absorptionskante bei .thres ˜ 495 nm. Dies entspricht einer Partikel­größe von 5,9 nm. Die nach 30 min ermittelte Wellenlänge der Absorptionskante von .thres ˜ 510 nm entspricht einer Partikelgröße von ca. 8,4 nm. Gleichwohl liegt die Wel­lenlänge der Absorptionskante sehr nah an dem Wert von .thres = 515 nm für bulk CdS [104]. Dies könnte auf den fehlenden, das Partikelwachstum begrenzenden Ein.uss der Kompartimentierung oder auch auf die höhere Cd2+-Konzentration in Lösung zu­ 4.3 Cadmiumhaltige Polymersomen rückgeführt werden. Die CdS-Partikelgröße in Lösung ist schon zu Beginn der Fällungsreaktion deutlich grö­ßer als die der kompartimentierten Partikel in Polymersomen. So liegt die Absorpti­onskante der gebildeten CdS-Partikel in Lösung bereits nach fünf Sekunden bei einem höheren Wert als für die kompartimentierte Fällung nach 20 min. Nach einer vergleich­baren Reaktionszeit weisen die in Lösung gebildeten CdS-Partikel bereits eine Absorp­tionskante auf, die nahezu der von makroskopischem CdS entspricht. Dies dürfte auf Aggregationsprozesse oder Ostwald-Reifung, d.h. große Kristallisationskeime wachsen auf Kosten kleinerer Keime, in der resultierenden Suspension zurückzuführen sein, da die entstandenen Kristallisationskeime nicht durch Stabilisatoren oder durch Komparti­mentierung räumlich voneinander getrennt vorliegen. Ein.ussfaktoren auf die Größe gebildeter CdS-Partikel Zusätzlich zur rein phänomenologischen Charakterisierung der CdS-Fällung im Inneren von Polymersomen und in Lösung erfolgten systematische Untersuchungen zur Veri.zie­rung des Ein.usses von Faktoren wie pH-Wert, CdCl2-Startkonzentration und der zu­gesetzten H2S-Konzentration auf die Größe der gebildeten CdS-Partikel. Dazu wurde in denjeweiligenUV/Vis-SpektrendieLagederCdS-Absorptionskantegraphischbestimmt und dann anhand von Referenzdaten aus [104] die dazugehörige CdS-Partikelgröße er­mittelt. Der mögliche Ein.uss des pH-Wertes wurde anhand von drei Ansätzen mit einer kon­stanten CdCl2-Startkonzentration von 300 mM in drei unterschiedlichen Pu.ersystemen untersucht. Polymersomendispersionen wurden in Citratpu.er (pH 2), Acetatpu.er (pH 4-5) sowie TRIS-HCl-Pu.er (pH 7) hergestellt und mittels Dialyse aufgereinigt. Die er­haltenenDispersionenwurdenmitdemdoppeltenVolumeneinergesättigtenH2S-Lösung gemischt undUV/Vis-Spektrenübereinen Zeitraum vonmaximal 30 min aufgenommen. Dabei zeigte sich, dass die erhaltenen UV/Vis-Spektren nach 20 min Messzeit konstant blieben. Die aus der Lage der Absorptionskante jeweils ermittelten Partikelgrößen sind in Abb. 56 dargestellt. Es ist eindeutig zu erkennen, dass in allen betrachteten Fällen die Partikelgröße mit der Inkubationszeit zunimmt. Zudem ist als klarer Trend zu erkennen, dass die maximale Partikelgröße mit zunehmendem pH-Wert abnimmt. Bei pH 2 liegt die Absorptionskan­te nach 20 min Inkubationszeit schon bei .thres ˜ 515 nm, dem Wert von bulk CdS. Die einzige Aussage über die maximale Partikelgröße ist in diesem Fall, dass diese bei = 8,5 nm liegt. Folglich werden bei der Inkubation mit einer H2S-Lösung bei Vorlie­gen eines intravesikulären sauren Milieus (pH 2) größere CdS-Partikel gebildet als bei höheren pH-Werten. Da die Absorptionskante nur Information über die Größe der größ­ten nicht aber über die Anzahl an gebildeten CdS-Partikeln gibt, könnte der Befund dadurch erklärt werden, dass sich mit steigendem pH-Wert eher eine größere Anzahl kleiner CdS-Partikel (statt weniger großer CdS-Partikel) bildet. Des weiteren wurde untersucht, ob die Menge der zu aufgereinigten, Cd2+-haltigen Poly­mersomen zugesetzten gesättigten H2S-Lösung einen Ein.uss auf die Größe der gebilde­ten intravesikulären CdS-Partikel hat. Es erfolgten UV/Vis-Untersuchungen einer Cd2+­haltigen Polymersomendispersion (Startkonzentration: 300 mM CdCl2 in Acetatpu.er), zu der 100, 200 und 300 V% einer gesättigten wässrigen H2S-Lösung (cH2S ˜ 100 mM) zugesetzt wurden. Folglich wurde in den jeweiligen Polymersomendispersionen eine ex­terne H2S-Konzentration von ca. 50 mM (bei Zusatz von 100 V% H2S-Lösung), 66 mM (Zusatz von 200 V% H2S-Lösung) sowie 75 mM (Zusatz von 300 V% H2S-Lösung) ein­gestellt. 4.3 Cadmiumhaltige Polymersomen Es zeigte sich, dass sich die Lage der Absorptionskante nach gleichen Inkubationszeiträu­men nur minimal mit Zunahme der H2S-Konzentration zu höheren Wellenlängen ver­schiebt. Dies bedeutet, dass die maximale Größe der gebildeten CdS-Partikel mit zuneh­mender H2S-Konzentration leicht zunimmt und zwar von 5,2 nm (.thres ˜ 485 nm) auf 5,6 nm (.thres ˜ 490 nm) nach 30 s Inkubationszeit und von 5,6 nm (.thres ˜ 490 nm) auf 6,6 nm (.thres ˜ 500 nm) nach 30 min Inkubationszeit (s. Abb. 57). Folglich hat die Erhöhung der H2S-Konzentration im System über einen Wert von ca. 50 mM (bei einer 1:1-Mischung) nur einen geringen Ein.uss auf die Größe der gebildeten CdS-Partikel. Dies dürfte am großen Überschuss des H2S liegen, da der Cd2+-Gehalt der verwende­ten Polymersomendispersion bei ca. 0,3 mM liegt. Die mittlere, intravesikuläre Cd2+­Konzentration liegt deutlich höher, da nur ein geringer Teil des Gesamtvolumens der Dispersion im Inneren von Polymersomen eingeschlossen wird. Als dritter Parameter wurde der Ein.uss der CdCl2-Startkonzentration auf die maxima­le Größe der gebildeten CdS-Partikel untersucht. Bei der Quanti.zierung konnte gezeigt werden, dass sich ein deutlich höherer Cd2+-Gehalt bei der Verdreifachung der Startkon­zentration realisieren ließ (s. Abb. 53). Es wurden bei drei verschiedenen pH-Werten von pH 2, 4-5 sowie 7 jeweils mit einer 100 mM bzw. 300 mM CdCl2-Lösung Polymersomen­ Abb. 58: aus der Lage derCdS-Absorptionskante graphisch ermittelte maximale Partikelgröße von in Polymersomen gebildetem CdS 30 s und 30 min nach der Inkubation mit dem doppelten Volumen einer gesättigten wässrigen H2S-Lösung in (a) Citratpu.er pH 2 und (b) in Acetatpu.er pH 4-5 für verschiedene CdCl2-Startkonzentrationen; für Werte bei pH 7 s. Abb. 56; Partikelgröße = 8,5 nm durch schra.ertes Kästchen indiziert dispersionen hergestellt und nach der Aufreinigung mit einer gesättigten H2S-Lösung versetzt. Der zeitliche Verlauf der UV/Vis-Spektren wurde aufgezeichnet und aus den aufgenommenenSpektren 30 s und30 min nach der Inkubation die Absorptionskanteder CdS-Partikel bestimmt. Dabei konntebeidenUntersuchungenbeipH 7 keinUnterschied der Partikelgröße für die unterschiedlichen CdCl2-Konzentrationen festgestellt werden. Für in Citratpu.er (pH 2) erhaltene Polymersomen ist die aus der Lage der Absorptions­kantejeweilsermitteltemaximalePartikelgrößeinAbb.58adargestellt.Esisterkennbar, dass bei einer höheren Startkonzentration die anfängliche maximale CdS-Partikelgröße größer ist. Nach 30 min liegt die Absorptionskante beider untersuchter Dispersionen bei .thres ˜ 515 nm, so dass die maximale Partikelgröße bei = 8,5 nm liegen muss. Bei höhe­rer intravesikulärer CdS-Konzentration tritt folglich zu Beginn der CdS-Ausfällung eine raschere Zunahme der Partikelgröße auf. Allerdings ist nach 30 min keinerlei Unterschied zwischen den Vesikeldispersionen unterschiedlicher Cd2+-Konzentration zu detektieren. Dies deutet darauf hin, dass die Fällungsreaktion nach diesem Zeitintervall abgeschlos­sen ist. Die Untersuchung bei pH 4-5 ergab indes, dass bei einer CdCl2-Startkonzentration von 100 mM ein rascheres Partikelwachstum als bei einer Startkonzentration von 300 mM 4.3 Cadmiumhaltige Polymersomen auftrat (s. Abb. 58b). Auch am Ende der CdS-Fällungsreaktion nach 30 min lagen bei einer Startkonzentration von 100 mM CdCl2 größere Partikel als für Polymersomen mit einer Startkonzentration von 300 mM CdCl2 vor. Die Ursache dafür ist unklar. In der Literatur .nden sich indes keine einheitlichen Angaben über den Ein.uss der CdCl2-Startkonzentration auf die maximale Partikelgröße von in Vesikeln ausgefälltem CdS. So wurde bei der vergleichenden Untersuchung von Lecithin-Vesikeldispersionen, die mit einer 100 mM bzw. einer 300 mM CdCl2-Lösung hergestellt wurden, keinerlei Unterschied der anfänglichen und der .nalen CdS-Partikelgröße im Verlauf der intra­vesikulären Ausfällung beobachtet [18] . Gleichwohl wird in [21] von einer Korrelation zwischen der .nalen CdS-Partikelgröße in Liposomen und der intravesikulären CdCl2 ­Konzentration berichtet. Allerdings wird nicht angeführt, in welchem Konzentrationsbe­reich von CdCl2 gearbeitet wurde, so dass diese Ergebnisse womöglich nicht im Wider­spruch zu dem zuerst aufgeführten Bericht stehen. Cryo-TEM von CdS-haltigen Polymersomen Zur Visualisierung von aufgereinigten, Cd2+-haltigen Polymersomen sowie potenzieller CdS-Niederschläge nach der Inkubation mit einer gesättigten wässrigen H2S-Lösung er­folgten Cryo-TEM-Untersuchungen. Neben der Visualisierung von CdS-Niederschlägen im Allgemeinen sollte eine Bestimmung der Größe der gebildeten CdS-Partikel zur Ve­ri.zierung der Ergebnisse der UV/Vis-Untersuchungen erfolgen. Zunächst wurden mit einer 300 mM CdCl2-Lösung in TRIS-HCl-Pu.er hydratisierte Polymersomen nach der Aufreinigung untersucht. Zwei repräsentative Aufnahmen sind in Abb. 59 dargestellt. Es sind ausschließlich unilamellare Vesikel zu erkennen, wobei die Mehrzahl der Vesikel mit Größen unter 150 nm auf den Kohlensto.stegen des Grids lokalisiert sind. Größere Vesikel sind in einigen Fällen nicht ideal sphärisch und weisen zudem Deformationen auf. Bei den Untersuchungen wurden keinerlei Vesikel gefunden, die dunkle Aggregate aufweisen. Eine Probe dieser aufgereinigten, Cd2+-haltigen Vesikeldispersion wurde mit demselben Volumen einer gesättigten H2S-Lösung versetzt und anschließend mittels Cryo-TEM un­tersucht. Dabei konnten bei mehr als 75 % der Polymersomen mit einer Größe von über 100 nm eindeutig dunkle Aggregate visualisiert werden. Dabei kann zwischen sehr klei­nen Aggregaten (jeweils durch schwarze Pfeile indiziert) im Bereich von 1,5 -3 nm sowie größeren Aggregaten (jeweils durch rote Pfeile indiziert) mit einer Größe zwischen 6 nm und 9 nm unterschieden werden. Die Aggregate liegen nur in Ausnahmefällen erkennbar extern vor (z.B. auf Abb. 60b, s. roter Kreis). Die aufgenommenen Abbildungen wei­sen indes darauf hin, dass sich die vesikelassoziierten Aggregate praktisch ausschließlich 4.3 Cadmiumhaltige Polymersomen Abb. 61: Cryo-TEM-Aufnahmen von aufgereinigten, Cd2+-haltigen Polymersomen (Startkon­zentration: 300 mM CdCl2 in TRIS-HCl-Pu.er) nach Inkubation mit einer gesättig­tenwässrigenH2S-Lösung;(a):kleinere(schwarzePfeile)undgrößereCdS-Aggregate (rote Pfeile) in Polymersomen erkennbar; (b): Vergrößerung des bei (a) unten abge­bildeten Polymersoms; Abweichung von der ideal sphärischen Form durch internen CdS-Niederschlag innerhalb der Polymersomen be.nden. Dies konnte zum einen anhand einer Kippserie eindeutig bewiesen werden. Zum anderen zeigt die Vergrößerung eines Polymersoms in Abb. 61b, dass dessen Form von der ideal sphärischen Form erkennbar abweicht und eine geringere Krümmung in dem Bereich der großen CdS-Aggregate aufweist (vgl. Form des roten Kreises). Dies ist höchstwahrscheinlich auf eine Membrandeformation durch die Anlagerung des ausgedehnten internen CdS-Niederschlags zurückzuführen. Auch in Abb. 60 sind Polymersomen mit einer Größe über 200 nm zu erkennen, die nicht mehr ideal sphärisch sind. Auch bei diesen könnte die Wechselwirkung der Membran mit dem internen CdS-Niederschlag die Ursache für die Deformation sein. Allerdings wiesen Polymersomen mit dieser Größe bereits vor der Inkubation mit H2S Deformationen auf (s. Abb. 59), welche in jenem Fall womöglich durch die Probenvobereitung für die Cryo- TEM bedingt sind. Die CdS-Partikel können nicht scharf voneinander abgegrenzt visualisiert werden, da die zur Realisierung einer so hohen Au.ösung notwendige Energie des Elektronenstrahls die Vesikel zerstören würden. Somit kann nicht mit Sicherheit zwischen einzelnen großen Partikeln und Aggregaten kleinerer Partikel unterschieden werden. Dennoch liegt die Größe der Partikel auf den Cryo-TEM-Aufnahmen ungefähr in dem Bereich, der auch bei der Auswertung der UV/Vis-Spektren ermittelt wurde. 4.3.4 Diskussion -CdS-haltige Polymersomen Sowohl die visuell erkennbare gelbe Verfärbung, die zeitliche Änderung der UV/Vis-Spektren, als auch Cryo-TEM-Aufnahmen belegen die Bildung von CdS-Niederschlägen bei der Inkubation von aufgereinigten, Cd2+-haltigen Polymersomen mit einer gesättig­ten H2S-Lösung. Mittels Cryo-TEM konnte gezeigt werden, dass die gebildeten CdS-NP fast ausnahmslos intravesikulär vorliegen. Die Lokalisierung konnte dabei eindeutig anhand einer Kippserie über einen Bereich von 60. belegt werden. Zudem konnte ex­emplarisch anhand eines Polymersoms mit CdS-Niederschlägen eine Veränderung der Membrankrümmung in Nachbarschaft zu den CdS-Aggregaten nachgewiesen werden, was ebenfalls die Annahme der internen Lokalisierung von CdS-Niederschlägen unter­mauert. Trotz Limitierung konnte die Größe der gebildeten CdS-Aggregate aus den Cryo-TEM-Aufnahmen abgeschätzt werden und liegt in einem Bereich von 1,5 -9 nm. Somit stim­men die elektronenmikroskopisch ermittelten Größen sehr gut mit dem Bereich der über die UV/Vis-Messungen ermittelten maximalen Größe der CdS-Aggregate überein. In der Literatur sind nur zwei Beispiele bekannt, bei denen ebenfalls CdS-NP unter ver­gleichbaren Bedingungen in und an Liposomen generiert und dann mittels Cryo-TEM visualisiert werden konnten [21,22]. Auf den dort gezeigten Aufnahmen weisen alle Lipo­somen mit einer Größe von ca. 70 nm selektiv nur ein einziges CdS-NP mit einer von der CdCl2-Konzentration abhängigen Größe von 2,2 -5,9 nm auf [21,22]. Größere interne Aggregate von CdS-NP, wie sie im Fall der deutlich größeren Polymersomen beobachtet wurden, sind nicht zu erkennen. Die beobachteten größeren CdS-Aggregate im Inneren der Polymersomen können auf eine vergleichsweise größere Vesikelgröße und/oder auf eine höhere interne Cd2+-Konzentration zurückzuführen sein. Eine größere Anzahl an internen Cd2+-Ionen bildet auch größere CdS-Partikel bzw. -Aggregate. Die aus den UV/Vis-Spektren über die Lage der Absorptionskante von CdS-Partikeln bestimmten maximalen Partikelgrößen lagen in einem Bereich von 5 nm bis über 8,5 nm. Folglich führt die CdS-Fällungsreaktion nach der Inkubation von aufgereinigten, Cd2+­haltigen Polymersomendispersionen mit einer gesättigten H2S-Lösung zu einer raschen 4.3 Cadmiumhaltige Polymersomen Bildung vonCdS-Partikelnschon innerhalb von 30 Sekunden. Spätestens nach 30 min ist in keiner der untersuchten Dispersionen mehr eine Änderung der Lage der Absorptions­kante zu beobachten. Teilweise verschob sich die CdS-Absorptionskante in weniger als 30 min bis zur „Grenze“ von bulk CdS mit einer Absorptionskante bei .thres = 515 nm. Auch bei [18] war die CdS-Fällungsreaktion in 30 nm großen aufgereinigten, Cd2+­haltigen Liposomen (bei identischer CdCl2-Startkonzentration) nach 20 min abgeschlos­sen. Gleichwohl wurden dort nur Partikel bis zu einer maximalen Größe von 6 nm aus­gefällt [18]. Dies kann auf die dort durch Ultraschall hergestellten, deutlich kleineren Ve­sikel zurückgeführt werden, die bei vergleichbaren Cd2+-Gehalt eine geringe Anzahl an Cd2+-Ionen als die größeren Polymersomen aufweisen. Vergleichbare UV/Vis-Spektren aufgrund der Bildung vergleichbar großer, vesikulärer CdS-Partikel sind auch in [21] zu .nden. Interessante und unerwartete Ergebnisse förderte die Untersuchung der Ein.ussfaktoren auf die Lage der CdS-Absorptionskante und damit der maximalen Partikelgröße nach einheitlichen Messzeiten von 30 Sekunden sowie 30 min zu Tage. So zeigte sich, dass umso größere Partikel gebildet werden, je niedriger der intra-und extravesikuläre pH ist (Abb. 56). Dabei war der externe pH-Wert durch entsprechende Dialysemedien stets gleich dem internen pH-Wert. Allerdings sollte der externe pH-Wert mit Ausnahme des TRIS-HCl-Pu.ers ohne großen Ein.uss sein, da dieser stets = 7 war. Somit würde nur in externem TRIS-HCl-Pu.er ein Teil des zugesetzten H2S in HS-Ionen umgewandelt. Von der Abnahme der Partikelgröße bei zunehmendem externem pH-Wert einer zugesetzten Na2S-Lösung wird auch in [18] berichtet. Dort erfolgten die Untersuchungen jedoch im Bereich von pH 7-10. Die rasche H2S-Permeation ins Innere von Vesikeln ist nicht der geschwindigkeitsbestim­mende Schritt der CdS-Fällung, sondern vielmehr ein komplexerer intravesikulärer Pro­zess, der noch nicht genauer charakterisiert wurde [18]. Darum kann angenommen wer­den, dass das pH-abhängige Verhältnis von Keimbildungs-zur Keimwachstumsgeschwin­digkeit im Vesikelinneren entscheidend für die resultierende maximale CdS-Partikelgröße ist. In das Vesikelinnere eindi.undierende H2S-Moleküle stehen mit abnehmendem pH­WertmiteinemimmermarginalerenAnteilanS2--Ionen,demmaßgeblichenReagenzfür dieBildungvonCdS,imGleichgewicht(vgl.DiskussionimKapitel3.3.5).Folglichbilden sich im Fall des Citratpu.ers (pH 2) aufgrund der geringen Gleichgewichtskonzentration von S2--Ionen nur vergleichsweise wenige CdS-Kristallisationskeime, während bei höhe­rem pH, d.h. höherer S2--Ionenkonzentration, rascher viele kleine CdS-Keime entstehen. Aufgrund der verbleibenden hohen intravesikulären Cd2+-Konzentration bei pH 2 spielt somit wahrscheinlich das CdS-Keimwachstum eine gewichtigere Rolle und führt zur Bil­dung größerer Partikel als bei pH 4-5 sowie pH 7. Bei diesen höheren pH-Werten verur­sachen vermutlich die vielen, rasch gebildeten kleinen CdS-Keime eine starke Abnahme der intravesikulären Cd2+-Konzentration, so dass das Keimwachstum nicht mehr zu ei­ner wesentlichen Größenzunahme der CdS-Partikel führen kann. Zudem scheinen mög­liche Aggregationsprozesse im Zeitfenster der UV/Vis-Messungen die geringere Größe der Keime nicht maßgeblich zu verändern. Diese Hypothese wird durch die Beobachtung untermauert, dass auf Cryo-TEM-Aufnahmen von bei pH 7 hergestellten, CdS-haltigen Polymersomen tatsächlich eine Vielzahl von Polymersomen viele sehr kleine CdS-NP mit einer Größe unter 3 nm aufweisen (Abb. 60b und 61a,b; indiziert schwarze Pfeile). Dies ist ein Indiz für die postulierte Bildung einer Vielzahl von CdS-Kristallisationskeimen bei pH 7. Eine pH-abhängige Kristallbildungs-sowie -wachstumsgeschwindigkeit könnte auch die Bildung größerer CdS-Partikel bei abnehmendem pH trotz gleichzeitig abnehmender Cd2+-Konzentration in Einklang bringen. Schließlich ergab die Quanti.zierung von Cad­miuminaufgereinigtenPolymersomendispersionen(Abb.53),dassinCitratpu.er(pH2) ein geringerer Cd2+-Gehalt vorlag als in Acetat-und TRIS-HCl-Pu.er. Dennoch konnte zumindest für die CdCl2-Startkonzentration kein eindeutig erkennbarer Trend des Ein­.usses auf die CdS-Partikelgröße festgestellt werden. Auch bei Vassiltsova et al., die dieselben CdCl2-Startkonzentrationen (100 mM und 300 mM) wie im Fall der Polymer­somen verwendeten, konnte keineAbhängigkeitder CdS-Partikelgröße von der jeweiligen Cd2+-Startkonzentration in Liposomen festgestellt werden [18]. Eine Erhöhung der Menge an zugesetztem H2S führte zu einer, wenn auch geringen Zu­nahme der Wellenlänge der Absorptionskante und somit zu größeren CdS-Partikeln. Dies ist in Übereinstimmung mit den Beobachtungen von Yu et al. [103]. 4.4 Kupferhaltige Polymersomen 4.4 Kupferhaltige Polymersomen 4.4.1 Vorbemerkungen Cu2+-haltige Liposomen sind von besonderem pharmakologischen Interesse, da geeignete Arzneisto.e wie z.B. Mitoxantrone in vorgeformten, Cu2+-haltigen Liposomen mittels des so genannten active loading verkapselt werden können [106]. Die Triebkraft für den mit hohen Ausbeuten realisierbaren Einschluss liegt in der intravesikulären Komplexie­rung des permeablen Arzneisto.s durch Metallionen wie Cu2+-Ionen. Als Metallkomplex kann der Arzneisto. nicht mehr durch die Membran di.undieren und verbleibt somit dauerhaft im Vesikelinneren. Cu2+-haltigen Polymersomen, die bislang noch nicht beschrieben wurden, konnten hier vergleichend zu Cd2+-und CdS-haltigen Polymersomen hergestellt und zur intravesiku­lären CuS-Fällung mit einer gesättigten H2S-Lösung versetzt wurden. CuS besitzt ein noch niedrigeres Löslichkeitsprodukt als CdS und fällt darum ebenfalls schon bei pH < 1 aus Cu2+-haltigen Lösungen bei Inkubation mit H2S als schwarzer Feststo. aus [83]. Von der Synthese intravesikulärer CuS-NP in Liposomen wurde bereits berichtet [19,20]. Aufgrund der Reaktionskinetik der Fällungsreaktion in Liposomen postulieren Igume­nova et al., dass sich in Liposomen nicht-stöchiometrische CuSx-NP bilden können, die eine überraschend hohe photokatalytische Aktivität aufweisen [19]. Diese Aktivität wird auf eine katalytische Oxidation von anwesenden S2--Ionen durch Cu2+-bzw. Cu+-Ionen bei der Bestrahlung zurückgeführt [19]. 4.4.2 Herstellung und Charakterisierung Cu2+-haltiger Polymersomen Es wurden Polymersomen mit einer 100 mM bzw. 500 mM CuCl2-Lösung bei pH 2 (Ci­tratpu.er) sowie pH 4-5 (Acetatpu.er) mit der Filmhydratisierungsmethode hergestellt. Das Arbeiten bei noch höheren pH-Werten ist aufgrund der damit verbundenen Ausfäl­lung von Cu(OH)2 nicht möglich. Die erhaltenen Cu2+-haltigen Polymersomen wurden mittels Dialyse in drei Schritten unter Verwendung von EDTA aufgereinigt. Es wurden farblose, polydisperse Vesikeldispersionen erhalten. DerCu-GehaltaufgereinigterPolymersomendispersionenwurdemittelsFAASbestimmt. Dazu erfolgte eine Fünfpunkt-Kalibration im Konzentrationsbereich von 0,1 -1,0 mg/ml mit einem Kupfer-Standard. Die aufgereinigten Polymersomendispersionen wurden mit konzentrierter HNO3 aufgeschlossen, auf ein de.niertes Volumen gebracht und anschlie­ßend vermessen. Die Ergebnisse der Kupfer-Bestimmung sind in Abb. 62 dargestellt. Die Ergebnisse der Quanti.zierung zeigen, dass sowohl der pH-Wert als auch die CuCl2 ­Startkonzentration den Cu2+-Gehalt von aufgereinigten Polymersomendispersionen be­ein.ussen. Dabei geht der Einsatz von Acetatpu.er (pH 4-5) im Vergleich zu Citratpuf­fer (pH 2) bei beiden untersuchten CuCl2-Startkonzentrationen mit einem mindestens doppelt so hohen Cu2+-Gehalt einher. Der deutlich höhere Cu2+-Gehalt in Acetatpuf­fer könnte mit der Ausbildung geringer Mengen von Cu(OH)2-Aggregaten zusammen­hängen. Unter Verwendung des Löslichkeitsprodukts von Cu(OH)2 ergibt sich, dass in einer 100 mM Cu2+-Lösung oberhalb von pH 4,8 Cu(OH)2 gebildet wird. Auftreten­de Cu(OH)2-Aggregate könnten durch die damit verbundene lokale Aufkonzentrierung beim Einschluss in Polymersomen zu einer höheren Einschlussrate von Kupfer führen. Dennoch wirkt auch der eingesetzte Acetatpu.er als schwacher Ligand stabilisierend. Die Verfün.achung der CuCl2-Startkonzentration auf 500 mM führt in aufgereinigten Polymersomendispersionen zum 2,6-fachen Cu2+-Gehalt bei Verwendung von Citratpuf­fer (pH 2) bzw. zum 1,9-fachen Cu2+-Gehalt beim Arbeiten in Acetatpu.er (pH 4-5). Dass der Cu2+-Gehalt in aufgereinigten Polymersomendispersionen sich nicht um den gleichen Faktor wie die Startkonzentration verändert, könnte an der deutlich höheren Ionenstärke im System liegen. 4.4 Kupferhaltige Polymersomen 4.4.3 Herstellung und Charakterisierung CuS-haltiger Polymersomen Aufgereinigte, Cu2+-haltige Polymersomendispersionen wurde analog zu Cd2+-haltigen Polymersomen mit einer gesättigten wässrigen H2S-Lösung (cH2S ˜ 100 mM) versetzt, um intravesikulär CuS auszufällen. Makroskopisch konnte dabei keine Verfärbung beob­achtet werden, was womöglich auf die starke Lichtsstreuung der Polymersomen zurück­zuführen ist. Die zeitliche Veränderung der Absorption von aufgereinigten, Cu2+-haltigen Polymer­somendispersionen nach der Inkubation mit dem doppelten Volumen einer gesättigten H2S-Lösung wurde mittels UV/Vis-Spektroskopie verfolgt. Aufgrund der Lichtstreuung der Polymersomen wurde hierbei von den erhaltenen UV/Vis-Spektren jeweils als Refe­renz das Spektrum der mit derselben Menge H2O verdünnten Polymersomendispersion subtrahiert. Da CuS schwarz ist, können, anders als bei der Bildung von CdS-NP, keinerlei spezi­.sche Absorptionsbanden bei der Entstehung von CuS-NP beobachtet werden. Somit lassen die erhaltenen UV/Vis-Spektren nur eine qualitative Aussage über die Bildung von CuS-Keimen und den damit verbundenen Anstieg der Absorption bzw. Streuung zu. Die zeitliche Veränderung des UV/Vis-Spektrums einer aufgereinigten, Cu2+-haltigen Polymersomendispersion sowie als Vergleich für eine 0,8 mM CuCl2-Lösung nach In­kubation mit einer gesättigten H2S-Lösung ist in Abb. 63 dargestellt. Die Inkubation führt in beiden Fällen zu einer sehr raschen Zunahme der Absorption, insbesondere bei Wellenlängen unter 600 nm. Diese Zunahme ist wahrscheinlich auf die Bildung von CuS-NP zurückzuführen, die für die Herausbildung einer Streulichtkurve sorgen. Im Fall der CuCl2-Lösung (Abb. 63b) ist die CuS-Fällungsreaktion bereits eine Minute nach der Inkubation mit der H2S-Lösung praktisch abgeschlossen und keine Veränderung des UV/Vis-Spektrums bis nach 10 min mehr detektierbar. Die nach 30 min beobachtete ge­ringfügige Zunahme der Absorption kann durch Aggregationsprozesse der entstandenen CuS-NP verursacht sein. Die Ausfällung von kompartimentiertem CuS in Polymersomen (Abb.63a)führtebenfallszueineranfänglichraschenZunahmederAbsorptionaufgrund der Bildung von CuS-Keimen. Im weiteren Verlauf der Messung kann nur noch eine ge­ringe Erhöhung der Absorption bzw. Streuung bei Wellenlängen unter 600 nm detektiert werden. Das Wachstum von CuS-Keimen bzw. deren Aggregation scheint deutlich lang­samer als die anfängliche CuS-Keimbildung abzulaufen. Weitere Untersuchungen der Kinetik der intravesikulären CuS-Fällung mittels UV/Vis-Absorption ergaben, dass bei unterschiedlichen pH-Werten (pH 2 und 4-5) sowie ei­ner Cu2+-Startkonzentrationen von 500 mM bzw. 100 mM jeweils eine sehr rasche Zu­nahme der Absorption nach der Inkubation mit einer gesättigten H2S-Lösung auftrat (vgl. Abb. 63a). Die Absorption aufgereinigter, Cu2+-haltiger Polymersomendispersio­nen nahm jeweils schon innerhalb der ersten 30 s nach der H2S-Inkubation sehr stark zu und blieb dann im Verlauf der weiteren 30 min nahezu unverändert. Diese weiteren Ergebnisse bestätigen den Befund, dass im Inneren der Cu2+-haltigen Polymersomen ei­ne rasche CuS-Keimbildung gefolgt von einem nur noch langsamen CuS-Keimwachstum auftritt. 4.5 Diskussion -Übergangsmetallhaltige Polymersomen 4.5 Diskussion -Übergangsmetallhaltige Polymersomen Die eingehende Charakterisierung übergangsmetallhaltiger Polymersomen bestätigte ei­nige Erkenntnisse, die bei der Untersuchung eisenhaltiger Polymersomen gefunden wur­den, lieferte aber auch einige neue und unerwartete Einsichten. Insbesondere für die Untersuchung von CdS-haltigen Polymersomen standen aufgrund der photohalbleiten­den Eigenschaften des CdS ganz neue Analysemöglichkeiten zur Verfolgung der Metall­sul.dbildung in Polymersomen zur Verfügung. Zudem ermöglichten die Ergebnisse von Cryo-TEM-Untersuchungen NiS-und CdS-haltiger Polymersomen einen di.erenzierte­ren Blick auf die Bildung intravesikulärer Metallsul.d-NP und deren Stabilisierung in Vesikeln. Die Ergebnisse der Untersuchungen zu nickelhaltigen Polymersomen waren im wesentli­chen mit denen von eisenhaltigen Polymersomen vergleichbar. Dies wurde aufgrund der chemischen Verwandschaft von Eisen und Nickel auch erwartet. So wurden vergleichbare Einschlussraten von Ni2+-Ionen in Polymersomen wie für Fe2+-Ionen gefunden. Auch bei der Ausfällung von NiS in Ni2+-haltigen Polymersomen ließ sich anhand von Kontrollen belegen, dass es sich um eine intravesikuläre Fällungsreaktion handelt. Die Verfolgung der intravesikulären NiS-Fällungsreaktion mittels UV/Vis-Spektroskopie zeigte, dass ei­ne deutliche Zunahme der Lichtstreuung bzw. -absorption bei Wellenlängen . = 500 nm auftrat. Ein solcher E.ekt wurde ebenfalls bei der intravesikulären Ausfällung von FeS beobachtet und kann auf die Bildung von Metallsul.d-NP zurückgeführt werden, die einfallendes Licht mit abnehmender Wellenlänge stärker streuen. Die Ausfällung von NiS in Polymersomen konnte durch Cryo-TEM-Untersuchungen deutlicher belegt werden als es für FeS der Fall war. So konnte die Bildung von intrave­sikulären Aggregaten von NiS-NP mit Größen im einstelligen Nanometer-Bereich sowie größerer Aggregaten bis zu 24 nm Größe beobachtet werden. Bei der Untersuchung auf­gereinigter, Fe2+-haltiger Polymersomendispersionen, die sich nach der Inkubation mit H2S dunkel verfärbt hatten, konnten solche Aggregate nicht beobachtet werden. Ver­gleichbar hingegen sind die bei der Untersuchung von sowohl FeS-als auch NiS-haltigen Polymersomendispersionen vereinzelt beobachteten dunklen Membranablagerungen an der inneren Membran von Polymersomen. Es kommen verschiedene Ursachen für die großen Schwierigkeiten, die Bildung von FeS-NP in Polymersomen elektronenmikroskopisch nachzuweisen, infrage. Entweder sind die intravesikulären Bedingungen für eine Ausfällung von FeS-NP nicht gegeben. Oder die gebildeten FeS-NP lösen sich während der Lagerung bzw. während der Probenpräpa­ration für die Cryo-TEM aufgrund der Oxidationsemp.ndlichkeit von FeS oder einer hinreichend stark abnehmenden H2S-Konzentration (vgl. Kapitel 3.3.4) wieder auf. Eine weitere mögliche Erklärung ist, dass die gebildeten FeS-NP einen zu geringen Kontrast für die Visualisierung auf Cryo-TEM-Aufnahmen aufweisen. Dass eine intravesikuläre Ausfällung von FeS statt.ndet, konnte anhand von Kontroll­experimenten eindeutig belegt werden. Hingegen hatte es sich als schwierig erwiesen, intravesikuläre FeS-NP mittels Cryo-TEM zu visualisieren. Aufgrund der fast identi­schen Ordnungszahl sollten Eisen(sul.d) und Nickel(sul.d) im TEM einen praktisch identischen Kontrast aufweisen. Dennoch kann eine zu geringe Größe und damit ein zu geringer Kontrast von intravesikulären FeS-NP als Ursache für die Schwierigkeiten beim Nachweis mittels Cryo-TEM nicht mit Sicherheit ausgeschlossen werden. NiS weist ein um zwei Größenordnungen geringeres Löslichkeitsprodukt als FeS auf. Somit würde bei einem nur geringfügig überschrittenen Löslichkeitsprodukt im Inneren von Polymerso­men die Ausfällung von NiS im Vergleich zu FeS in weitaus größerem Umfang ablaufen und folglich größere Metallsul.d-NP gebildet werden. Am wahrscheinlichsten ist indes die Hypothese, dass zunächst gebildete FeS-NP sich deshalb nicht bei Cryo-TEM-Untersuchungen visualisieren lassen, da sie sich während der Lagerung (beobachtete Entfärbung!) oder während der Probenpräparation an Luft wieder au.ösen. Dies ist aufgrund der im Fall von NiS-haltigen Polymersomen beobach­teten geringen Größe gebildeter NiS-NP sehr gut vorstellbar. FeS-NP derselben Größe würden eine sehr große Ober.äche und damit eine hohe Reaktivität bzw. Emp.ndlich­keit aufweisen. Kupfer-und cadmiumhaltige Polymersomen ergänzten die vergleichenden Untersuchun­gen zu eisenhaltigen Polymersomen. Da beide Metalle zur Schwefelwassersto.gruppe im Kationen-Trennungsgang der qualitativen Analyse gehören [63], sollten diese beiden Me­talle miteinander vergleichbar sein. Ein Vergleich ist zumindest im Fall der Einschluss-raten möglich. Dabei zeigte sich, dass mit einer 100 mM CdCl2-bzw. CuCl2-Lösung hydratisierte Polymersomendispersionen nach der Aufreinigung deutlich verschiedene Einschlussraten aufwiesen. So wurde unabhängig vom pH-Wert für Cu2+-haltige Poly­mersomendispersionen eine mindestens viermal so hohe Einschlussrate wie für Cd2+­haltige Polymersomendispersionen in FAAS-Untersuchungen detektiert. Die Einschluss-rate war in beiden Fällen in Citratpu.er (pH 2) ungefähr um den Faktor zwei geringer als in Acetatpu.er (pH 4-5). Dieser E.ekt könnte zumindest im Fall von Cu2+-haltigen 4.5 Diskussion -Übergangsmetallhaltige Polymersomen Polymersomen mit der Bildung von Cu(OH)2-Hydroxid-Aggregaten erklärt werden. Als Ursache für diesen pH-abhängige Einschlusse.zienz ist auch der Ein.uss des als Pu.er verwendeten Citrats, welches ein deutlich stärkerer (Chelat-)Komplexbildner ist als Ace­tationen oder TRIS. Es wurde bereits berichtet, dass das verwendete Pu.ersystem die Einschlussrate von Metallionen in Liposomen beein.ussen kann [65]. Die Einschlussrate von Cd2+-Ionen lag auch in TRIS-HCl-Pu.er (pH 7) deutlich unter der von Fe2+-Ionen. Für diese wurden bei Verwendung einer 60 mMLösung eine höhere Einschlussrate erzielt als für Cd2+-haltige Polymersomen mit 100 mM CdCl2-Startkonzentration. Eine mögli­che Erklärung ist eine nicht vollständige Hydratisierung des PB-PEO-Polymer.lms auch nach 16 Stunden Rütteln. Dies wurde mehrfach bei der Herstellung Cd2+-haltige Poly­mersomendispersionen beobachtet. Aus aufgereinigten, Cu2+-haltigen Polymersomendispersionen konnte durch die Inkuba­tion mit einer H2S-Lösung intravesikuläres CuS ausgefällt werden. Dieser Prozess konnte mittels UV/Vis-Spektroskopie verfolgt werden. Die kompartimentierte Ausfällung von CuS, das makroskopisch ein schwarzer Feststo. ist, führt dabei zu vergleichbaren Er­gebnissen wie NiS. Auch bei der intravesikulären Bildung von CuS wird eine starke Zunahme der Lichtstreuung bzw. -absorption bei Wellenlängen . = 500 nm beobachtet. Die Zunahme der Lichtstreuung bzw. -absorption erfolgt dabei sehr rasch. Schon nach 30 s wird in drei von vier untersuchten Systemen bereits eine Absorption detektiert, die nahezu identisch ist mit der nach 30 min. Die intravesikuläre Ausfällung von CuS ist folglich ein sehr rascher Prozess. Die Inkubation aufgereinigter, Cd2+-haltiger Polymersomendispersionen mit einer gesät­tigten H2S-Lösung führte zur Ausfällung von gelbem CdS, was auch visuell erkennbar war. Die zeitliche Verfolgung der intravesikulären Bildung von CdS-NP mittels UV/Vis-Spektroskopie konnte sogar zur Abschätzung der Größe gebildeter NP genutzt werden. Dies liegt an den besonderen photohalbleitenden Eigenschaften von CdS und deren Grö­ßenabhängigkeit für CdS-Partikel mit Durchmessern unter 8 nm [104]. So ist für CdS-NP die Energielücke und damit die Absorptionskante größenabhängig [104]. Unter Verwen­dung der CdS-Absorptionskante, die den UV/Vis-Spektren entnommen werden kann, kann die Größe der CdS-NP abgeschätzt werden. Damit ließen sich potenzielle Ein­.ussfaktoren auf die Geschwindigkeit der CdS-Keimbildung und des -wachstums näher veri.zieren. Eskonntegezeigtwerden,dasssichumsogrößereCdS-Partikelbilden,jeniedrigerderin­travesikuläre pH-Wert ist. Vergleichbare Aussagen sind auch schon für liposomale Syste­me, allerdings für einen Bereich von pH 7-10, bekannt [18]. Zudem führte die Inkubation mit zunehmenden Mengen einer H2S-Lösung zur Zunahme der Partikelgröße von intra­vesikulär gebildeten CdS-NP. Die Variation der CdCl2-Startkonzentration beein.usste zwar die Größe der CdS-Partikel, allerdings wurden bei verschiedenen pH-Werten auch verschiedene Ausprägungen dieses Parameters beobachtet. Für liposomale Systeme wur­de im verwendeten Bereich der CdCl2-Startkonzentration kein Ein.uss auf die Größe der ausgefällten CdS-Partikel gefunden [18]. Die Kinetik der intravesikulären Bildung von Metallsul.den kann anhand der zeitli­chen Veränderung der optischen Dichte bei verschiedenen Wellenlängen verfolgt wer­den [19].Dabei werden die ermittelten UV/Vis-Spektren durch Subtraktion des UV/Vis-Spektrums der jeweiligen aufgereinigten Polymersomendispersion um den Betrag der Lichtstreuung durch die Polymersomen korrigiert. Da die intravesikuläre Metallsul.d-Fällungsreaktion jeweils spätestens nach 30 min abgeschlossen war, wurde das nach 30 min aufgenommene UV/Vis-Spektrum als Referenz (100%-Wert) verwendet. Für die zuvor aufgenommenen UV/Vis-Spektren wurde die auf den jeweiligen Wert nach 30 min bezogenerelativeoptischeDichtebeiverschiedenenWellenlängenermittelt.DasErgebnis der UV/Vis-spektroskopischen Verfolgung der Inkubation von vergleichbaren aufgerei­nigten, Cu2+-bzw. Cd2+-haltigen Polymersomendispersionen mit einer H2S-Lösung ist 4.5 Diskussion -Übergangsmetallhaltige Polymersomen in Abb. 64 dargestellt. Es ist erkennbar, dass in beiden Fällen ein sehr starker Anstieg der optische Dichte im Vergleich zum Ausgangswert schon nach 30 s erfolgt. Auch bei der intravesikulären Aus­fällung von CuS und CdS in Phospholipidvesikeln konnte eine anfänglich sehr hohe und dann kontinuierlich abnehmende Reaktionsgeschwindigkeit beobachtet werden [19]. Die Beobachtung einer anfänglich sehr raschen Reaktion ist auch in Übereinstimmung mit der aus der CdS-Absorptionskante desselben UV/Vis-Spektrums nach 30 s Inku­bationszeit ermittelten CdS-Partikelgröße. Die Lage der CdS-Absorptionskante wies auf die Bildung von CdS-Partikeln mit einer Größe von ca. 8 nm hin. Im Zeitraum zwischen 30 s und 30 min ist für die cadmiumhaltigen Polymersomen eine, wenn auch nur geringe lineare Zunahme der optischen Dichte zu erkennen. Dies deutet darauf hin, dass bei der CdS-Fällungsreaktion zunächst eine sehr rasche Bildung von CdS-Partikeln erfolgt, an die sich ein deutlich langsamerer Prozess des CdS-Partikelwachstums anschließt. FürdiekupferhaltigenPolymersomenhingegenistimZeitraumzwischen30sund30min kein einheitlicher Verlauf zu erkennen. Die optische Dichte bei . = 315 nm nimmt konti­nuierlich zu, während bei . = 400 nm und . = 470 nm bereits nach 15 min ein Maximum erreicht wird. Dies deutet darauf hin, dass die CuS-Fällungsreaktion bereits nach 15 min praktisch abgeschlossen ist. In Cryo-TEM-Untersuchungen von CdS-haltigen Polymersomendispersionen konnten CdS-NP mit verschiedenen Größen visualisiert werden, die intravesikulär vorlagen. Auf­grund der deutlich höheren Ordnungszahl von Cadmium im Vergleich zu Eisen weisen CdS-Partikel auf TEM-Aufnahmen einen sehr dunklen Kontrast auf. Somit konnten si­cher zwei verschiedene CdS-Partikelpopulation bei pH 7 unterschieden werden. Zum einen konnten in vielen Polymersomen CdS-NP mit einer Größe unter 3 nm beobachtet werden. Diese Beobachtung unterstützt die Hypothese, dass sich bei höheren pH-Werten viele, sehr kleine CdS-Partikel im Verlauf der H2S-Inkubation bilden (vgl. Kapitel 4.3.4). Zum anderen konnten größere CdS-Partikel mit einer Größe von 6 nm bi 9 nm detek­tiert werden, die teilweise in größere Aggregaten vorliegen. Die Deformation von Poly­mersomenmembranen durch solche internen CdS-Aggregate konnte ebenfalls beobachtet werden. Die Cryo-TEM-Aufnahmen CdS-haltiger Polymersomen liefern wertvolle Hinweise zum Verständnis des Prinzips der Bildung intravesikulärer Metallsul.de, welche die Untersu­chungen NiS-und insbesondere FeS-haltiger Polymersomen nicht liefern konnten. CdS-Partikel lassen sich aufgrund des erheblich niedrigeren Löslichkeitsprodukts und des intensiveren Kontrasts auf TEM-Aufnahmen erheblich besser detektieren. Sollten sich bei pH 7,4 ebenfalls intravesikuläre FeS-Partikel mit einer Größe von maximal 3 nm bilden, so wären diese aufgrund des deutlich geringeren Kontrasts im Gegensatz zu CdS nicht mit Sicherheit detektierbar. Zudem könnten sich solch kleine FeS-Partikel, anders als unter diesen Bedingungen stabile CdS-Partikel derselben Größe, im Verlauf der Präparation für Cryo-TEM-Untersuchungen infolge von Oxidation oder abnehmen­der H2S-Systemkonzentration leicht au.ösen. Intravesikuläres FeS konnte vermutlich aus diesen Gründen nur in deutlich größeren Polymersomen im Mikrometerbereich mittels REM-EDXsichervisualisiertundnachgewiesenwerdenkonnte.SomitergänzendieCryo­TEM-Untersuchungen von CdS-haltigen Polymersomen sehr gut die mit derselben Me­thode erhaltenen, nur unzulänglichen Ergebnisse für FeS-haltige Polymersomen, indem der prinzipiell identische Vorgang der intravesikulären Ausfällung eines Metallsul.ds in zuvor aufgereinigten Polymersomendispersionen sehr anschaulich beobachtet werden kann. 5 Untersuchungen zu Eisensul.den 5.1 Motivation InspiriertdurchdiezentraleRolle,dieEisensul.deinderEisen-Schwefel-Welt-Hypothese zur Entstehung eines ersten Pionier-Organismus gespielt haben könnten [44], sollten die­se näher charakterisiert sowie deren Reaktivität an einer Modellverbindung untersucht werden. Das Redoxpaar FeS/H2S wird als Energiequelle und FeS bzw. das gebildete FeS2 gleichzeitig als katalytisch wirksame Ober.ächen zur Reduktion von CO2 und den Aufbau organischer Verbindungen angesehen [45]. Die reduzierende Kraft des Systems FeS/H2S konnte bereits in mehreren Studien nachgewiesen werden [47–52]. Die exem­plarischen Untersuchungen zum Verständnis der Reduktionskraft des FeS/H2S-Systems solltenhieranhandvonUntersuchungenanDMSOergänztwerden.Essolltegeklärtwer­den, ob sich das FeS/H2S-System als Modell für eine Art primitive DMSO-Reduktase eignet. Diese vielfältige Enzymklasse, deren aktives Zentrum eine Wolfram-oder ein Molybdän-Schwefel-Spezies ist, .ndet sich u.a. in marinem Phytoplankton und ist in der Lage, DMSO zu Dimethylsul.d (DMS) zu reduzieren [107]. Marines DMS besitzt als Quelle von Kondensationskeimen für die Wolkenbildung Relevanz für das globale Kli­ma [54,108]. Zunächst war es erforderlich, amorph gefälltes FeS, das bei den Untersuchungen verwen­det wurde, hinsichtlich seiner Bescha.enheit und Reaktivität zu charakterisieren. Zudem sollte als Vergleich FeS2 auf einem alternativen Weg hergestellt und näher charakteri­siert werden. Zur Charakterisierung von mineralischen und synthetischen Eisensul.den mittels BET-Bestimmung (BET -Brunauer-Emmett-Teller) der spezi.schen Ober.ä­che [109], Elektronenmikroskopie [110] und spektroskopischen Methoden [111,112] exis­tieren bereits Vorarbeiten, die sich zu Referenzzwecken eignen. Zusätzlich zu diesen Voruntersuchungen erfolgten Tests zur Bildung von H2 nach der „Berzelius-Reaktion“ (Reaktion 5) in Abwesenheit eines Elektronenakzeptors. Diese Ex­perimente dienten zur Optimierung der Reaktionsführung bei Verwendung des FeS/H2S­Systems und damit als Vorbereitung für die Untersuchungen zur Reduktion von DMSO. Zudem sollte veri.ziert werden, ob tatsächlich ein Einschluss von H2 in dem bei der Reaktion gebildeten Pyrit erfolgt, wie bereits zuvor postuliert [113]. FeS + H2S(aq) . FeS2 +H2(g) (5) 5.2 Herstellung und Charakterisierung von amorphem FeS Natürliche FeS-Minerale, die kommerziell erhältlich sind, eignen sich u.a. für die reduk­tive Dehalogenierung chlororganischer Verbindungen [114]. In meinen Untersuchungen wurde indes frisch gefälltes FeS für die Untersuchungen bevorzugt, da es amorph ist und aufgrund seiner Struktur eine erhöhte Reaktivität im Vergleich zu kommerziell erwerbli­chem (gealtertem) FeS aufweist [50,87]. FeS kann durch Fällung aus einer Fe2+-haltigen Lösung mit einer Na2S-Lösung unter inerten Bedingungen erhalten werden. Zur Aufrei­nigung wird das ausgefällte FeS mehrmals mit H2O gewaschen und dann ggf. über Nacht unter inerten Bedingungen lyophilisiert. Dabei wird ein schwarzes Pulver erhalten. Die Analyse einer derart präparierten Probe mit Röntgenpulverdi.raktometrie (PXRD) zeigte, dass die Probe kaum kristalline Anteile aufwies. Zur Absicherung, dass es sich bei der amorphen Substanz tatsächlich um FeS handelt, wurde eine frisch gefällte Probe zwei Wochen bei 65.C gelagert, um Kristallisationsprozesse zu induzieren. Nach einer identischen Aufreinigungsprozedurwurdeebenfalls einePXRDdeserhaltenenschwarzen Pulvers durchgeführt. Diese ergab, dass in der bei 65.C gelagerten Probe hauptsächlich Mackinawit Fe1+xS vorliegt. Dies deckt sich mit vorherigen Berichten zur Charakterisie­rungvonfrisch gefälltemFeS,indenenebenfallsMackinawitalsdominanteKristallphase identi.ziert wurde [109,110]. Ein wichtiger, die Reaktivität mitbestimmender Parameter ist die spezi.sche Ober.äche einer Substanz. Für das amorph gefällte, aufgereinigte und lyophilisierte FeS wurde in BET-Untersuchungen eine spezi.sche Ober.äche von 35,4 mg 2 ermittelt. TEM-Untersuchungen zeigten, dass es sich bei dem ausgefällten FeS um größere Aggre­gate von Partikeln mit einer Größe von ca. 30 -50 nm handelt. Während der TEM-Untersuchung begannen sich die FeS-Partikel bei höheren Elektronenenergien (Vergrö­ßerung über 30000-fach) umzustrukturieren, so dass lediglich ein Überblick über die Probenbescha.enheit gewonnen werden konnte. Die ermittelten Werte der Partikelgröße und spezi.schen Ober.äche sind in guter Über­einstimmung mit Literaturangaben, in denen für amorph gefälltes FeS eine spezi.sche Ober.äche von 36,5 mg 2 sowie eine mittlere FeS-Partikelgröße von 10 -35 nm angegeben werden [109]. 5.3 Herstellung und Charakterisierung von Pyrit FeS2 5.3 Herstellung und Charakterisierung von Pyrit FeS2 Das Mineral Pyrit (FeS2) ist schon seit über 2000 Jahren bekannt und wurde u.a. be­reits von Archimedes erwähnt [115]. Der Name kommt vom griechischen Wort für Feuer p.., da Pyrit Funken sprüht, wenn auf das Mineral geschlagen wird [115]. Es ist die am häu.gsten an der Erdober.äche vorkommende Eisensul.d-Phase und thermodynamisch stabil [84]. Obwohl in der Natur reichlich vorkommend, ist die gezielte Herstellung von Pyrit im wässrigen unter genau kontrollierbaren Bedingungen nicht einfach zu bewerkstelligen. Darum existieren eine Vielzahl verschiedener Berichte zur Herstellung von Pyrit, das indes meist in Mischungen mit anderen Eisensul.d-Phasen erhalten wird (zusammenge­fasst in [84]). Aus der Vielzahl der Herstellungsmethoden wurden zwei verschiedene Ansätze auf ihre Eignung zur Herstellung von möglichst reinen Pyritpartikeln getestet. Zum einen wurde die von Wei et al. beschriebene Herstellung von Pyrit-Mikropartikeln durch die Reak­tion von FeCl3 mit NaHS im wässrigen bei pH < 4 getestet [116]. Zum anderen wurde die in [117] beschriebene Umsetzung von frisch gefälltem FeS mit elementarem Schwefel (S8) im wässrigen Milieu bei pH = 6 und bei einer Temperatur von 65.C unter inerten Bedingungen getestet. DasbeidererstenMethodeentstandeneschwarzeReaktionproduktwurdemittelsPXRD charakterisiert. Es zeigte sich, dass Pyrit nur als Nebenprodukt gebildet wurde, wäh­rend andere Eisensul.dphasen wie Mackinawit, Smythit (Fe9S11) und Greigit (Fe3S4) als Hauptprodukte überwogen. Im Gegensatz dazu führte der zweite untersuchte Reaktionsweg tatsächlich zur Bil­dung von Pyrit. Dafür wurde das nach fünf Tagen Reaktionszeit erhaltene grauschwar­ze Reaktionsprodukt noch mit 5 M HCl zur Au.ösung von magnetischen Mackinawit-Rückständen (vgl. [50]) und dann mit Cyclohexan zum Herauslösen von verbliebenem Schwefel behandelt. Eine Analyse des gereinigten Produkts mittels PXRD-Analyse zeig­te, dass es hauptsächlich aus Pyrit besteht (s. Abb. 65). In dem gemessenen Di.rak­togramm lassen sich die neun intensivsten Re.exe den bekannten Re.exen von Pyrit zuordnen. Weitere Re.exe anderer Eisensul.dphasen können nur Greigit (Fe3S4) zu­geordnet werden. Diese geringe Verunreinigung ist nicht überraschend, da der in [117] postulierte Reaktionsweg Greigit als eine Zwischenstufe bei der Pyritbildung einschließt. In [84] wird allerdings darauf hingewiesen, dass Greigit keine notwendige Zwischenstu­fe bei der Pyritbildung darstellt, sondern lediglich in einer konkurrierenden Reaktion gebildet wird. Für zukünftige Ober.ächenstudien wurde die spezi.sche Ober.äche des hergestellten Pyrits mittels BET-Methode zu 42,5 mg 2 ermittelt. Dieser Wert liegt ca. 20 % über dem Wert von amorphem FeS. 5.4 Untersuchungen zur Reaktion von FeS und H2S 5.4 Untersuchungen zur Reaktion von FeS und H2S 5.4.1 Vorbemerkungen Die unter dem Namen Berzelius-Reaktion bekannte Reaktion von FeS und H2S (s. Reak­tion 5) wurde bereits intensiv untersucht [84]. So wurde die Reaktion bei Temperaturen von bis zu 160.C [118] sowie bei 100.C [50] im wässrigen Milieu beschrieben. Rickard et al. führten Untersuchungen zur Aufklärung des Mechanismus der Reaktion durch [113]. Dort wird postuliert, dass H2S als Elektronenakzeptor und FeS als Elektronendonor in der Reaktion fungieren. Bei Untersuchungen der Reaktion bei Temperaturen unter 125.C konnte indes nur ein Teil des H2, das in stöchiometrischen Mengen gebildet wird, detektiert werden [50,113]. Es wird angenommen, dass der bei der Reaktion gebildete Wassersto. mit den sich herausbildenden Pyrit-Ober.ächen wechselwirkt und dadurch teilweise in wachsenden Pyritpartikeln eingeschlossen wird [113,119]. Eine intensive Studie zur Kinetik der Berzelius-Reaktion ergab, dass die Reaktion relativ rasch abläuft und schon nach einem Tag bis zu 50 % Umsatz zu verzeichnen sind [109]. Da die Geschwindigkeit der Reaktion direkt von der Konzentration gelösten H2S ab­hängt, ergibt sich auch eine pH-Abhängigkeit der Reaktion. ImHinblickaufdiegeplantenUntersuchungenzurReduktionvonDMSOdientendiehier durchgeführten Untersuchungen dazu, eine Methode zur inerten Reaktionsführung sowie eine geeignete Nachweismethode für den bei der Reaktion von FeS mit H2S gebildeten H2 mittels GC zu etablieren. 5.4.2 Durchführung und Analyse der Reaktionsprodukte DiepraktischeDurchführungder Berzelius-ReaktionorientiertesichandenAngabenvon Rickard [109]. Eine wässrige FeS-Suspension wurde unter inerten Bedingungen in einer H2S-Argon-Atmosphäre bei pH 6 für fünf Tage auf 90.C erhitzt. In einzelnen Reaktionen konnte dabei die Bildung einer silbrig glänzenden Schicht auf der Lösungsober.äche oder an der Glaswand des Reaktionskolbens beobachtet werden. Dieser optische E.ekt könnte durch sehr dünne Schichten von FeS oder FeS2 verursacht werden und wurde bereits beschrieben [47]. EineProbeausderGasphasedesReaktionsgefäßeswurdenachBeendigungderReaktion mittelsGCuntersucht.Dabeizeigtesich,dassderGasraumdesReaktionskolbensgeringe MengenanH2 aufwies.InKontrollexperimentenunterdenselbenBedingungen,beidenen entweder kein FeS oder kein H2S verwendet wurden, konnte nach fünf Tagen Lagerung Tab. 3: Ergebnis der Reaktion von FeS und H2S sowie von Kontrollexperimenten; Bestimmung von H2 mittels GC und von FeS2 mittels Röntgenpulverdi.raktometrie Ausgangssto.e Reaktionsprodukte FeS H2S H2 FeS2 + + + + + - - + - + - - bei 90.C kein H2 in GC-Untersuchungen gefunden werden (s. Tab. 3). Dies belegt, dass H2 nur bei der Anwesenheit von beiden Reaktionspartnern, H2S und FeS, gebildet wird. Der feste Rückstand nach Beendigung der Reaktion wurde abgetrennt und getrocknet. Eine Analyse mittels PXRD ergab, dass dieser als Hauptbestandteil Pyrit enthält. Im Kontrollexperiment ohne Einsatz von H2S wurde indes ebenfalls Pyrit und nicht FeS als Hauptprodukt mittels PXRD identi.ziert. Eine mögliche Erklärung dafür könnte sein, dass bei der Präparation der Reaktionssuspension ein Oxidationsmittel wie z.B. Luftsauersto. in das Reaktionsgefäß eingedrungen ist. 5.4.3 Untersuchungen zum H2-Einschluss in Pyrit in der Berzelius-Reaktion Motivation für die Untersuchungen war die kontrovers diskutierte Hypothese, ob sich bei der Berzelius-Reaktion entstehender H2 in den wachsenden Pyritpartikeln einla­gert [113,119]. Die Ursache dafür könnte eine im Moment der Produktbildung von FeS2 und H2 auftretende Wechselwirkung zwischen dem HOMO des FeS2, dessen Elektronen­dichtevorwiegendaufdemS22--Ionlokalisiertist,unddemLUMO(su*)desentstehenden H2 sein [113]. Diese Wechselwirkung könnte die Adsorption von H2 auf einer Pyritober­.äche ermöglichen [113]. Konkreter Anlass zu dieser Hypothese war die Beobachtung, dass bei der Analyse der Reaktionsprodukte keine stöchiometrischen Mengen an H2 im Vergleich zum entstande­nen Pyrit gefunden werden konnten [50,109]. Erst durch die CrCl2-Reduktion des Pyrit nach Can.eld et al. [120], die den Schwefel zu H2S reduziert, zur Au.ösung des Pyrit und zur Freisetzung von eingeschlossenem H2 führt, konnte Rickard die erwartete, stö­chiometrische Menge an H2 nachweisen [109]. Rickard verweist dabei auf unpublizierte Daten. Allerdings fehlt in der Literatur eine spätere, genaue Darstellung seiner Ergeb­nisse. 5.4 Untersuchungen zur Reaktion von FeS und H2S Aufgrund dieses nicht abschließend geklärten Standes der Forschung wurde eine Pro­be des bei der Berzelius-Reaktion erhaltenen festen Reaktionsprodukts sowie mehrere Kontrollproben analog der Beschreibung in [109] unter inerten Bedingungen und Küh­lung mit einer salzsauren, 0,5 M CrCl2-Lösung in einem abgeschlossenen Probengefäß behandelt. Nach mehr als drei Stunden wurde mit einer gasdichten Spritze aus dem Gasraum über der jeweils mit CrCl2 behandelten Substanz eine Probe genommen und 100 µl davon mittels GC auf H2 untersucht. Die dabei ermittelte H2-Menge lässt nur qualitative Aussagen über die Menge freigesetzten H2 zu, da die Probenmassen nicht exakt bestimmbar waren. Es zeigte sich, dass beim Au.ösen von Pyrit erhebliche Mengen an H2 entstehen. Die Fläche des H2-Signals im Gaschromatogramm ist dabei stets deutlich größer als die des als Schutzatmosphäre verwendeten Argons. Ähnliche Mengen an H2 konnten in al­len untersuchten Pyritproben detektiert werden, unabhängig davon, ob diese durch die Berzelius-Reaktion oder durch die Reaktion von FeS und S8 (s.o.) hergestellt wurden. Amorphes FeS setzt bei der Behandlung mit CrCl2-Lösung nur Spuren an H2 frei, wäh­rend im Gasraum über der verwendeten CrCl2-Lösung nach mehreren Stunden inerter Lagerung kein H2 mittels GC gefunden wurde. 5.4.4 Diskussion Die Untersuchungen zeigten, dass die Berzelius-Reaktion unter den gewählten Reakti­onsbedingungen abläuft. Dies konnte anhand des qualitativen Nachweises von H2 mittels GC sowie FeS2 mittels PXRD belegt werden. Ein silbriges Reaktionsprodukt, das dann als Pyrit identi.ziert wurde, ist schon in früheren Untersuchungen zur Reduktionskraft des FeS/H2S-Systems beschrieben worden [47]. Unklar ist, warum sich im Kontrollexperiment ohne H2S ebenfalls Pyrit gebildet hat­te, der zudem laut PXRD-Untersuchung einen größeren kristallinen Anteil als der in der Berzelius-Reaktion entstandene aufwies. Da bei diesem Kontrollexperiment aber kein H2 gebildet wurde, muss der Pyrit auf einem alternativen Reaktionsweg entstanden sein. Möglich ist, dass durch einen unbeabsichtigten Eintrag von Luftsauersto. in das Reak­tionsgefäß Fe2+-zu Fe3+-Ionen oxidiert wurden. Da Fe3+-Ionen mit Sul.dionen unter Schwefelbildung reagieren [84], könnte es zu der im Kapitel 5.3 beschriebenen Reaktion von FeS mit elementarem Schwefel gekommen sein, die zur Bildung von Pyrit führt. Die Analyse des festen Reaktionsproduktes sowie mehrerer Kontrollen zeigte, dass beim reduktiven Au.ösen aller Pyritproben mit CrCl2 Wassersto. freigesetzt wird. D.h., auch Pyrit, in dem gar kein H2 eingeschlossen sein sollte, generiert H2 bei der Reaktion mit CrCl2. Die Ursache dafür könnte in einer Eisen-katalysierten Reduktion von Protonen durch Cr2+-Ionen sein, die zur H2-Entwicklung führt. Dafür spricht weiterhin, dass in einer entgasten CrCl2-Lösung kein H2 entwickelt wird. Bei der Beschreibung der CrCl2 ­Methode wird über keine mit dem Au.ösen von Pyrit verbundene H2-Bildung, sondern nur von der quantitativen Freisetzung von H2S aus Pyrit berichtet [120]. Folglich ist die Methode nicht geeignet, um die Hypothese von in Pyrit eingeschlossenem H2 experimentell zu untersuchen. Dieser Befund könnte die Ursache dafür sein, dass der von Rickard nur verbal geführte Nachweis des Einschlusses von H2 in Pyrit mit dieser Methode in [109] bis heute nicht mit genauen Ergebnissen publiziert ist. Die zur Durchführung der Berzelius-Reaktion entwickelte Reaktionsführung und der GC-Nachweis von H2 stellen erfolgreiche Vorarbeiten dar. Darauf aufbauend konnten die Untersuchungen zur Reduktion von DMSO durch das FeS/H2S-System durchgeführt werden.ZudemsinddieVorarbeiten wertvoll für die geplanteDurchführung undAnalyse der Berzelius-Reaktion in einem Kompartiment, z.B. in einem Vesikel. 5.5 Untersuchungen zur Reduktion von DMSO durch das FeS/H2S-System 5.5 Untersuchungen zur Reduktion von DMSO durch das FeS/H2S-System 5.5.1 Vorbemerkungen Vor dem Hintergrund der postulierten zentralen Rolle des FeS/H2S-System als poten­zielle präbiotische Energiequelle im Eisen-Schwefel-Welt-Szenario wurde die Redukti­on DMSO zu DMS untersucht. Das FeS/H2S-System mit einem Standardpotenzial von E. = -620 mV [45] sollte prinzipiell in der Lage sein, das milde Oxidationsmittel DMSO mit einem Standardpotenzial von E.(DMS/DMSO) = +160 mV [121] zu reduzieren. Konkret sollte untersucht werden, ob und unter welchen Bedingungen eine Reaktion nach Reaktion 6 abläuft: FeS + H2S+H3CS(O)CH3 . S(CH3)2 + FeS2 +H2O (6) Die Reduktionskraft des FeS/H2S-Systems an der Modellverbindung DMSO wurde vor dem Hintergrund von Vorarbeiten von der Gruppe um Kläui zur Reduktion von aroma­tischen und benzylischen Sulfoxiden durch FeS/H2S getestet. DMSO wurde im Hinblick auf seine größere primordiale Relevanz im Vergleich zu aromatischen Sulfoxiden einge­setzt. Im aktiven Zentrum moderner DMSO-Reduktasen be.ndet sich ein Mo-bzw. W-Atom, das durch Schwefelliganden komplexiert und stabilisiert wird [119,122]. Mo und W eig­nen sich als aktive Zentren besonders gut, da sie hohe Oxidationsstufen bis +6 aufweisen können und somit die Funktionalität von DMSO-Reduktasen als eine Art Oxotransfera­se, d.h. als formaler Überträger eines O-Atoms, gewährleisten können [123]. Durch die Wirkung der DMSO-Reduktase gebildetes DMS hat beim Entweichen in die Atmosphäre klimatische Bedeutung als Quelle von Wolkenkondensationskeimen [54,108]. 5.5.2 Durchführung und Beobachtungen Es sollte gezeigt werden, ob und in welchem Umfang DMSO durch FeS/H2S zu Di­methylsul.d (DMS) reduziert werden kann. Dazu wurden äquimolare Mengen (jeweils 2 mmol) der Reaktanden FeS/H2S und DMSO verwendet. Die Experimente wurden in verschlossenen Schlenkgefäßen unter inerten Bedingungen bei 95.C über einen Zeitraum von bis zu 14 Tagen durchgeführt. FeS wurde dafür frisch gefällt (durch Zugabe einer Na2S-Lösung zu einer intensiv gerührten FeCl2-Lösung) und anschließend entgastes DMSO zugegeben. Der experimentell schwierigste Schritt, die Dosierung von H2S im Reaktionsgefäß, erfolgte mittels Injektionsspritzen. Dabei wurde H2S über ein Septum in den Schlenkkolben, in dem zuvor der Druck reduziert wurde, injiziert. Im Verlauf der Reaktion bildeten sich bei einigen Experimenten schon nach einem Tag graue Partikel auf der Ober.äche der Suspension und nach mehreren Tagen silbrig glän­zende Partikel. Im Falle des Kontrollexperiments mit H2S und DMSO in Abwesenheit von FeS wurde die Bildung eines hellgelben Feststo.s an der Lösungs-Ober.äche schon nach einem Tag beobachtet. Das Kontrollexperiment ohne Injektion von H2S zeigte im Reaktionsverlauf keine nennenswerten Veränderungen. Die Suspension veränderte ihr Aussehen im Verlauf von zwei Wochen bei 90.C nicht. Bei allen durchgeführten Reak­tionen wurde der charakteristische Geruch von DMS beim Ö.nen des Reaktionsgefäßes nach Beendigung der Reaktion wahrgenommen. 5.5.3 Quantitative Bestimmung des DMS-Gehaltes mittels GC Methodenentwicklung Ausgehend von dem olfaktorischen Befund der Bildung von DMS musste eine geeignete Methode zur Analyse des Reaktionsgemisches und zur Bestimmung der Ausbeute an gebildetem DMS entwickelt werden. Hierbei mussten der niedrige Siedepunkt von DMS (37.C) und der hohe Dampfdruck von 53 kPa schon bei 20.C berücksichtigt werden. Die Löslichkeit von DMS in H2O liegt bei 20 gl [124]. Die maximale Löslichkeit in H2O liegt somit deutlich unter der Konzentration von DMS in der Reaktionslösung, die bei vollständigem Umsatz zu erwarten ist. Allerdings musste auch der hohe Dampfdruck des DMS, der zu einer Verteilung des DMS sowohl in der Flüssigkeits-als auch in der Gasphase führt, mit berücksichtigt werden. Es bot sich die Entwicklung einer Methode zur Extraktion des DMS aus dem Reaktionsgemisch bei tiefen Temperaturen und dessen Quanti.zierung mittels Gaschromatographie (GC) an. Hierzu wurden zunächst verschiedene organische Lösungsmittel auf ihre Eignung zur Extraktion hin untersucht. Toluen erwies sich dabei als geeignet, da es sowohl eine e.ektive Extraktion von DMS ermöglicht als auch aufgrund seiner deutlich längeren Retentionszeit bei der GC nicht die Bestimmung von DMS beeinträchtigt. Als interner Standard für die GC-Untersuchungen kam n-Hexan zum Einsatz. Die Extraktion von DMS aus einer Probe der Reaktionslösung erfolgt in einem GC-Probengefäß (s. Abb. 66a). Dabei wurden 500 µl der Toluenlösung mit 15 mg n-Hexan ml 5.5 Untersuchungen zur Reduktion von DMSO durch das FeS/H2S-System als internem Standard vorgelegt und dann 3,6 ml des klaren Überstands der Reaktions­suspension dazugegeben. Nach dem Verschließen erfolgte bei 0.C ein intensives Durch­mischen der beiden Phasen, um einen möglichst vollständigen Transfer des DMS in die Toluenphase zu gewährleisten. Der Vorteil des GC-Probengefäßes besteht darin, dass es relativ dicht zu verschließen ist und nur einen kleinen Gasraum über der Toluenphase aufweist. Nach der Extraktion des DMS in die organische Phase wurden ca. 2,5 µl der organischen Phase entnommen und mittels GC (mit Flammenionisationsdetektor -FID) untersucht. Ein Beispiel für ein Gaschromatogramm einer solchen Messung ist in Abb. 66b darge­stellt. Es ist zu erkennen, dass DMS, n-Hexan und Toluen mit Retentionszeiten von 2,13 Minuten (DMS), 2,36 Minuten (n-Hexan) und ca. 3,6 Minuten (Toluen) deutlich voneinander getrennt detektiert werden können. Die weiteren, sehr kleinen detektier­ten Signale stammen von den drei Isomeren des Hexan. Die Zuordnung der jeweiligen GC-Signale zu den Verbindungen DMS, n-Hexan und Toluen wurde mittels GC-MS abgesichert. Die GC-Methode ist demnach für die Bestimmung von DMS geeignet. Kalibration zur quantitativen Bestimmung von DMS mittels GC Um eine quantitative Bestimmung des DMS-Gehalts in der Reaktionslösung zu ermög­lichen, wurde zunächst eine Kalibration unter möglichst authentischen Bedingungen durchgeführt, wie sie auch Anwendung für die Analyse der Reaktionslösungen fanden. Dies sollte dazu dienen, den Fehler durch das bei der Extraktion nicht erfasste DMS in der Gasphase der Reaktionsgefäße zu minimieren. Folglich wurden die gleichen Schlenk­gefäße wie bei den Experimenten und ein identisches Volumen an NaCl-Lösung bei der DMS-Kalibration verwendet. DMS wurde in den Schlenkgefäßen eingewogen und equi­libriert, bevor die Probennahme analog zu den Reaktionsgefäßen erfolgte. Als interner Standard wurden 15 mg n-Hexan in Toluen verwendet, um möglichst ver­ ml gleichbare Flächengrößen der Signale von DMS und Hexan im Gaschromatogramm zu gewährleisten. Durch den internen Standard war es möglich, einem Verhältnis der Flä­chen von DMS und Hexan im Gaschromatogramm jeweils eine entsprechende Menge an DMS in der Probe zuzuordnen. Für eine Kalibration wurden die Quotienten aus dem Flächenverhältnis von DMS und Hexan für neun verschiedene, de.nierte DMS-Mengen im Bereich von 6,2 mg (0,1 mmol) bis 235,4 mg (3,8 mmol) in einem Schlenkgefäß bestimmt. Die aufgenommene Kalibra­tion eignet sich für die Bestimmung des DMS-Gehalts in Proben von Reaktionssuspen­sionen. Allerdings weisen aufgrund der Streuung von Kalibrationspunkten bei höherem DMS-Gehalt die ermittelten DMS-Ausbeuten der Reduktionsreaktion von DMSO einen erhebliche Fehlerbereich auf (vgl. Abb. 67). Quanti.zierung des bei der Reduktion von DMSO gebildeten DMS Die Reduktion von DMSO zu DMS mit dem FeS/H2S-System wurde bei 95.C für unter­schiedliche Reaktionszeiten untersucht. In Kontrollexperimenten mit einer Reaktionszeit von 14 Tagen wurde zudem untersucht, ob FeS ohne H2S oder ob H2S ohne FeS eben­falls in der Lage sind, DMSO zu DMS zu reduzieren. Des weiteren wurde untersucht, ob DMSO in wässriger NaCl-Lösung unter identischen Reaktionsbedingungen, allerdings in Abwesenheit von FeS und H2S, DMS generiert. Es zeigte sich, dass beim Erhitzen von DMSO unter den gleichen Bedingungen keiner­lei DMS gebildet wurde. Bei allen anderen Experimenten konnte die Bildung von DMS festgestellt werden. Die auf das eingesetzte DMSO bezogenen Ausbeuten an DMS in einzelnen Experimenten für verschiedene Reaktionszeiten für das FeS/H2S-System sowie 5.5 Untersuchungen zur Reduktion von DMSO durch das FeS/H2S-System für H2S (in Abwesenheit von FeS) sind in Abb. 67 dargestellt. Es ist erkennbar, dass bei der DMSO-Reduktion durch das FeS/H2S-System schon nach sechs bis sieben Tagen vergleichbare DMS-Ausbeuten wie nach 14 Tagen Reaktionszeit realisierbar sind. Die erzielten DMS-Ausbeuten liegen bei mehr als der Hälfte der Ex­perimente in einem Bereich von etwa 40 -50 %. In zwei Experimenten wurden sogar DMS-Ausbeuten von über 60 % realisiert. Überraschend hoch sind auch die DMS-Ausbeuten bei der DMSO-Reduktion durch H2S. Hierbei wurden nach 14 Tagen Reaktionszeit Werte von ca. 30 -40 % ermittelt. Dies belegt, dass auch H2S ein e.ektives Reduktionsmittel für DMSO ist. Die Ausbeute bei der Reduktion durch FeS (in Abwesenheit von H2S) lag unterhalb der Bestimmungsgrenze und kann darum nur abgeschätzt werden. Es wurde eine DMS-Ausbeute von ca. 10 % bezogen auf das eingesetzte DMSO ermittelt. Dies könnte auf den 10 %-igen Überschuss an Natriumsul.d-Lösung zur Gewährleistung einer vollstän­digen Fällung von Fe2+-Ionen als FeS zurückzuführen sein. In der Reaktionssuspension verbliebene HS--Ionen sollten genauso reaktiv sein wie im Wässrigen bei pH 7 protoly­siertes H2S im Kontrollexperiment. Die Reduktion von DMSO durch das FeS/H2S-System führt zu etwas höheren Ausbeu­ten als mit H2S in Abwesenheit von FeS. Der Vergleich der Ausbeuten lässt o.en, ob im Fall des FeS/H2S-Systems lediglich H2S und FeS unabhängig voneinander DMSO zu DMS reduzieren, oder ob DMS durch eine „pyrite-pulled reaction“, d.h., durch das FeS/H2S-System unter Pyritbildung entstanden ist. Dies kann nur durch eine Analyse des erhaltenen, festen Reaktionsproduktes mittels z.B. PXRD oder MS geklärt werden. 5.5.4 Analyse der festen Reaktionsprodukte Die erhaltenen grau-schwarzen Reaktionsrückstände wurden nach der Beendigung der Reaktionen und der Probennahme für die DMS-Bestimmung unter inerten Bedingungen zentrifugiert,mitH2Ogewaschenund in vacuo getrocknet.DerimKontrollexperimentin Abwesenheitvon FeS erhaltene gelbe Feststo. wurde abgetrennt und an Luft getrocknet. PXRD-Analyse Diegereinigten,getrocknetenNiederschläge,diebeidenDMSO-Reduktionsexperimenten in Anwesenheit von FeS/H2S bzw. FeS entstanden, wurden mittels PXRD charakteri­siert. Es konnte gezeigt werden, dass FeS2 als Pyrit bzw. Markasit das Hauptprodukt der DMSO-Reduktion durch FeS/H2S ist (s. Abb. 68, unteres Di.raktogramm). Die vier intensivsten Re.exe im Di.raktogramm können Pyrit und Markasit zugeordnet werden. Dies belegt, dass das FeS/H2S-System konzertiert die Reduktion von DMSO bewirkt. Mackinawit (Fe1+xS), das auf nicht reagiertes FeS zurückgeführt werden kann, liegt als Nebenprodukt vor. Es fanden sich nur sehr intensitätsschwache Re.exe, die auf elemen­taren Schwefel S8 hinweisen, so dass dieser vermutlich nur als Nebenprodukt in geringen Mengen bei der Reaktion entstanden ist. Im Kontrollexperiment mit FeS ohne H2S, bei dem ebenfalls die Bildung geringer Men­gen DMS nachgewiesen wurde, ergab die PXRD-Analyse, dass sich kein Pyrit gebildet hat (s. Abb. 68, oberes Di.raktogramm). Vielmehr ist Mackinawit (Fe1+xS) das Haupt­produkt, da diesem die drei intensivsten Re.exe im Di.raktogramm zugeordnet werden konnten.MackinawitwurdeauchschoninvorangegangenenExperimentenalsAlterungs­produkt von amorph gefälltem FeS identi.ziert (s. Kapitel 5.2). Der Vergleich der Di.raktogramme beider Proben (s. Abb. 68) zeigt einen deutlichen Unterschied. Die Bildung von Pyrit beim Einsatz von FeS/H2S belegt, dass DMSO kon­zertiert reduziert wurde. Die mögliche Konkurrenzreaktion, die Reduktion von DMSO durch H2S, spielt in Gegenwart von FeS nur eine untergeordnete Rolle. Gleichwohl kann mittels PXRD-Analyse keine Aussage zum Anteil potenziell entstandenem, elementarem Schwefel im festen Reaktionsrückstand gemacht werden. 5.5 Untersuchungen zur Reduktion von DMSO durch das FeS/H2S-System (oben) sowie mit FeS/H2S (unten); Zuordnung der Re.exe der Hauptprodukte bei der Reaktion mit FeS (Mackinawit) bzw. mit FeS/H2S (Pyrit und Markasit) Massenspektrometrie Die entstandenen festen Reaktionsprodukte der Reaktion von FeS/H2S mit DMSO sowie die festen Reaktionsrückstände der Kontrollexperimente mit FeS bzw. mit H2S wurden mittels Massenspektrometrie (MS) untersucht. Dazu wurde jeweils eine Probe der gewa­schenen und getrockneten Reaktionsrückstände in einen MS-Tiegel gegeben und dieser mit einem de.nierten Temperaturprogramm mittels MS untersucht. Der beim Kontrollexperiment mit H2S entstandene, hellgelbe Feststo. konnte eindeutig als Schwefel (S8) identi.ziert werden. H2S reduziert DMSO folglich auch in Abwesenheit von FeS und dies mit einer erstaunlich hohen Ausbeute von 30 -40% (vgl. Abb. 67). Dabei oxidiert DMSO o.ensichtlich H2S zu elementarem Schwefel (s. reaktion 7). H2S+H3CS(O)CH3 . 18 S8 + S(CH3)2 +H2O (7) Die ermittelte DMS-Ausbeute entspricht auch in etwa der erzielten Ausbeute an ent­standenem elementarem Schwefel in der Reaktion. Allerdings wurde auch bei der Untersuchung des schwarzen Reaktionsprodukts der Re­aktion von FeS/H2S mit DMSO mittels MS elementarer Schwefel anhand des typi­schen Fragmentierungsmusters identi.ziert. Die aufgenommenen Massenspektren zei­gen, dass elementarer Schwefel beim Aufheizen nur bei Temperaturen bis 200.C aus dem schwarzen Reaktionsprodukt freigesetzt wird. Hingegen konnte kein DMS bei die­ser MS-Untersuchung detektiert werden. Diese Ergebnissedeutendaraufhin, dassbeiderReaktionvon DMSOmitdem FeS/H2S­SystemzweikonkurrierendeReaktionenablaufen:diedirekteReduktiondurchH2Sunter Bildung von elementarem Schwefel sowie die konzertierte Reduktion durch FeS/H2S un­ter Bildung von Pyrit FeS2. Ein quantitativer Vergleich der Ausbeuten an S8 und FeS2 als jeweilige Oxidationsprodukte beider Reaktionswege mittels MS ist nicht möglich. Zu­dem ist zu berücksichtigen, dass Pyrit beim Erhitzen unter Vakuumbedingungen in FeS und elementaren Schwefel zerfällt [83]. Da in der Literatur Angaben über eine untere Temperaturgrenze des Zerfalls vonPyrit fehlen, kann nicht mit Sicherheit ausgeschlossen werden, dass der mittels MS detektierte Schwefel in der Pyritprobe aus eben demselben stammt. Bei der Reaktion von FeS mit DMSO wird o.ensichtlich kein Schwefel gebildet, wie MS-Untersuchungen des schwarzen Reaktionsrückstands zeigten. Andererseits konnte bei der MS-Untersuchung die Anwesenheit von DMS eindeutig anhand des Peaks bei m/z = 62 und dem dazugehörigen Fragmentierungsmuster nachgewiesen werden. Dennoch wurde DMS bei der MS-Untersuchung der anderen festen Reaktionsrückstände (FeS2 bzw. S8) nicht detektiert. Da der Reaktionsrückstand der Reaktion von FeS/H2S analog aufgearbeitet wurde, deutet dieser Befund darauf hin, dass DMS insbesondere mit der reaktiveren FeS-Ober.äche, nicht jedoch mit einer FeS2-Ober.äche, wechselwirkt oder dort sogar adsorbiert wird. Solch ein Adsorptionse.ekt wurde zumindest in einem wei­teren Vergleichsexperiment, beim Erhitzen von DMS in einer NaCl-Lösung bzw. in einer Suspension aus amorph gefälltem FeS, nachgewiesen. Eine Adsorption von DMS an der Ober.äche des festen Reaktionsproduktes FeS könnte zur Verfälschung beim Ermitteln der DMS-Ausbeute über die Extraktion aus der Reaktionslösung führen. 5.5.5 Diskussion und Ausblick Es konnte gezeigt werden, dass sich das FeS/H2S-System tatsächlich als Modell für eine primitive DMSO-Reduktase eignet, da es äquimolare Mengen an DMSO mit Ausbeu­ten von 40 % bis zu 65 % reduzieren kann. Als Konkurrenzreaktion tritt die Reduktion von DMSO durch H2S auf, bei der beim Einsatz äquimolarer Mengen der Reaktanden DMS-Ausbeuten von bis zu 40 % detektiert wurden. Allerdings spielt diese Reaktion in Gegenwart von amorphem FeS, d.h. bei Verwendung des FeS/H2S-Systems, wahr­scheinlich nur eine untergeordnete Rolle, da die Bildung von Pyrit bzw. Markasit als dominierende Spezies im festen Reaktionsprodukt mittels PXRD nachgewiesen werden 5.5 Untersuchungen zur Reduktion von DMSO durch das FeS/H2S-System konnte. Hingegen gab es nur schwache Anhaltspunkte für die Anwesenheit von elemen­tarem Schwefel S8, da diesem im Di.raktogramm nur sehr intensitätsschwache Re.exe zugeordnet werden konnten. Dass S8 bei der Reaktion von DMSO mit dem FeS/H2S­System entsteht, konnte mittels MS belegt werden. H2S reagiert also auch in Gegenwart von FeS teilweise direkt mit DMSO. FeS ohne H2S kann DMSO nur in geringem Ausmaß (max. 10 %) reduzieren, ist aber in der Lage, DMS stärker an der Ober.äche zu binden. Da die Bestimmung von DMS aus dem Überstand der Reaktionssuspension erfolgte, könnte adsorbiertes DMS zu einer systematisch zugering bestimmten DMS-Ausbeute führen.Hier könnte das Au.ösen von FeS, z.B. durch KHSO4, vor der Probennahme für die DMS-Extraktion Abhilfe scha.en. Die Untersuchungen zur Reduktion von DMSO zeigten ferner, dass unter den verwen­deten Reaktionsbedingungen von 95.C und pH 7 eine rasche Reaktion erfolgt, da das Oxidationsprodukt (Schwefel bzw. graues Pyrit) des jeweiligen Reduktionssystems schon nach einem Tag beobachtbar sind. Vergleicht man die Ausbeuten der Experimente für das FeS/H2S-System nach 7 Tagen und 14 Tagen, so zeigt sich, dass bereits nach einer Woche die DMS-Ausbeute nahezu konstant bleibt. Eine Erklärungfür die unerwartete Reduktionvon DMSOdurch H2SlieferteinVergleich derStandardpotenziale.SoweistdasRedoxpaarDMS/DMSOeinStandardpotenzialvon E.(DMS/DMSO) = +160 mV auf [121], während das Redoxpaar H2S/S ein Standardpo­tenzial von E.(H2S/S) = +142 mV besitzt. Aufgrund desniedrigeren Standardpotenzials wirkt H2S bei der Reaktion mit DMSO als Reduktionsmittel. VonderReduktionvonDMSOundweiterereinfacherAlkylsulfoxidedurcheingebrachtes H2S-GasbeiTemperaturenvon20 -50.Cwurdebereitsberichtet[125].DieUntersuchun­gen fanden indes nicht im wässrigen Milieu sondern im jeweiligen Alkylsulfoxid statt, das somit gleichzeitig als Lösungsmittel und als Reaktand fungierte. Äußerst interessant in diesem Zusammenhang ist, dass Kläui et al. beobachteten, dass Diphenyl-und Dibenzylsulfoxid (DPSO und DBSO) nicht von H2S reduziert werden. Da Alkylsulfoxide wie DMSO hingegen von H2S reduziert werden, liegt die Vermutung nahe, dass die Standardpotenziale von DPSO und DBSO niedriger als das von DMSO und sogar niedriger als das von H2S sind, so dass H2S nicht mehr oxidiert werden kann. Ein niedrigeres Redoxpotenzial könnte durch die stark elektronenschiebenden, aroma­tischen Reste in DPSO und DBSO verursacht werden, die die positive Partialladung am Sulfoxid-Schwefelatom stabilisieren und damit dessen Oxidationskraft entscheidend verringern. Der Vergleich der Reaktion von FeS/H2S bzw. von H2S mit DMSO zeigt, das die ther­modynamisch mögliche Reduktion von DMSO in beiden Fällen mit DMS-Ausbeuten von über 30 % abläuft. Dabei konnte für das FeS/H2S-System eine nur wenig höhere DMS-Ausbeute realisiert werden, obwohl die thermodynamische Triebkraft mit einem StandardpotenzialdesFeS/H2S-SystemsvonE. =-620mV[45]deutlichgrößeristalsfür H2S. Die Frage, in welchem Umfang DMSO bei der Reaktion mit dem FeS/H2S-System direkt durch H2S reduziert wird, lässt sich aus den Analyseergebnis der PXRD ungefähr abschätzen. FeS2 ist eindeutig das Hauptprodukt der Reaktion, während S8 als Produkt der direkten Reaktion von H2S mit DMSO nur eine untergeordnete Rolle spielt. Aufklärung können zukünftige Untersuchungen der Reaktionskinetik (Aktivierungsener­gie und Geschwindigkeitskonstante) zur Abschätzung der Geschwindigkeit der Bildung von S8 (aus H2S) bzw. Pyrit (aus FeS/H2S) durch das jeweilige Reduktionsmittel liefern. In diesem Zusammenhang kann zudem geklärt werden, ob die Reduktion von DMSO un­ter den untersuchten Bedingungen u.U. bereits in weniger als sieben Tagen erfolgt. 6 Zusammenfassung Eisenhaltige Phospholipid-und Polymervesikel Im Rahmen dieser Doktorarbeit konnten erstmals FeS-haltige Vesikel hergestellt werden. Dieses Ergebnis ist ein bedeutsamer Schritt auf dem Weg zur Kompartimentierung des potenziell energieliefernden FeS/H2S-Systems in einer Art Protozelle, was eine wichtige Vorhersage der Eisen-Schwefel-Welt-Hypothese darstellt. DerHerstellungswegFeS-haltigerVesikelbeinhaltetezunächtdenEinschlusskomplexier­ter Fe2+-Ionen in Vesikeln. Nach der anschließenden Aufreinigung der Vesikeldispersion konnte durch die Inkubation mit H2S intravesikulär FeS ausgefällt werden. Dieses konnte über mehrere Kontrollexperimente für die Vesikeldispersion sowie mittels REM-ESMA für diskrete Vesikel (s. Abb. 69a) nachgewiesen werden. Es wurden vesikuläre Systeme auf Basis von 1-Palmitoyl-2-oleoyl-glycero-phosphatidyl-cholin(POPC)sowiedemblock-Copolymer1,2-Polybutadien-polyethylenoxid(PB-PEO) auf ihre Eignung hin untersucht. Beide Systeme erwiesen sich tauglich für den Ein­schluss von komplexierten Fe2+-Ionen mittels Filmhydratisierungs-Extrusions-Methode. Die dabei erzielten Einschlussraten von Fe2+-Ionen konnten anhand einer dafür entwi­ckelten spektrophotometrischen Quanti.zierungsmethode bestimmt werden. Bei einer Fe2+-Startkonzentration von 60 mM wurde ein mittlerer Eisengehalt von 0,65 mM in einer 10 mM POPC-Liposomendispersion und von 0,30 mM in einer 1,6 mM PB-PEO-Polymersomendispersion ermittelt. Für PB-PEO ergibt sich somit ein Einschluss von 0,19 µmolF e2+ und für POPC ein Einschluss von 0,065 µmolF e2+ . Folglich lassen sich µmolLipid µmolLipid Fe2+-Ionen e.zienter in PB-PEO-Polymersomen als in POPC-Liposomen verkapseln, allerdings nur bei vergleichsweise geringen Lipidkonzentrationen. Für die intravesikuläre Bildung von FeS wiesen nur Polymervesikel eine hinreichen­de Stabilität auf. Allerdings konnte eine vorher noch nicht beschriebene Reversibili­tät der FeS-Fällungsreaktion in Polymersomen beobachtet werden. Anhand von REM­ESMA-Untersuchungen konnte bewiesen werden, dass dies auf eine abnehmende H2S­Konzentration in der Polymersomendispersion während der Lagerung zurückzuführen ist und durch einen Überschuss an H2S unterdrückt werden kann. POPC-Liposomen eignen sich nicht zur intravesikulären Ausfällung von FeS, da sie ei­ne ausgeprägte Instabilität gegenüber FeS aufweisen, wie Membran-und Vesikelstabi­litätsuntersuchungen ergaben. Gleichwohl ist es möglich, im Inneren von Fe2+-haltigen Liposomen mit Magnetit-Nanopartikeln und (c) Cryo-TEM-Aufnahme eines CdS­ haltigen Polymersoms POPC-Liposomen, die mittels Reverse-Phase-Evaporation-Methode hergestellt wurden, Aggregate von Magnetit-Nanopartikeln (Magnetit-NP) zu generieren (s. Abb. 69b). Dies kann durch das Lagern der Vesikeldispersion an Luftsauersto. induziert sowie durch Zu­gabe eine Base beschleunigt werden. Die derart hergestellten Liposomen sind mehrere Wochen stabil und zeigen einen magnetophoretischen E.ekt in einem äußeren Magnet­feld, wobei die Mobilität mit der Größe der Liposomen (und damit der Größe interner Magnetit-Niederschläge) korreliert. Auch im Inneren von Fe2+-haltigen Polymersomen konnten mit derselben Methode in­travesikuläre Aggregate von Magnetit-NP erzeugt und mittels Cryo-TEM nachgewiesen werden. Weiterhin konnten mit Triethylenglykol stabilisierte Magnetit-NP mit Durchmessern von 4 -8,5 nm hergestellt und optimale Bedingungen zur Generierung einer homogenen und stabilen wässrigen Suspension gefunden werden. Das erhaltene „ferro.uid“ erwies sich als geeignet, um geringe Mengen von Magnetit-NP in die Membran von PB-PEO-Polymersomen einzubetten. Weitere übergangsmetallhaltige Polymersomen Zum besseren Verständnis der intravesikulären Ausfällung von Metallsul.den wurden zudem Metallsul.de von Nickel, Cadmium und Kupfer in Polymervesikeln über dasselbe VerfahrenwiefürFeShergestelltundcharakterisiert.DieinPolymersomenhergestellten, photohalbleitenden CdS-NP stellen ein vielversprechendes System für intravesikuläre, photokatalytische Reaktionen analog zu [18,19] dar. Im Fall von Nickel zeigte sich, dass die erzielten Einschlussraten von Ni2+-Ionen in Polymersomen vergleichbar mit denen von Fe2+-Ionen sind, was auf die chemische Ver­wandschaft der beiden Metalle zurückgeführt werden kann. Anhand von Kontrollexperi­menten konnte auch für aufgereinigte Ni2+-haltige Polymersomen gezeigt werden, dass bei der Inkubation mit einer H2S-haltigen Lösung intravesikuläres NiS gebildet wird, welches in Form von di.usen Aggregaten sowie Membranablagerungen in Cryo-TEM-Untersuchungen detektiert werden konnte. CdS-NP konnten in Cd2+-haltigen Polymersomen durch Inkubation mit H2S ausgefällt werden. Die UV/Vis-spektroskopische Verfolgung der Fällungsreaktion ermöglichte die Ermittlung der jeweiligen CdS-Absorptionskante und damit eine Abschätzung der Größe intravesikulär generierter CdS-NP. Dies ist auf Quantisierungse.ekte des photohalblei­tenden CdS zurückzuführen. Es zeigte sich, dass v.a. der pH-Wert die Größe der entste­henden NP maßgeblich beein.usst. Mit zunehmendem pH-Wert entstehen dabei kleinere CdS-Partikel. Cryo-TEM-Untersuchungen von CdS-haltigen Polymersomen bewiesen, dass die beob­achteten CdS-Niederschläge intravesikulär vorliegen. Durch die hohe Ordnungszahl und den daraus resultierenden intensiven Kontrast konnten auch CdS-NP mit einem Durch­messer von 1,5 -3 nm neben größeren NP mit Durchmessern im Bereich von 6 -9 nm detektiert werden (s. Abb. 69c). Diese wichtige Beobachtung zeigt, dass ein Teil der aus­gefällten Metallsul.d-NP einen Durchmesser < 5 nm aufweist. FeS-und NiS-NP dieser Größe sind höchstwahrscheinlich aufgrund des deutlich geringeren Kontrastes im Ver­gleich zu CdS-NP nicht mittels Cryo-TEM detektierbar. Auch Cu2+-Ionen konntenmittels Filmhydratisierungs-MethodeinPolymersomen einge­schlossen werden. Nach der Aufreinigung wurden diese Polymersomendispersionen zur Ausfällung von CuS mit einer H2S-Lösung inkubiert. Die Kinetik dieser Metallsul.d-Fällungsreaktion wurde anhand der Veränderung der optischen Dichte für CuS sowie zusätzlich für CdS und NiS verfolgt. Für alle drei untersuchten Systeme zeigte sich, dass eine sehr rasche Umsetzung von ca. 80 % innerhalb der ersten 120 s nach der Inkubation mit H2S statt.ndet. Dieses Ergebnis ist in Übereinstimmung mit Berichten zur Fällung von CuS und CdS in Phospholipidvesikeln [19]. Reaktivität des FeS/H2S-Systems Die Reduktionskraft des potenziell energieliefernden FeS/H2S-Systems entsprechend der Eisen-Schwefel-Welt-HypothesekonntedurchUntersuchungenzurReduktionvonDMSO an einem weiteren bedeutsamen Beispiel demonstriert werden. Die Ergebnisse sind ein weiterer Beleg für die Reaktivität des FeS/H2S-Systems im Sinne eines primordialen En­zyms. Die Untersuchungen wurden nicht mit dem kompartimentierten FeS/H2S-System, d.h. nicht im Inneren von Liposomen oder Polymersomen durchgeführt, sondern stellen eine notwendige Grundlage für derartige zukünftige Versuche in Vesikeln dar. Zunächst wurde die Reaktivität des bei den Untersuchungen verwendeten amorphen FeS näher charakterisiert. Dieses kann mit einer spezi.schen Ober.äche von ca. 35 mg 2 durch Ausfällung aus einer Fe2+-haltigen Lösung hergestellt werden. Es eignet sich zum einen zur selektiven Herstellung von Pyrit (FeS2) über die Reaktion mit elementarem Schwefel eignet. Zum anderen konnte nachgewiesen werden, dass amorphes FeS mit H2S unter Bildung von H2 und Pyrit reagiert (Berzelius-Reaktion). In weiteren Untersuchungen des dabei erhaltenen Pyrits konnte der in der Literatur diskutierte Einschluss von H2 im Inneren von Pyritpartikeln nicht bestätigt werden. Weiterhin wurde untersucht, ob das FeS/H2S-System im Sinne einer primitiven DMSO-Reduktase DMSO zu Dimethylsul.d (DMS) reduzieren kann. Dafür wurde erfolgreich eine Methode zur Durchführung der Reaktion unter inerten Bedingungen bei 95.C so­wie eine geeignete Analysenmethode zum quantitativen Nachweis von DMS mittels GC entwickelt. Die Reaktion von DMSO mit dem FeS/H2S-System lieferte DMS-Ausbeuten im Bereich von 40 -65 % schon nach einer Reaktionszeit von sieben Tagen. Eine PXRD-Analyse des festen Reaktionsprodukts zeigte, dass dieses vorwiegend aus FeS2 besteht. Elementarer Schwefel konnte nicht detektiert werden. H2S ist ebenfalls in der Lage, DMSO zu ca. 30 -40 % zu DMS zu reduzieren. Bei dieser Reaktion wird H2S durch DMSO zu elementarem Schwefel oxidiert. Die Reaktion ist thermodynamisch begünstigt, da die Oxidationskraft von DMSO geringfügig höher als die von Schwefel ist. Die PXRD-Analyse des Produkts der Reaktion von FeS/H2S mit DMSO zeigt, dass die potenzielle Konkurrenzreaktion einer unmittelbaren Reduktion von DMSO durch H2S in Gegenwart von FeS nicht abläuft, da kein Schwefel gebildet wurde. Die Ergebnisse belegen, dass das FeS/H2S-System eine Reaktivität im Sinne einer primitiven DMSO-Reduktase aufweist. 7 Experimenteller Teil 7.1 Chemikalien und Methoden Eingesetzte Chemikalien Das eingesetzte Phospholipid 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-phosphatidylcholin wurde von der Firma Genzyme bezogen. Das block-Copolymer 1,2-PB33-PEO27 wurde von der Arbeitsgruppe von Prof. Förster (Universität Hamburg) zur Verfügung gestellt. Die verwendeten Chemikalien Hydroxylamin Hydrochlorid, Zitronensäure, Pyrazin-2,3­dicarbonsäure, (NH4)2Fe(SO4)2 · 6H2O, FeCl2 · 4H2O, NiCl2 · 6H2O, CuCl2 · 2H2O, CdCl2, TiCl3-Lösung, CHCl3, CHCl2, DMSO, Triethylenglykol, Ethylacetat, Thioacet­amid, Natriumsul.d Hydrat (Na2S · 9H2O), Tris(hydroxmethyl)-aminomethan, Natri­umacetat Trihydrat, EDTA, 1,10-Phenanthrolin, Linolsäure, Dimethylsul.d, Dimethyl­glyoximundTRITONX100wurdenvondenFirmen Acros, Alfa Aesar, Avocado, BASF, Fluka, Merck, Roth und Sigma Aldrich bezogen und ohne weitere Reinigung verwendet. Nach Literaturvorschrift im Praktikum hergestelltes, kristallines Fe(acac)3 wurde wie vorgefunden eingesetzt. Für die GC von DMSO wurden spektralreines Hexan und To­luen von der Firma Merck eingesetzt. Das verwendete glove bag aus Polyethylen wurde von der Firma Roth erworben. Entgasung und Trocknung der Lösungsmittel Deionisiertes Wasser wurde unter Rühren bei 80.C zwei Stunden durch Durchleiten von Argon entgast. In Ethanol, Cyclohexan und Hexan wurde zum Entfernen von Luft­sauersto. maximal zwei Stunden lang unter Rühren Argon eingeleitet. Das Trocknen von Diethylether und Tetrahydrofuran erfolgte mit Natrium nach bekannten Vorschrif­ten [126]. UV/Vis-Spektroskopie DieUV/Vis-Messungenwurdenmiteinem SPECORD S 600 UV VIS derFirma Analytik Jena unter Verwendung des Programms WinAspect durchgeführt. Atomabsorptionsspektrometrie Die zu untersuchenden Proben wurden vor der Messung mit dem doppelten Volumen an konzentrierter HNO3 aufgeschlossen, quantitativ in einen Maßkolben überführt und auf ein de.niertes Volumen gebracht. Für die Messungen wurde ein Atomabsorptions­spektrometer des Modells Perkin-Elmer 3110 mit Flammentechnik verwendet. Mit dem eingesetzten Gasgemisch Acetylen-Luft erfolgte mit einer jeweils geeignete Lampe die Bestimmung von Eisen (Messwellenlänge .Fe = 248,3 nm), Nickel (.Ni = 231,6 nm), Kupfer (.Cu = 324,7 nm) und Cadmium (.Cd = 228,8 nm). PCS Die PCS-Messungen wurden mit dem Gerät Zetasizer Nano ZS der Firma Malvern durchgeführt. Der zur Verdünnung der Proben jeweils verwendete Pu.er wurde zuvor durchCelluloseacetat.lterderFirma MilliporemiteinerPorengrößevon0,22 µm.ltriert. Cryo-TEM 3 µl der Vesikeldispersionen wurden auf ein Kupfer-Grid gegeben, und der Überschuss an Flüssigkeit wurde automatisch für 3 Sekunden mit Hilfe zweier Filterpapiere abgenom­men. Anschließend wurden die Proben sehr schnell in .üssiges Ethan (ca. -180 .C) in einer Cryobox der Firma Zeiss getaucht. Der Überschuss an Ethan wurde ebenfalls mit einem Filterpapier entfernt. Die Proben wurden in der Cryo-Transfereinheit Gatan 626­DH in das mit .üssigem N2 gekühlte Transmissionselektronenmikroskop Philips CM 120 der Firma Philips überführt. Die Bilder wurden mit einer 1 K CCD Kamera FastScan F114 der Firma TVIPS aufgenommen. Rasterelektronenmikroskopie und ESMA Für die Elektronenstrahl-Mikroanalyse (ESMA) von diskreten Polymersomen wurden Siliziumwafer der Firma Plano verwendet, welche zunächst nacheinander mit Aceton, Isopropanol und H2O (destilliert und .ltriert) behandelt wurden. Anschließend wurden 10 µl der Vesikeldispersion (zuvor gegen H2O dialysiert) auf den Wafer aufgetragen. Nach einer Einwirkzeit von 1 Minute wurde der Überstand abgenommen und der ent­sprechende Wafer unter Argon-Atmosphäre gelagert. Für die Aufnahme von Elektronenmikrographen wurde das Rasterelektronenmikroskop 7.1 Chemikalien und Methoden LEO-1530 Gemini der Firma Zeiss eingesetzt. Mit denselben Proben konnte eine ESMA mit einem Philips SEM 515 der Firma Philips ausgerüstet mit einem DX-4 Detektor durchgeführt werden. Dabei wurde eine Elektronenenergie von 25 keV zur Anregung des Fe-Ka-Peaks verwendet. Zur Untersuchungvon fün.ach aufkonzentrierten FeS-und CdS-haltigen Polymersomen­proben mittels REM-ESMA wurden jeweils dreimal 3 µl der dick.üssigen Vesikeldisper­sion auf ein Kohlensto.-beschichtetes Kupfer-Grid gegeben und dort zum Eintrocknen belassen. TEM-Untersuchungen von Magnetit-NP 10µl einer wässrigen Suspension von Magnetit-NP wurden auf ein Kupfer-Grid aufge­tragen. Nach einer Einwirkungszeit von 60 s wurde das Grid mit Filterpapier abgesaugt und anschließend in das Transmissionselektronenmikroskop Philips CM 120 der Firma Philips eingeschleust. Die Bilder wurden mit einer 1 K CCD Kamera FastScan F114 der Firma TVIPS aufgenommen. Lichtmikroskopie Für lichtmikroskopische Untersuchungen wurde das Mikroskop Leica DM RXP einge­setzt. Zur Visualisierung von Polymersomen wurde mit einer 100-fachen Vergrößerung gearbeitet. Ober.ächenmessungen Die Messungen der Ober.äche und des Porenvolumens wurden an einem automatischen, volumetrischen Sorptionsautomaten des Typs Autosorb 1 der Firma Quanta Chrome durchgeführt. Vor der Messung wurden die Proben unter Vakuum für mindestens zwei Stunden bei 250.C ausgeheizt. Die Messungen erfolgten im Anschluß daran bei -196.C, der Siedetemperatur von Sticksto.. Di.erenzthermoanalyse (DTA) und Thermogravimetrie (TG) Die kombinierten DTA-und TG-Messungen erfolgten an dem Gerät STA 429 für simul­tane Thermoanalyse der Firma Netzsch Gerätebau Selb. Röntgenpulverdi.raktometrie Alle Messungen erfolgten mit einer Eisen-Anode der Geräte ID 3000 und HZG4 von der Firma Seifert. Zentrifugation Eppendorf-Gefäße wurde mit einer Biofuge 13 der Firma Heraeus Sepatech zentrifu­giert. Die Ultrazentrifugation wurde mit einer Ultrazentrifuge des Typs XL-80 der Firma Beckman mit einem SW Ti 55 Rotor bei 55000 Umdrehungen pro Minute (entspricht ca. 286000 g) durchgeführt. Dabei wurden Polyallomer-Zentrifugengefäße mit einem Vo­lumen von 3,5 ml verwendet. 85 ml Schlenkgefäße wurde mit einer Cryofuge 6000i der Firma Heraeus bei einer Dreh­zahl von 700 U/min für 10-40 Minuten zentrifugiert. Gaschromatographie (GC), Massenspektrometrie (MS) und GC-MS Die gaschromatographischen Bestimmungen von Dimethylsul.d (DMS) erfolgten mit dem Gaschromatograph CP 9000 der Firma Chrompack mit einer 25 m Methylsilicon­säule vom Typ CP SiL 5CB und Flammen-Ionisations-Detektor (FID). Als Trägergas kam H2 mit einer Flußrate von 2 ml zum Einsatz. Die Injektionstemperatur betrug min 250.C. Die Ausgangstemperatur des Säulenofens lag bei 30.C. Nach 2.6 min wurde dann gleichmäßig innerhalb von 9 min auf 300.C aufgeheizt. Vorhandenes DMS wurde nach 2.12 min detektiert. DieIdenti.zierungvonDMSerfolgtemittelsGC-MSunterannähernddenselbenMessbe­dingungen, d.h. gleicher Säulentyp und gleiches Temperaturprogramm, mit einem Gas­chromatograph der Firma Varian und einem Massenspektrometer des Typs Finnigan SSQ 710. Mit demselben Massenspektrometer erfolgten auch die MS-Untersuchungen. 7.2 Vorschriften 7.2 Vorschriften Bestimmung der Fe2+-PDC-Komplexzusammensetzung mit der Methode der kontinuierlichen Variation Die Vorbereitung der Lösungen erfolgt unter inerten Bedingungen. In einem 50 ml Maß­kolben wird eine 2 mM PDC-Lösung (16,8 mg Pyrazin-2,3-dicarbonsäure versetzt mit 40 µl 5 M NaOH, entspricht zwei Äquivalenten Natriumhydroxid) in entgastem TRIS­HCl-Pu.er hergestellt. In einem zweiten Maßkolben wird eine 2 mM Fe2+-Lösung in entgastem TRIS-HCl-Pu.er hergestellt (z.B. mit 39,2 mg (NH4)2Fe(SO4)2 · 6H2O). Nun werden mehrere 10 ml Maßkolben mit genau abgemessenen Volumina der 2 mM PDC-Lösung und der 2 mM Fe2+-Lösung in unterschiedlichen ganzzahligen Verhältnis­sen befüllt (immer mit insgesamt genau 10 ml) und homogenisiert. Anschließend erfolgt zeitnahdieUV/Vis-spektroskopischeVermessung,wobeizurAuswertungdieAbsorption am Absorptionsmaximum von .max = 475 nm verwendet wird. Bestimmung der Fe2+-PDC-Komplexzusammensetzung mit der Methode der molaren Verhältnisse Unter inerten Bedingungen werden 1000 µl einer 50 mM Fe2+-Lösung in entgastem 100 mM TRIS-HCl-Pu.er mit 19,6 mg (NH4)2Fe(SO4)2 · 6H2O hergestellt. Zudem erfolgt die Präparation von 1000 µl einer 100 mM PDC-Lösung (16,8 mg PDC ver­setzt mit 960 µl TRIS-HCl-Pu.er und 40 µl 5 M NaOH). In neun 10 ml Maßkolben werden nun stets 40 µl der 50 mM Fe2+-Lösung (Endkonzentration 0,2 mM) sowie un­terschiedliche Volumina (10 µl -260 µl) der 100 mM PDC-Lösung gegeben, mit entgas­tem TRIS-HCl-Pu.er aufgefüllt und homogenisiert. Zeitnah erfolgt dann die UV/Vis­spektroskopische Vermessung, wobei zur Auswertung die Absorption im Absorptions­maximum bei .max = 475 nm verwendet wird. Eisenhaltige Liposomen mit Filmhydratisierung und Extrusion In einen 100 ml Rundkolben werden 10 µmol POPC in Form einer Stammlösung in CHCl3 gegeben und mit etwa zwei Milliliter CHCl3 verdünnt. Die POPC-Lösung wird nun am Rotationsverdampfer bei 38.C schrittweise eingeengt, bis praktisch alles CHCl3 abdestilliert ist. Der erhaltene Film wird nun noch 30 Minuten an einer Hochvakuum­pumpe getrocknet. Nach dem Spülen des Kolbens mit Argon werden 1000 µl einer zuvor im glove bag hergestellten, sauersto.freien Fe2+-Lösung auf den Film gegeben und unter kräftigem Vortexen (und ggf. Ultraschall) der Film hydratisiert. Die erhaltenen Liposo­men können nun ggf. extrudiert bzw. direkt mittels Dialyse oder Gelpermeationschro­matographie aufgereinigt werden. Eisenhaltige Liposomen mit Reverse-Evaporation-Methode In einem sekurierten Reagenzglas-Schlenkgefäß werden 5 ml ketylierter Diethylether so­wie 5 ml Dichlormethan gemischt. Anschließend erfolgt die Zugabe von 10 µmol POPC in Form einer Stammlösung in CH2Cl2 zu dem organischen Lösungsmittelgemisch. Nach dem Vortexen der Lösung werden nun 1000 µl einer zuvor im glove bag hergestellten, sauersto.freien Fe2+-Lösung mit einer Spritze in die POPC-Lösung rasch injiziert, an­schließend das Gemisch eine Minute intensiv gevortext und dann drei Minuten im Ultra­schallbadbehandelt.DiedabeientstandenehomogeneEmulsionwirdnunamsekurierten Rotationsverdampfer bei 38.C mittels Wasserstrahlpumpe schrittweise eingeengt, bis ein festes Gel entsteht. Das erhaltene Gel wird nun durch intensives Vortexen gebrochen, wobei eine Liposomendispersion entsteht. Abschließend werden noch letzte Reste des organischen Lösungsmittels bei ca. 50 mbar entfernt. Die erhaltene Dispersion kann nun mittels Dialyse oder Gelpermeationschromatographie aufgereinigt werden. Eisenhaltige Polymersomen mit Filmhydratisierungsmethode In einen 100 ml Einhalskolben wird die gewünschte Menge Polymer (hier 4.9 mg) ein­gewogen bzw. eine de.nierte Menge einer PBPEO-Stammlösung in CHCl3 zugegeben. Nach dem Lösen in ca. 2 ml Chloroform wirddas Lösungsmittel bei 38.C schrittweise am Rotationsverdampfer abdestilliert. Anschließend wird der Kolben nach einer schnellen ÜberführungnocheineStundemiteinerHochvakuumpumpegetrocknet.UnterArgonat­mosphäre werden nun 1000 µl einer frisch hergestellten, entgasten Fe2+-haltigen Lösung in den Filmkolben gegeben und dieser nach dem Verschließen zum Hydratisieren min­destens 15 Stunden lang mit einer Rüttelmaschine IKA-VIBRAX-VXR der Firma IKA (Regler: 1000) geschüttelt. Die erhaltene Dispersion kann nun extrudiert bzw. mittels Dialyse oder Gelpermeationschromatographie aufgereinigt werden. 7.2 Vorschriften Extrusion von Vesikeldispersionen Zur Herstellung von kleinen, unilamellaren Vesikeln werden die jeweiligen Vesikeldisper­sionen mittels Poren.ltermembran-Extrusion auf eine Größe von 200 nm bzw. 100 nm mechanisch eingestellt. Dafür wird der Extrusionsprozess sukzessive 21mal durch eine 200nmunddanneine100nmPolycarbonatmembranunterVerwendungeines LiposoFast-Basic Extruders der Firma Avestin (Ottawa, Canada) wiederholt. Dialyse von Liposomen-bzw. Polymersomendispersionen Die erhaltenen, bei Einschluss des Fe2+-PDC-Komplexes tiefroten Vesikeldispersionen werden im glove bag der Firma Roth dialysiert. Dazu wird eine Dialysezelle des Typs Mini Lipoprep Dialyser mit einer zuvor in der Pu.erlösung eingeweichten Cellulose-Membran (cut-o. 10000 Da) bespannt und zunächst in der Pu.erlösung belassen. Nach der Überführung dieser Zelle in das glove bag wird dieses sekuriert und dann die hydra­tisierte Vesikeldispersion (ca. 900 µl) in die Dialysezelle eingefüllt. Es wird in zwei bzw. drei Schritten je nach Eisen-Startkonzentration mit einem Pu.ervolumen von mindes­tens 200 ml dialysiert. Dabei kommt ein 100 mM TRIS-HCl-Pu.er zum Einsatz, der 2 h unter Rühren entgast wurde. Zur e.ektiven Abtrennung der Metallionen wird im ersten Dialyseschritt EDTA mit einer Konzentration von 6 mM und im zweiten Dialyseschritt 1 mM EDTA zugesetzt. Bei der Dialyse von Liposomendispersionen muss aufgrund des notwendigen osmotischen Ausgleichs eine isoosmotische Menge an Na2SO4 im Dialyse­pu.er vorhanden sein. Nach dem Ende der Dialyse wird die erhaltene Vesikeldispersion aus der Dialysezelle entnommen und inert gelagert. Gelpermeationschromatographie von Liposomen-bzw. Polymersomendispersionen Zum Abtrennen von externem Eisen können Vesikeldispersionen über eine Sephadex PD10 G 25 M-Säule aufgereinigt werden. Dazu wird eine solche Säule zunächst mit dem fünfachen Volumen des verwendeten Pu.ers gespült. Anschließend wird ein der Trennleistung der Säule angemessenes Volumen der Vesikeldispersion (je nach Lipid­konzentration 50-200 µl) aufgetragen und mit genügend Pu.er vollständig eluiert. Die gesammelten Fraktionen können nun mittels PCS bzw. UV/Vis-Spektroskopie auf das Vorhandensein von Vesikeln überprüft werden. Bestimmung von intravesikulärem Eisen mittels 1,10-Phenanthrolin (phen) DieBestimmungvonFe2+-IonenerfolgtaufgrundderstörendenMatrix(amphiphileSub-stanzen)jeweilsmitderStandard-Additions-Methode.DerintensivrotgefärbteKomplex [Fe(phen)3]2+ dient dabei zur spektrophotometrischen Quanti.zierung von Eisen. Zunächst wird unter inerten Bedingungen eine 125 mg Fe2+-Standardlösung frisch her- L gestellt. Dann werden für die Bestimmung von Eisen in dialysierten A) Liposomen 4 Aliquote (80-150 µl) der Liposomendispersion mit dem doppelten Vo­lumen einer 10%-igen Triton X 100-Lösung zur Zerstörung der Liposomen versetzt. Nach dem Homogenisieren werden die erhaltenen Lösungen jeweils quantitativ in einen 25 ml Maßkolben überführt. B) Polymersomen 4 Aliquote (mindestens 80 µl) der Polymersomendispersion mit je­weils 150 µl THF versetzt und so lange geschüttelt, bis die Probe homogen und klar ist. Anschließend werden die Lösungen jeweils quantitativ in einen 25 ml Maß­kolben überführt. Nun wird in allen Fällen eine zusätzliche Blindprobe in einem weiteren 25 ml Maßkolben mit demselben Volumen des jeweiligen Reagenzes zum Au.ösen der Vesikel präpariert (A: 10%-iges TRITON X 100 bzw. B: THF). Anschließend werden 3 der 4 Aliquoten-Lösungen in den Maßkolben mit der erforderlichen Menge (20 µl, 40 µl sowie 100 µl) der 125 mg Fe2+-Standardlösung versetzt. Nun werden in alle Maßkolben nacheinander L jeweils 500 µl einer wässrigen Lösung von 80 Lg NH2OH · HCl, dann 5 ml einer wäss­rigen Lösung von 1 Lg 1,10-Phenanthrolin sowie schließlich 6 ml einer 1,2 M wässrigen Natriumacetat-Lösung gegeben. Abschließend werden alle Maßkolben bis zum Eichstrich aufgefüllt und homogenisiert. Nach weiteren 10 Minuten werden die Lösungen nochmals durch Schütteln homogenisiert und dann mit einem UV/Vis-Spektrometer vermessen, wobei zur Auswertung die Absorbanz bei . = 508 nm herangezogen wird. Bestimmung von in Polymersomen eingeschlossenem Nickel Die Bestimmung von Nickel erfolgt analog der Eisenbestimmung aufgrund der störenden Matrix jeweils mit der Standard-Additions-Methode. Als spektrophotometrisches Rea­genz kommt Dimethylglyoxim (dimegly) zum Einsatz, das mit Ni2+ einen intensiv rosa gefärbten, mäßig löslichen Komplex [Ni2+(dimegly)2] bildet. 7.2 Vorschriften Zunächst werden fünf 80 µl Aliquote der Vesikeldispersion mit der doppelten Menge an THF versetzt und in je einen 25 ml Maßkolben mit 10 ml 0,5 M HCl überführt. Anschlie­ßend erfolgt die Zugabe von 25, 50, 125 und 250 µl einer 100 mg Ni2+-Standardlösung zu L vier der Lösungen. Nun werden mehrere (mindestens 4) Tropfen Bromwasser zugegeben, so dass sich die Lösung deutlich gelb färbt. Es wird etwa 30 Sekunden gewartet und danach 0,6 ml 25%-iger NH3 zugegeben. Beim Homogenisieren entfärbt sich die Lösung und es bilden sich Rauchschwaden. Nun wird nochmals 1 ml 25%-iger NH3 sowie 1 ml einer 1%-igen Dimethylglyoxim-Lösung zugesetzt, wobei sich die Lösung orange färbt. Abschließend wird mit Wasser auf 25 ml aufgefüllt und nach 5 Minuten die Lösung in einer 5 cm Küvette UV/Vis-spektroskopisch vermessen. Zusätzlich wird der Blindwert einer Lösung bestimmt, die nur 150 µl THF enthält und genauso wie die Vesikelproben präpariert wird. Inkubation von Vesikeldispersionen mit gasförmigem H2S In einem 100 ml Dreihalskolben mit zwei Hahnschli.en werden 4,8 g Na2S · 9H2O (20 mmol) eingewogen und anschließend sekuriert. Danach erfolgt zum Au.ösen des Na2S die Zugabe von 15 ml entgastem H2O über ein Septum. Nun wird unter Rühren und Kühlung tropfenweise halbkonzentrierte H2SO4 auf die Na2S-Lösung gegeben und das generierte H2S mit einem schwachem Argonstrom durch einen Schlauch mit Pas­teurpipette direkt in die zu inkubierende Dispersion geleitet. Zur Gewährleitung inerter Bedingungen erfolgt die Inkubation in einem kontinuierlich mit Argon gespülten Eimer. Polymersomen mit Magnetit-Nanopartikeln 196 µl einer 25,5 mg PB-PEO-Stammlösung in CHCl3 in ei- ml werden mit 3 ml CHCl3 nem 100 ml Einhalskolben gemischt. Anschließend wird am Rotationsverdampfer bei 38.C das CHCl3 unter vermindertem Durck vollständig entfernt. Anschließend erfolgt das Trocknen des erhaltenen Polymer.lms für 4 h an einer Hochvakuumpumpe. Die Magnetit-NP werden mit einer Konzentration von 0,1 mg mittels Ultraschallbad in Was- ml ser suspendiert, das zuvor mit 0,5 M HCl auf pH 3 eingestellt wurde. 1000 µl dieser Suspension werden nun auf den Polymer.lm gegeben und der Kolben über Nacht an einer Rüttelmaschine IKA-VIBRAX-VXR (Regler: 1000) zum Hydratisieren des Films geschüttelt. Die erhaltene, hellbraune Dispersion kann nun noch mittels Gelpermeati­onschromatographie (s. S. 161) aufgereinigt werden. Dabei bleiben die Magnetit-NP auf der Säule liegen und können somit von den Polymersomen abgetrennt werden. Ausfällung und Aufreinigung von amorphem FeS 636 mg (1,62 mmol) (NH4)2Fe(SO4)2 · 6H2O werden in einem Schlenkkolben eingewo­gen, anschließend sekuriert und dann 15 ml entgastes H2O zugesetzt. Nun werden unter kräftigem Rühren mit einer Eppendorfpipette langsam 3,24 ml (1,62 mmol) einer ent­gasten 0,5 M Na2S-Lösung zugetropft, wobei schwarzes FeS ausfällt. Nach 30 Minuten Rühren wird zentrifugiert und der erhaltene Feststo. zweimal, zuerst mit 15 ml und dann mit 6 ml entgastem H2O gewaschen. Anschließend wird der schwarze Feststo. in 6 ml H2O suspendiert und unter inerten Bedingungen über Nacht lyophilisiert. Es wird ein schwarzes Pulver erhalten. Pyrit FeS2 aus amorphem FeS und Schwefel 588mg(1,5mmol)(NH4)2Fe(SO4)2 · 6H2Owerdeninein40mlZentrifugen-Schlenkgefäß eingewogen. Nach dem Sekurieren wird das Salz in 17 ml entgastem H2O gelöst. An­schließend werden unter kräftigem Rühren 3 ml (1,5 mmol) einer sauersto.freien 0,5 M Na2S-Lösung mit einer Eppendorf-Pipette zur Fällung des FeS zugetropft und noch zehn Minuten gerührt. Die Suspension weist nun pH = 6 auf. Nun werden 75 mg elementa­ren Schwefels (2,3 mmol) zu der Suspension gegeben und noch zehn Minuten gerührt. Schließlich wird das Schlenkgefäß mit der Reaktionssuspension für fünf Tage bei 65.C in einem Trockenschrank gelagert. Zur Aufarbeitung werden an der Ober.äche der Reaktionslösung schwebende Schwefel­partikel entfernt und die überstehende Lösung abgenommen. Zum Au.ösen von nicht reagiertem FeS werden nun 5 ml einer entgasten 5 M HCl auf den Feststo. gegeben und unter Rühren und Durchleiten von Argon entstehendes H2S ausgetrieben. Nach Beendigung der H2S-Entwicklung wird zentrifugiert und der Überstand verworfen. Der erhaltene Feststo. wird zweimal mit insgesamt 10 ml Wasser, zweimal mit je 5 ml ent­gastem Ethanol und zur Entfernung von verbliebendem Schwefel noch zweimal mit je 5 ml entgastem Cyclohexan gewaschen. Abschließend wird in vacuo getrocknet, wobei ein grau-schwarzer Feststo. erhalten wird. 7.2 Vorschriften Reaktion von FeS und H2S Zum Abdichten des Reaktions-Schlenkgefäßes wird KWS-Fett verwendet, das erst bei 120.C .üssig wird. In einem sekurierten Schlenkgefäß mit einem Volumen von ca. 50 ml werden ca. 40 mg lyophilisiertes FeS unter inerten Bedingungen gegeben und anschlie­ßend in 5 ml entgastem Citratpu.er (200 mM, pH 6) suspendiert. Anschließend werden 0,5 ml einer entgasten TiCl3-Lösung zugegeben, die zuvor aus einer mit Na2CO3 neu­tralisierten Mischung von 10 ml entgastem Citratpu.er (200 mM, pH 6) und 1 ml einer 15%-igen,HCl-sauren TiCl3-Lösung hergestellt wurde.Nunwird der Druck im Gasraum des Schlenkgefäßes vermindert und dann der Gasraum über ein Septum mit H2S gefüllt. Das Schlenkgefäß wird nun für mindestens fünf Tage bei 90.C in einem Trockenschrank gelagert.ZurAnalysedesGasraumsaufH2 erfolgteeineGC-Untersuchung.Dazuwerden mit einer gasdichten Hamilton-Spritze 100 µl direkt aus dem Gasraum des Reaktionsge­fäßes entnommen und ins GC eingespritzt. Der erhaltene Feststo. wird abzentrifugiert und in vacuo getrocknet. Reaktion von FeS und H2S mit DMSO In einem 85 ml Schlenkkolben werden 398 mg FeCl2 · 4H2O (2 mmol) eingewogen. Nach dem Sekurieren wird die Substanz in 20 ml entgastem H2O gelöst und dann unter kräftigem Rühren langsam 4,2 ml einer 0,5 M entgasten Na2S-Lösung (2,1 mmol) zur vollständigen Fällung von FeS zugetropft. Anschließend werden 142 µl (2 mmol) ent­gastes DMSO zugegeben. Nach zehn Minuten Rühren wird der Druck im Schlenkkolben reduziert und 45 ml gasförmiges H2S, das zuvor aus einer H2S-Gas.asche entnommen wurde, mit Spritzen über ein Septum zugegeben. Abschließend wird noch ein leichter Argon-Überdruck im Schlenkkolben angelegt, der Schlenkkolben dann verschlossen und im Ölbad unter Rühren für mehrere Tage auf 95.C (Ölbadtemperatur) erhitzt. Nach Be­endigung der Reaktion wird die Reaktionsmischung auf 0.C gekühlt, dann mit einer 5 ml Einwegspritze 3,6mlder Reaktionslösungabgenommenundin eingekühltesGC-vial mit 500 µl Toluen (mit 15 mg Hexan als internem Standard) gegeben. Nach 20 Minuten in- ml tensivem Mischen werden aus der Toluenphase ca. 2,5 µl mit einer Hamilton-Spritze entnommen und damit der Gehalt an Dimethylsul.d mittels GC-FID bestimmt. Kalibration zur Bestimmung des Gehalts an DMS in der Reaktionslösung Zur Bestimmung des DMS-Gehalts in der Reaktionslösung wird eine Kalibration un­ter möglichst vergleichbaren Bedingungen wie bei der Analyse der Reaktionslösungen durchgeführt. Dazu werden die bei den Experimenten verwendeten Schlenkgefäße mit demselben Volumen einer NaCl-Lösung (4 mmol NaCl auf 25 ml H2O wie auch bei der Reaktion)gefülltundanschließendde.nierteMengenanDMSindenSchlenkgefäßenein­gewogen. Bei 0.C erfolgt die Homogenisierung durch mehrmaliges Vortexen im Verlauf von 30 Minuten. Anschließend werden jeweils 3,6 ml aus den Schlenkgefäßen entnom­men und in ein GC-vial mit 500 µl Toluen (mit 15 mg Hexan als internem Standard) bei ml 0.C gegeben. Nach 20 Minuten mit mehrmaligem intensiven Vortexen bei 0.C werden 2,5 µl aus der organischen Phase mit einer Hamiltonspritze entnommen und ins GC zur Vermessung eingespritzt. Metallsul.d-Nanopartikel in Mikroemulsionen 54 mg (1,35 mmol) Natriumhydroxid werden in einem 85 ml Zentrifugen-Schlenkgefäß eingewogen und dieses sekuriert. Im Argon-Gegenstrom werden nun (in dieser Reihenfol­ge) 2,7 ml entgastes H2O, 4,1 ml entgastes Ethanol, 1 ml entgaste Linolsäure und 540 µl entgastes n-Hexan zugegeben. Unter kräftigem Rühren wird dann das in <1000 µl ent­gastem H2O gelöste Metallsalz (0,135 mmol), (NH4)2Fe(SO4)2 · 6H2O zur Herstellung von FeS bzw. NiSO4 · 6H2O zur Herstellung von NiS, zugegeben. Anschließend erfolgt die tropfenweise Zugabe von 270 µl 0,5 M entgaster Natriumsul.dlösung (0,135 mmol). NacheinerStundeunterRührenwerden4mlentgastesn-Hexanzugegeben,umeinePha­sentrennung zu bewirken. Anschließend wird zentrifugiert und die überstehende Lösung im Argongegenstrom abgenommen. Der erhaltene Rückstand wird mit zweimal 10 ml Ethanol und einmal 10 ml Hexan gewaschen und abschließend zwei Stunden in vacuo getrocknet. Herstellung von Magnetit-Nanopartikeln In einem 250 ml Einhalskolben(mit einem 15 cm langen Hals) werden 706 mg Eisen(III)­acetylacetonat Fe(acac)3 (2 mmol) eingewogen und in 25 ml Triethylenglykol (TREG) gelöst. Mittels eines T-Stücks wird nun die Apparatur 20 Minuten mit Argon gespült undanschließendunter Rührenfür eineStundeauf120-130.Cerhitztund danach 2 hun­ter Rück.uss (ca. 280.C) gekocht. Dabei verfärbt sich die Lösung von rot nach schwarz. 7.2 Vorschriften NachdemBeendenderReaktionlässtmanaufRaumtemperaturabkühlenundlagertdie Suspension über Nacht im Kühlschrank. Zur Aufarbeitung werden 5 ml der schwarzen Suspensionentnommen und mit5 ml einerWaschlösungaus Ethanol und Ethylacetat im Verhältnis 1:2 versetzt. Die erhaltene Suspension wird nun in zwei 3,5 ml Polyallomer­ZentrifugationsgefäßederUltrazentrifugegegebenundanschließend3hbei 55000 U/min zentrifugiert. Dabei setzt sich der schwarze Feststo. vollständig ab und der leicht bräun­liche Überstand kann abgenommen werden. Der erhaltene Feststo. wird noch zweimal mit je 3 ml der Waschlösung gewaschen. Hierbei kann die Abtrennung des Feststo.s mittels einer Biofuge bei 13000 U/min erfolgen. Es wird ein schwarzer, magnetisierbarer Feststo. erhalten. Literatur [1] Stano, P.; Luisi, P. L. Chem. Commun. 2010, 46, 3639–3653. [2] Luisi, P.; Ferri, F.; Stano, P. Naturwissenschaften 2006, 93, 1–13. [3] Gibson, D. G.; et al. Science (Washington, DC, U. S.) 2010, 329, 52–56. [4] http://www.britannica.com/EBchecked/topic-art/342910/92244/ ; 23.07.2010. [5] LoPresti,C.;Lomas,H.;Massignani,M.;Smart,T.;Battaglia,G. J. Mater. Chem. 2009, 19, 3576–3590. [6] Antonietti, M.; Förster, S. Adv. Mater. 2003, 15, 1323–1333. [7] Tanford, C. Science (Washington, DC, U. S.) 1978, 200, 1012–1018. [8] New, R. C. C. Liposomes : a practical approach / edited by R.R.C. New; Oxford; New York : IRL Press, 1990. [9] Grit, M.; Underberg, W. J. M.; Crommelin, D. J. A. J. Pharm. Sci. 1993, 82, 362–366. [10] Israelachvili, J. N.; Marcelja, S.; Horn, R. G. Quart. Rev. Biophys. 1980, 13, 121– 200. [11] Lasic, D. D. Trends Biotechnol. 1998, 16, 307–321. [12] Taupitz, M.; Schmitz, S.; Hamm, B. Fortschr. Röntgenstr. 2003, 175, 752–765. [13] Park, J.; Joo, J.; Kwon, S.; Jang, Y.; Hyeon, T. Angew. Chem. 2007, 119, 4714– 4745. [14] Brusentsov, N. A.; Baiburtskii, F. S.; Tarasov, V. V.; Komissarova, L. K.; Filippov, V. I. Pharm. Chem. J. 2002, 36, 197–205. [15] Szoka, F.; Papahadjopoulos, D. Annu. Rev. Biophys. Bioeng. 1980, 9, 467–508. [16] Zhang, L.; Eisenberg, A. Science (Washington, DC, U. S.) 1995, 268, 1728–1731. [17] Noireaux, V.; Libchaber, A. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2004, 101, 17669– 17674. Literatur [18] Vassiltsova, O.; Chuvilin, A.; Parmon, V. J. Photochem. Photobiol. A 1999, 125, 127–134. [19] Igumenova, T.; Vasil’tsova, O.; Parmon, V. J. Photochem. Photobiol. A 1996, 94, 205–213. [20] Khramov, M. I.; Parmon, V. N. J. Photochem. Photobiol. A 1993, 71, 279–284. [21] Kennedy, M. T.; Korgel, B. A.; Monbouquette, H. G.; Zasadzinski, J. A. Chem. Mater. 1998, 10, 2116–2119. [22] Korgel, B. A.; Monbouquette, H. G. J. Phys. Chem. 1996, 100, 346–351. [23] Bóta, A.; Varga, Z.; Goerigk, G. J. Phys. Chem. B 2007, 111, 1911–1915. [24] Summers, D.; Noveron, J.; Basa, R. Orig. Life. Evol. Biosph. 2009, 39, 127–140. [25] Rauchfuß, H. Chemische Evolution und der Ursprung des Lebens; Springer Berlin Heidelberg, 2005. [26] Alpermann, T.; Weigand, W. Encyclopedia of Time; Birx, H. J., Ed.; Sage, Thou­sand Oaks, California, USA, 2008; Chapter Evolution, Chemical, 455–464. [27] Tian, F.; Toon, O. B.; Pavlov, A. A.; De Sterck, H. Science (Washington, DC, U. S.) 2005, 308, 1014–1017. [28] Ball, P. Nature 2006, 442, 500–502. [29] Miller, S. Science (Washington, DC, U. S.) 1953, 117, 528–529. [30] Shapiro, R. Origins; Penguin Books, London, 1988. [31] Joyce, G. F. Nature 2002, 418, 214–221. [32] Pascal, R.; Boiteau, L.; Forterre, P.; Gargaud, M.; Lazcano, A.; Lopez-Garcia, P.; Maurel, M.-C.; Moreira, D.; Pereto, J.; Prieur, D.; Reisse, J. Earth Moon Planets 2006, 98, 153–203. [33] Monnard, P.-A.; Apel, C. L.; Kanavarioti, A.; Deamer, D. W. Astrobiology 2002, 2, 139–152. [34] Monnard, P.-A.; Szostak, J. W. J. Inorg. Biochem. 2008, 102, 1104–1111. [35] Cairns-Smith, A. G.; Hall, A. J.; Russell, M. J. Orig. Life. Evol. Biosph. 1992, 22, 161–80. [36] Hazen, R. Elements 2005, 1, 135–137. [37] Hanczyc, M.; Mansy, S.; Szostak, J. Orig. Life. Evol. Biosph. 2007, 37, 67–82. [38] Rees, D. C.; Howard, J. B. Science (Washington, DC, U. S.) 2003, 300, 929–931. [39] Russell, M.; Daniel, R.; Hall, A.; Sherringham, J. J. Mol. Evol. 1994, 39, 231–243. [40] Martin, W.; Russell, M. J. Philos. Trans. R. Soc. London B 2007, 362, 1887–1926. [41] Kelley, D. S.; Karson, J. A.; Blackman, D. K.; Früh-Green, G. L.; Butter.eld, D. A.; Lilley, M. D.; Olson, E. J.; Schrenk, M. O.; Roe, K. K.; Lebon, G. T.; Rivizzigno, P. Nature 2001, 412, 145–149. [42] Russell, M.; Hall, A. J. Geol. Soc. London 1997, 154, 377–402. [43] Wächtershäuser, G. Microbiol. Rev. 1988, 52, 452–484. [44] Wächtershäuser, G. Chem. Biodivers. 2007, 4, 584–602. [45] Wächtershäuser, G. Progr. Biophys. Mol. Biol. 1992, 58, 85–201. [46] Huber, C.; Wächtershäuser, G. Science (Washington, DC, U. S.) 2006, 314, 630– 632. [47] Heinen, W.; Lauwers, A. M. Orig. Life. Evol. Biosph. 1996, 26, 131–150. [48] Huber, C.; Wächtershäuser, G. Science (Washington, DC, U. S.) 1997, 276, 245– 247. [49] Dörr, M.; Käßbohrer, J.; Gronert, R.; Kreisel, G.; Brand, W.; Werner, R.; Geil­mann, H.; Apfel, C.; Robl, C.; Weigand, W. Angew. Chem. Int. Ed 2003, 42, 1540–1543. [50] Drobner, E.; Huber, H.; Wächtershäuser, G.; Rose, D.; Stetter, K. O. Nature (Lon­don) 1990, 346, 742–744. [51] Bloechl, E.; Keller, M.; Wächtershäuser, G.; Stetter, K. O. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1992, 89, 8117–8120. Literatur [52] Cody, G. D.; Boctor, N. Z.; Filley, T. R.; Hazen, R. M.; Scott, J. H.; Sharma, A.; Yoder, J., Hatten S. Science (Washington, DC, U. S.) 2000, 289, 1337–1340. [53] Alpermann, T.; Rüdel, K.; Rüger, R.; Steiniger, F.; Nietzsche, S.; Förster, S.; Fahr, A.; Weigand, W. Orig. Life Evol. Biosph. 2010; DOI: 10.1007/s11084-010-9223-0. [54] Bigg, G. R. Chemistry in the Marine Environment -Issues in Environmental Science and Technology No. 13; Hester, R. E.; Harrison, R. M., Eds.; The Royal Society of Chemistry, 2000; Chapter The Oceans and Climate, 13–32. [55] Mann, S.; Hannington, J. P.; Williams, R. J. P. Nature 1986, 324, 565–567. [56] Nawroth,T.;Rusp,M.;May,R.P. Physica B (Amsterdam) 2004, 350,E635–E638. [57] Ismailova, G.; Efremenko, V.; Kuregyan, A. Pharm. Chem. J. 2005, 39, 385–387. [58] Li, S.-Y.; Guo, Y.; Aslam, M.; Fu, L.; Dravid, V. Microsc. Microanal. 2003, 9, 206–207. [59] Mann, S.; Hannington, J. P. J. Colloid Interface Sci. 1988, 122, 326–335. [60] Sangregorio, C.; Wiemann, J. K.; O’Connor, C. J.; Rosenzweig, Z. J. Appl. Phys. 1999, 85, 5699–5701. [61] Mann, S. Inorganic Materials; Bruce, D. W.; O’Hare, D., Eds.; John Wiley & Sons Ltd, Chichester, England, 1996; Chapter Biogenic Inorganic Materials, 255–311. [62] Dörr,M.;Alpermann,T.;Weigand,W. Orig. Life Evol. Biosph.2007, 37,329–333. [63] Jander, G.; Blasius, E. Lehrbuch der analytischen und präparativen Chemie, 14th ed.; Strähle, J.; Schweda, E., Eds.; S. Hirzel, 1995. [64] Suwalsky, M.; Martínez, F.; Cárdenas, H.; Grzyb, J.; Strzalka, K. Chem. Phys. Lipids 2005, 134, 69–77. [65] Xia, S.; Xu, S. Food Res. Int. 2005, 38, 289–296. [66] Kosaraju, S. L.; Tran, C.; Lawrence, A. J. Liposome Res. 2006, 16, 347–358. [67] Ley, H.; Schwarte, C.; Münnich, O. Ber. dt. chem. Ges. 1924, 57, 349–356. [68] Sanyal, G. S.; Mookherjea, S. Z. Anal. Chem. 1975, 276, 71. [69] Chapman,R. L.;Stephens,F.S.;Vagg,R.S. Inorg. Chim. Acta 1977, 26,241–250. [70] Gao, S.; Ma, B.-Q.; Yi, T.; Wang, Z.-M.; Liao, C.-S.; Yan, C.-H.; Xu, G.-X. Chem. Lett. 1999, 28, 773–774. [71] Garribba, E.; Micera, G.; Lodyga-Chruscinska, E.; Sanna, D. Eur. J. Inorg. Chem. 2006, 2006, 2690–2700. [72] Jäger,E.-G.;Schöne,K.;Werner,G. Lehrwerk Chemie -Arbeitsbuch 5 -Elektrolyt­gleichgewichte und Elektrochemie; VEB Deutscher Verlag für Grundsto.ndustrie, 1982. [73] Szoka, F.; Papahadjopoulos, D. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1978, 75, 4194– 4198. [74] Schubert, R.; Wolburg, H.; Schmidt, K.-H.; Roth, H. J. Chem. Phys. Lipids 1991, 58, 121–129. [75] Roseman, M. A.; Lentz, B. R.; Sears, B.; Gibbes, D.; Thompson, T. E. Chemistry and Physics of Lipids 1978, 21, 205–222. [76] Torchilin, V. P.; Weissig, V. Liposomes: A Practical Approach; Oxford University Press, 2003. [77] Mathai, J. C.; Missner, A.; Kügler, P.; Saparov, S. M.; Zeidel, M. L.; Lee, J. K.; Pohl, P. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2009, 106, 16633–16638. [78] Schullery, S.; Garzaniti, J. Chem. Phys. Lipids 1974, 12, 75–95. [79] Cuyper, M.; Joniau, M. Eur. Biophys. J. 1988, 15, 311–319. [80] Sabaté, R.; Barnadas-Rodríguez, R.; Callejas-Fernández, J.; Hidalgo-Álvarez, R.; Estelrich, J. Int. J. Pharm. 2008, 347, 156–162. [81] Faure, C.; Meyre, M.-E.; Trepout, S.; Lambert, O.; Lebraud, E. J. Phys. Chem. B 2009, 113, 8552–8559. [82] Krack, M.; Hohenberg, H.; Kornowski, A.; Lindner, P.; Weller, H.; Förster, S. J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 7315–7320. Literatur [83] Holleman, A. F.; Wiberg, E.; N., W. Lehrbuch der anorganischen Chemie, 101st ed.; de Gruyter: Berlin, 1995. [84] Rickard, D.; Luther, G. W. Chem. Rev. 2007, 107, 514–562. [85] Li, Y.; van Santen, R.; Weber, T. J. Solid State Chem. 2008, 181, 3151–3162. [86] Goldstein, J. I. Scanning electron microscopy and X-ray microanalysis, 3rd ed.; Kluwer Academic/Plenum Publishers: New York, 2003. [87] Huber, C.; Eisenreich, W.; Hecht, S.; Waechtershaeuser, G. Science (Washington, DC, U. S.) 2003, 301, 938–940. [88] Dai, Z.; Liu, S.; Bao, J.; Ju, H. Chem. -Eur. J. 2009, 15, 4321–4326. [89] Baird, T.; Campbell, K. C.; Holliman, P. J.; Hoyle, R.; Stirling, D.; Williams, B. P. J . Chem. Soc., Faraday Trans. 1996, 92, 445–450. [90] Li, L.; Moore, P. Trends Pharmacol. Sci. 2008, 29, 84–90. [91] Butler, E. A.; Peters, D. G.; Swift, E. H. Anal. Chem. 1958, 30, 1379–1383. [92] Rosário, F. D.; Louvisse, A. M. T.; Saraiva, S. M.; González, G.; Oliveira, J. F. D. J. Coll. Interf. Sci. 1996, 181, 1–10. [93] Li, Y.; Huang, F.; Li, Z.; Zhang, Q.; Gu, Z. J. Mater. Sci. Lett. 1999, 18, 1821– 1823. [94] Binder, W. H.; Sachsenhofer, R.; Farnik, D.; Blaas, D. Phys. Chem. Chem. Phys. 2007, 9, 6435–6441. [95] Lecommandoux, S.; Sandre, O.; Chécot, F.; Rodriguez-Hernandez, J.; Perzynski, R. J. Magn. Magn. Mater. 2006, 300, 71–74. [96] Lecommandoux, S.; Sandre, O.; Chécot, F.; Rodriguez-Hernandez, J.; Perzynski, R. Adv. Mater. 2005, 17, 712–718. [97] Berger,P.;Adelman,N.B.;Beckman,K.J.;Campbell,D.J.;Ellis,A.B.;Lisensky, G. C. J. Chem. Educ. 1999, 76, 943–948. [98] Maity, D.; Ding, J.; Xue, J.-M. Int. J. Nanosci. 2009, 8, 65–69. [99] Wan, J.; Cai, W.; Meng, X.; Liu, E. Chem. Commun. 2007, 5004–5006. [100] Bebie, J.; Schoonen, M.; Fuhrmann, M.; Strongin, D. Geochim. Cosmochim. Acta 1998, 62, 633–642. [101] Sandell, E. B. Colorimetric Analysis of Traces of Metals; Interscience Publishers, Inc.: New York, 1959. [102] Fries, J. Spurenanalyse -Erprobte photometrische Methoden; E. Merck AG: Darm­stadt, 1966. [103] Yu, W.; Pei, J.; Huang, W.; Zhao, G. Mater. Chem. Phys. 1997, 49, 87–92. [104] Henglein, A. Chem. Rev. 1989, 89, 1861–1873. [105] Spanhel, L.; Haase, M.; Weller, H.; Henglein, A. J. Am. Chem. Soc. 1987, 109, 5649–5655. [106] Li, C.; Cui, J.; Li, Y.; Wang, C.; Li, Y.; Zhang, L.; Zhang, L.; Guo, W.; Wang, J.; Zhang, H.; Hao, Y.; Wang, Y. Eur. J. Pharm. Sci. 2008, 34, 333–344. [107] Spiese, C. E.; Kieber, D. J.; Nomura, C. T. Limnol. Oceanogr. 2009, 54, 560–570. [108] Charlson, R. J.; Lovelock, J. E.; Andreae, M. O.; Warren, S. G. Nature 1987, 326, 655–661. [109] Rickard, D. Geochim. Cosmochim. Acta 1997, 61, 115–134. [110] Rickard, D.; Gri.th, A.; Oldroyd, A.; Butler, I.; Lopez-Capel, E.; Manning, D.; Apperley, D. Chem. Geol. 2006, 235, 286–298. [111] Vaughan, D. J.; Lennie, A. R. Science Progr. (St. Albans, United Kingdom) 1991, 75, 371–88. [112] Wincott, P. L.; Vaughan, D. J. Rev. Miner. Geochem. 2006, 61, 181–229. [113] Rickard, D.; Luther, G. Geochim. Cosmochim. Acta 1997, 61, 135–147. [114] Park, S.-W.; Kim, S.-K.; Kim, J.-B.; Choi, S.-W.; Inyang, H. I.; Tokunaga, S. Water, Air, Soil Pollut.: Focus 2006, 6, 97–110. Literatur [115] Morse, J. W.; Millero, F. J.; Cornwell, J. C.; Rickard, D. Earth-Sci. Rev. 1987, 24, 1–42. [116] Wei, D.; Osseo-Asare, K. Colloids Surf. A 1997, 121, 27–36. [117] Schoonen, M. A. A.; Barnes, H. L. Geochim. Cosmochim. Acta 1991, 55, 1505– 1514. [118] Taylor, P.; Rummery, T.; Owen, D. Journal of Inorganic and Nuclear Chemistry 1979, 41, 1683–1687. [119] Butler, I. B.; Rickard, D. Geochim. Cosmochim. Acta 2000, 64, 2665–2672. [120] Can.eld, D. E.; Raiswell, R.; Westrich, J. T.; Reaves, C. M.; Berner, R. A. Chem. Geol. 1986, 54, 149–155. [121] Wood, P. M. FEBS Lett. 1981, 124, 11–14. [122] McNamara, J. P.; Hillier, I. H.; Bhachu, T. S.; Garner, C. D. Dalton Trans. 2005, 3572–3579. [123] Hille, R. Chem. Rev. 1996, 96, 2757–2816; PMID: 11848841. [124] Riddick, J. A.; Bunger, W. B.; Sakano, T. K. Organic Solvents, Fourth Edition; John Wiley & Sons, New York, 1986. [125] Mehmet, Y.; Hyne, J. B. Phosphorus, Sulfur Silicon Relat. Elem. 1976, 1, 47–54. [126] Becker, H.; Berckert, R.; Domschke, G.; Fanghänel, E.; Habicher, W.; Metz, P.; Pavel, D.; Schwetlick, K. Organikum; Wiley-VCH Verlag, Weinheim, 2001. Danksagung • Prof. Dr. W. Weigand danke ich für die außergewöhnliche und spannende Aufga­benstellung, sein stetiges großes Interesse, die vielen Anregungen und Ideen sowie seine vielfältige Unterstützung, die zum Gelingen der Arbeit beigetragen haben. • Prof. Dr. A. Fahr danke ich für die Anfertigung des Zweitgutachtens sowie die vielen anregenden Diskussionen und hilfreichen Hinweise im Verlauf der Doktor­arbeit. • Kristin Rüdel danke ich für die langjährige, sehr gute Zusammenarbeit am ge­meinsamen Projekt, die vielen Diskussionen und Ermutigungen. Ebenfalls dan­ke ich ihr für die Durchführung der Membranstabilitätsexperimente und DSC-Untersuchungen sowie die Unterstützung bei den PCS-Messungen. • Dr. Ronny Rüger danke ich für die kritische Begleitung der Untersuchungen, seine kreativen Ideen und hilfreichen Hinweise, für die Bereitstellung der Abb. 28 sowie für die Unterstützung bei den Untersuchungen zu magnetophoretischen Vesikeln. • Prof. Dr. P.-L. Luisi und dottore Pasquale Stano danke ich für die herzliche Auf­nahme und die intensive Betreuung während meines Forschungsaufenthalts an der Universität Roma Tre sowie für viele spätere fruchtbare Diskussionen. • Meiner ehemaligen Masterstudentin Zheqiong Qi danke ich für die Durchführung der Experimente zu Cd-und Cu-haltigen Polymersomen sowie für die Unterstüt­zung bei den Untersuchungen zur Reduktion von DMSO. • Meinen ehemaligen AC V-Praktikanten Nico Überschaar, Helena Krug und Peter Schneider sowie Matthias Köhler (studentische Hilfskraft) bin ich für ihr Engage­mentundihreUnterstützungbeiverschiedenen TeilprojektenzuDankverp.ichtet. • Prof. Dr. S. Förster und Dr. Volkan Filiz von der Universität Hamburg danke ich für die Bereitstellung des 1,2-Polybutadien-polyethylen-block-Copolymers und für wertvolle Hinweise. • Allen Mitgliedern der Arbeitsgruppe Weigand danke ich für die vielen Gespräche, Anregungen und die angenehme Arbeitsatmosphäre. • Dr. Sandor Nietzsche und besonders Frank Steiniger danke ich für die Durchfüh­rung vieler elektronenmikroskopischer Untersuchungen und hilfreiche Anregungen. • Dr. Wolfgang Poppitz danke ich für die Mithilfe bei der Methodenentwicklung für die Analyse der DMSO-Experimente sowie für die Unterstützung bei GC-, MS-sowie IR-Untersuchungen. • Kristin Schäfer und Susanne Spangenberg danke ich für die Durchführung der FAAS-Untersuchungen. • Frau C. Apfel danke ich für die Durchführung der Röntgenpulverdi.raktometrie sowie Dr. Jochen Schmitt für die BET-Untersuchungen. • Dem Evangelischen Studienwerk Villigst dankeichfürdie.nanzielleUnterstützung im Rahmen eines Promotionsstipendiums sowie die anregenden und horizonterwei­ternden Bildungsangebote. Der Studienstiftung des deutschen Volkes danke ich für die ideelle Förderung während meiner Doktorarbeit. • Antje, meiner Familie und meinen Freunden danke ich herzlich für die Begleitung und Unterstützung in den zurückliegenden Jahren, ohne die diese Arbeit nicht möglich gewesen wäre. ANHANG Eigene wissenschaftliche Verö.entlichungen Publikationen 1. Schubert, K.; Alpermann, T.; Niksch, T.; Görls, H.; Weigand, W. Synthese und Charakterisierung funktionalisierter ß-Hydroxydithiozimtsäuren und deren Ester. Komplexchemisches Verhalten gegenüber Nickel(II), Palladium(II) und Platin(II). Z. Anorg. Allg. Chem. 2006, 632, 1033-1042. 2. Alpermann, T.; Holmlid, L. Confocal laser microspectroscopic Rabi-.opping study of an iron oxide emitter surface used for Rydberg matter generation.Spectrochimica Acta Part A 2007, 67, 877-885. 3. Dörr, M.; Alpermann, T.; Weigand, W. The FeS / H2S System as a Possible Primordial Source of Redox Energy. Orig. Life Evol. Biosph. 2007, 37, 329-333. 4. Alpermann,T.;Weigand,W. Encyclopedia of Time;Birx,H. J.,Hrsg.;Sage,Thou­sand Oaks, California, USA, 2008; Kapitel Evolution, Chemical, 455-464. 5. Apfel, U.-P.; Rudolph, M.; Apfel, C.; Robl, C.; Langenegger, D.; Hoyer, D.; Jaun, B.; Ebert,M.-O.; Alpermann,T.; Seebach, D.; Weigand,W. Reaction of Fe3(CO)12 with octreotide -chemical, electrochemical and biological investigations. Dalton Trans. 2010, 39, 3065-3071. 6. Alpermann, T; Rüdel, K.; Rüger, R.; Knoep.er, N.; Fahr, A.; Weigand, W. Work­shop Open Questions about the Origin of Life 2009; On Question 3: Heterotrophic Versus Autotrophic Scenarios. Orig. Life Evol. Biosph. 2010, 40, 402-406. 7. Alpermann, T; Rüdel, K.; Rüger, R.; Steiniger, F.; Nietzsche, S.; Filiz, V.; Förster, S.; Fahr, A.; Weigand, W. Polymersomes containing iron sul.de (FeS) as primor­dial cell model. Orig. Life Evol. Biosph. 2011, 41, 103-119. Poster 1. Alpermann, T; Rüdel, K.; Rüger, R.; Steiniger, F.; Nietzsche, S.; Fahr, A.; Wei­gand, W. SYNTHCELLS -Investigation of a Polymersome Based Prebiotic Cell Model. auf der Jahrestagung der DPhG 2009, Jena, 28. September -01. Oktober 2009 ANHANG Vorträge 1. Alpermann, T.; Rüdel, K.; Fahr, A.; Weigand, W. Constructing Models of Possible First Primitive Cells. im Rahmen von Organometallic Complexes of Sulphur or Selenium Ligands: Jena-Irbid Relationship, Irbid (Jordanien), 6.-8. Oktober 2008 2. Alpermann, T. Modellierung möglicher primordialer Protozellen. beim 7. Mittel­deutschen Anorganiker-Nachwuchs Symposium, Chemnitz, 23. September 2009 Selbständigkeitserklärung Ich erkläre, dass ich die vorliegende Arbeit selbständig und unter Verwendung der an­gegebenen Hilfsmittel, persönlichen Mitteilungen und Quellen angefertigt habe. Hannover, den 18.05.2012 ................................ Theodor Alpermann ANHANG Supplement Abb. 70 ANHANG